Metabolitlerdeki Soruşturma MALDI-Kütle Spektrometrik Görüntüleme Medicago truncatula Kök Nodüller

Bu prosedürün genel amacı, bitki kök dokusundaki küçük moleküllerin güvenilir, çok kütleli spektrometrik görüntülemesini gerçekleştirmektir. Bu, önce doku örneklerinin uygun boyuta hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, maldi matrisini doku örneğine optimize etmek ve uygulamaktır.

Daha sonra, numune Maldi'ye tabi tutulur, MSI ve Spectra doku boyunca toplanır. Son adım, biyolojik olarak önemli analitlerin tanımlanabildiği veri işlemedir. Sonuç olarak, MALDI MSI, baklagil kök nodüllerinde bulunan endojen metabolitleri tespit etmek için kullanılır.

Bu yöntem, bitki kök dokusunda bulunan metabolitler hakkında bilgi sağlayabilir, ancak aynı zamanda memeliler, kabuklu böcekler ve daha fazlası dahil olmak üzere diğer model sistemlerden küçük moleküllerin ve dokuların incelenmesine de uygulanabilir. İlk olarak, önceden hazırlanmış bitki doku örneklerini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın. Daha sonra plastik kriyostat kabını kesin ve fazla jelatini kesin, gömülü dokuyu, OCT'nin dokuya temas etmesine izin vermeden, kuruş büyüklüğünde bir optimum kesme sıcaklığına veya OCT ortamına sahip bir kriyostat aynasına monte edin.

Kriyostat mandrenini, OCT katılaşana kadar eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat kutusuna yerleştirin. Mandren ve jelatinin kriyostat kutusunda yaklaşık 15 dakika AC dengesine izin verdikten sonra, dokuyu yaklaşık bir hücrenin kalınlığına kadar bölümlere ayırmak için kriyostatı kullanın. Ardından, sürgünün kaplanmamış tarafını elinizin arkasında ısıtarak her bir dilimi önceden soğutulmuş cam sürgünün üzerine başparmağınızla monte edin.

Daha sonra, sıcak slaytın ITO kaplı tarafını donmuş doku diliminin yanına yerleştirin ve MALDI matrisinin airbrush uygulaması için dilimin slayta yapışmasına izin verin. Airbrush solüsyon kabını ve nozulu metanol ile iyice temizleyin ve solüsyon kabını DHB matris solüsyonu ile doldurun. Airbrush'ı numuneden yaklaşık 35 santimetre uzakta tutun ve her kat arasında 10 saniye püskürtme ve 30 saniye kuruma süresi ile slaytın yüzeyine 10 ila 15 kat matris uygulayın.

Bittiğinde, tıkanmayı önlemek için hava fırçasını metanol ile iyice temizleyin Matris çözeltisi nedeniyle, hava fırçaları daha kolay temin edilebilirken, otomatik matris püskürtücü sistemlerinin genellikle maldi Matrixx'in süblimasyon uygulaması için daha eşit ve tekrarlanabilir matris kapsamı ürettiğini ve süblimasyon odasının dibine 300 miligram DHB ağırlığını koyduğunu belirtmek önemlidir. Cam slaytı, çift taraflı iletken bant ile doku bölümleri aşağı bakacak şekilde soğuk parmağa yapıştırın. Çok büyükse slaydı kesin.

Süblimasyon odası için, süblimasyon odasının üst ve alt yarısını C kelepçesi ile birlikte sıkıştırın. Ardından süblimasyon odasını oda sıcaklığında bir ısıtma mantosuna yerleştirin. Vakumu bağlayın ve üst hazneye soğuk suda buz ekleyin.

Vakum pompası açıldıktan sonra 15 dakika bekleyin ve ısıtma mantosunu açın. 10 dakika sonra ısıyı kapatın, vakuma giden vanayı kapatın ve vakum pompasını kapatın. Hazne oda sıcaklığına soğuduktan sonra, vakum basıncını serbest bırakan valfi açın ve numuneyi çıkarın.

Ardından, öğretme noktaları olarak kullanılacak düzeltme sıvısı kalemi ile numunenin her köşesinde bir artı deseni işaretleyin. Cam slaytı Maldi sürgülü adaptör plakasına yerleştirin ve bir tarayıcı kullanarak numunenin optik görüntüsünü alın. Bilgisayardaki görüntüyü kontrol edin ve resmi ekranda görünecek şekilde döndürün.

