Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iki protein ve canlı kültürlenmiş hücreler arasındaki etkileşimi gözlemlemektir. Bu, ilgilenilen iki protein için CDNA'ların, memeli hücrelerinde proteinin ekspresyonu için vektörler oluşturmak üzere YFP olarak kısaltılan lusiferaz veya sarı floresan proteini için kaplama dizisini içeren plazmitlere alt klonlanmasıyla elde edilir. İkinci bir adım olarak, plazmitler kültürlenmiş hücrelere transfekte edilir, bu da YFP ve lusiferaz füzyon proteinlerinin ekspresyonuna yol açar.

Daha sonra, lusiferazdan ışık emisyonunu başlatmak için hücrelere lusiferaz substratı eklenir. LUCIFERASEAZ'dan YFP'ye enerji transferine dayalı olarak iki füzyon proteini arasındaki etkileşimi gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin ülke çökeltme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, canlı hücrelerde protein protein etkileşimlerinin gözlemlenmesine izin vermesidir.

Bu Yöntem, bir hastada bulunan bir mutasyonun protein protein etkileşimlerini etkileyip etkilemediğini belirleyerek fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürün ilk adımını göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan RAB tric olacaktır Metin protokolünde açıklandığı gibi plazmitleri oluşturmaya başlamak. 260 nanometredeki absorbansa dayalı olarak konsantrasyonlarını tahmin edin.

Baz çiftlerinin sayısını 650.Dalton ile çarparak her bir plazmitin moleküler kütlesini belirleyin. Her bir plazmit preparatının molar konsantrasyonunu hesaplamak için konsantrasyonu ve moleküler kütleyi kullanın. Plazmit DNA preparatlarını 36 nano molar konsantrasyona seyreltin.

Bunlar, DNA karışımlarını hazırlamak için kullanılacak çalışma stokları olacaktır. Transfeksiyon için. Bu prosedürün en zor yönü, DNA karışımlarının ayarlanmasıdır Başarıyı sağlamak için, her bir bileşenin doğru miktarını önceden hesaplamak için elektronik tablolar oluşturuyoruz ve büyük özen gösteriyoruz.

DN karışımlarını ayarlarken. 1800 nanogram dolgu plazmidi içeren ilk kontrol DNA karışımını 20 mikrolitre su içeren son hacimde hazırlayın. Daha sonra, P görünüm kontrol yapısının beş mikrolitresini hazırlayarak ikinci bir kontrollü DNA karışımı oluşturun.

Toplam DNA kütlesini 1800 nanograma getirmek için dolgu plazmidi ekleyin. Son hacmi 20 mikrolitreye çıkarmak için su ekleyin. Beş mikrolitre P look kontrol yapısı ve beş mikrolitre PYFP kontrol yapısı içeren üçüncü bir kontrol DNA karışımı hazırlayın.

Daha önce olduğu gibi dolgu plazmidi ve su ekleyin. Son olarak, pozitif kontrol yapısının beş mikrolitresini içeren dördüncü bir kontrol DNA karışımı oluşturun. Yine aynı şekilde dolgu, plazmit ve su ekleyin.

Daha sonra, ilgilenilen x proteininin homodimerizasyonunu test etmek için 3D NA karışımları hazırlayın. Her DNA karışımı için, dolgu plazmidi ve su ekleyerek ilgili P görünüm yapısının beş mikrolitresini ve PYFP yapısının beş mikrolitresini birleştirin. Daha sonra, X ve Y'yi ilgilendiren bir çift protein arasındaki etkileşimi test etmek için DNA karışımları hazırlayın.Her DNA karışımı için, ilgili P görünüm yapısının beş mikrolitresini ve PYFP yapısının beş mikrolitresini dolgu plazmidi ve su hasadı ile birleştirin 75 santimetrelik bir şişeden alt birleşen hec 2 9 3 hücreleri toplam hücrelerin% 10'unu 13 mililitre kültür ortamına seyreltin.

Daha sonra, hücreleri 24 saat boyunca kültürlemeden önce beyaz, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 130 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. Daha sonra, DNA karışımlarının sayısını üç ile çarparak transfekte edilecek kuyu sayısını hesaplayın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmeden önce girdap ile karıştırılmış kuyu başına 6.3 mikrolitre oda sıcaklığı, serumsuz ortam ve 0.18 mikrolitre transfeksiyon reaktifi içeren bir ana karışım hazırlayın.

Daha sonra 20 mikrolitre serum serbest orta transfeksiyon reaktifi ana karışımı gerekli sayıda tüpe dağıtılır. Her tüpe karşılık gelen DNA karışımından iki mikrolitre ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Son olarak, her bir transfeksiyon karışımı ile üç kuyuyu transfekte edin.