Aynı yönde, numune cihaza yerleştirilecektir. Cihaz şirketi tarafından sağlanan yazılımı kullanarak, 50 mikrometrelik raster adım boyutuna ve raster adım boyutu gözlerine eşit veya daha küçük bir lazer çapına sahip bir görüntü elde etme dosyası oluşturun. Bu noktada, optik görüntüyü yazılıma yükleyin ve plakayı optik görüntü ile hizalayın.

Cihazı kalibre ettikten sonra, slayt üzerinde boşluk olarak kullanılacak bir saf matris noktası da dahil olmak üzere MSI ile analiz edilecek doku alanlarını belirtin. Bunu takiben, veri alımından sonra edinime başlayın, satıcı tarafından sağlanan yazılımda görüntüleme dosyasını açın ve kütle spektrumundan ilgilenilen belirli bir kütle / yük oranını seçerek iyon görüntülerini çıkarın. Yazılımı kullanarak, daha fazla tanımlama için ilgilenilen belirli analitlerin bir listesini oluşturun.

Hedeflenen analitler için varsayılan tanımlamaları belirlemek için doğru toplu veritabanı araması yapın. Doğru kütle veritabanı aramasından varsayılan tanımlamaları doğrulamak için ms. Hedeflenen analitlerden msms spektrumlarına, standartların, literatürün ve/veya parçalanma tahmin yazılımının spektrumlarına burada gösterilen bir mego Tula kök nodülü bölümünün optik bir görüntüsüdür.

Burada, sırasıyla airbrush otomatik püskürtücü ve süblimasyon kullanılarak matris kapsamı ve kristal boyutlarının optik bir görüntü örneği verilmiştir. Airbrush uygulama yöntemi irili ufaklı kristaller üretir. Otomatik püskürtücü yöntemi küçük, eşit boyutlu kristaller üretirken, süblimasyon tek bir eşit matris tabakası üretir.

DHB gibi geleneksel matrisler, 500 Dalton'un altındaki düşük kütle aralığında birçok iyon üretir. Bu matris iyonları, bu aralıktaki metabolitlerin tespitine müdahale edebilir. Burada, DHB matrisi ile kaplanmış kök nodül dokusuna kıyasla sadece DHB matrisinin MS spektrumları gösterilmiştir.

Matris pikleri, MS görüntüleri kullanılarak gerçek metabolitlerden ayırt edilebilir. Bir tepe noktasına tıklandığında, iyon görüntüsü çıkarılır ve optik görüntü ile üst üste bindirilerek görüntülenir. Dokuda belirgin lokalizasyona sahip görüntüler oluşturan ve matriste bulunmayan bu tepeler, sadece görüntülenen alan metabolitler olarak kabul edilir, burada gösterilen, kök nodül dokusunda bulunan metabolitlerin birkaç temsili iyon görüntüsüdür.

Matriks ile ilgili piklere karşılık gelen MS görüntülerinin örnekleri burada resmedilmiş olsa da, bu görüntü kök nodül dokusunda belirgin bir lokalizasyon ve görüntülenen sadece matriks alanında sinyal eksikliğini göstermektedir. Bu sinyal çok az lokalizasyon gösterir ve tüm doku üzerinde bulunur. Sinyal, görüntülenen matris alanında da görülür.

Hedeflenmemiş metabolomik deneylerin nihai amacı, biyolojik olarak önemli analitleri tespit etmek ve belirlemek ve ilgilenilen bileşikleri tanımlamaktır. MSI ve LCMS ile tespit edilen metabolitlerden birinin bir örneği burada gösterilmiştir. Bu metabolit, yüksek çözünürlüklü LCMS ve MSM MSS spektrumu ile toplanan doğru kütleye dayalı olarak hem olarak tanımlandı.

Bu MSMS verileri, iki MSM S spektrum eşleşmesi olan Shima ve Sato tarafından daha önce yayınlanan MSM S spektrumları ile karşılaştırıldı. Bu nedenle, 6 1 6 0.2'lik kütle / yük oranının kimliği, literatür Ms.MS verilere kıyasla doğru kütle veritabanı aramasına ve Ms.MS verilerine dayalı olarak güvenle heme olarak atanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli doku tiplerinde ve model sistemlerinde küçük moleküllerin incelenmesine uygulanabilecek bir yöntem kullanarak biyolojik olarak ilgili metabolitlerin uzamsal dağılımını tespit etmek ve haritalamak için maldi, kütle spektrometrik görüntülemenin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.