Hücreleri 36 ila 48 saat daha kültürlemeden önce kuyu başına 6.5 mikrolitre transfeksiyon karışımı dağıtmak. BRET sinyalini ölçmek için. İlk olarak, canlı hücre lusiferaz substratını DMSO'da mililitre başına 34 miligramda vorteksleme ile çözün.

Sulandırılmış canlı hücre lusiferaz substratını, substrat seyreltme ortamında 37 santigrat derece önceden ısıtın, bir ila 1000 arasında seyreltin. Kuyu girdabı başına 50 mikrolitre substrat seyreltme ortamının karışmasına izin verin. Bir çökelti oluşabilir, ancak tahlille etkileşime girmez.

Kültür ortamını 96 oyuklu plakadan aspire edin, hücreleri en az iki saat kültürledikten sonra her bir oyuğa 50 mikrolitre seyreltilmiş canlı hücre lusiferaz substratı dağıtın. Kapağı 96 oyuklu plakadan çıkarın ve plakayı luminometrenin içindeki oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. LUCIFERASE ve YFP'den gelen emisyonu metin protokolündeki ayrıntılara göre her seferinde bir kuyu ölçün, emisyon sinyallerini 10 saniye boyunca entegre edin.

Fox P transkripsiyonel baskılayıcı ailesinin üyeleri beyin gelişiminde rol oynar. Mutasyonlar konuşma ve otizm spektrum bozukluklarında rol oynamaktadır. FOX P ikinin, Fox'un tespiti için Brett testini doğrulamak için homodimerler oluşturduğu bilinmektedir.

P iki Homodimer hücresi, verici olarak lusiferaz veya alıcı olarak YFP'nin Fox P iki veya bir nükleer lokalizasyon sinyaline kaynaşmış olarak ekspresyonu için yapılarla transfekte edildi. Nükleer hedefli LUCIFERASE ve YFP proteinleri, bir Brett'in tespiti için pozitif bir kontrol olarak negatif kontroller olarak hizmet eder. Sinyal hücreleri ayrıca bir lusiferaz YFP füzyon proteininin ekspresyonu için bir yapı ile transfekte edildi.

BRET sinyalindeki artış, Bret testinin Fox P'yi tespit etmede etkili olduğunu göstermektedir: iki homodimer, bir nükleer lokalizasyon sinyaline kaynaşmış YFP ile transfekte edilmiş hücrelerin floresan mikroskobu görüntüleri veya FOX P'ye kaynaşmış YFP ile iki burada gösterilmektedir. Etkileşimin özgüllüğü, dimerizasyonu bozduğu bilinen FOX P iki'ye bir mutasyon eklenerek gösterildi. Lusiferaz Fox P, iki delta E 400 ve YFP Fox B olmak üzere iki füzyon proteini birlikte eksprese edildiğinde.

Fox B iki ve YFP Fox B iki'nin birlikte eksprese edildiği zamana kıyasla nefes sinyalinde bir azalma gözlendi. Bu sinyal azalması, Bret testinin tipik etkileşimleri tespit etmedeki etkinliğini değerlendirmek için mutant proteinin hücre altı lokalizasyonundaki bir değişiklikten kaynaklanmadı, Fox P ikisinin Fox P bir ile etkileşimi test edildi, Testin her iki olası konfigürasyonunda bir Brett sinyali gözlendi. Ek olarak, Brett testinin uygunluğu veya Fox P iki'nin FOX P olmayan proteinlerle etkileşimini tespit etme, bir transkripsiyonel kobaskılayıcı ve bilinen Fox P iki etkileşim ortağı olan CT BP one ile etkileşimin incelenmesiyle test edildi.

Fox P iki CT BP bir etkileşimi, Fox P iki donör füzyon proteini ve CT P bir alıcı olduğunda, ancak ters konfigürasyonda değilken Brett testi ile tespit edildi. FOX P iki ve BT P bir arasındaki etkileşim, CT BP bir'in sadece küçük bir kısmı çekirdeğe lokalize olmasına rağmen gözlendi ve bu testin duyarlılığını vurguladı. Son olarak, Fox P iki'deki patojenik mutasyonların protein protein etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek için Bret testi kullanıldı.

Fox P ikideki iki nokta mutasyonunun, konuşma ve dili etkileyen nadir bir otozomal dominant bozukluğa neden olduğu bildirilmiştir. Mutant proteinlerin yabani tip tilki P iki ile dimerize olma yeteneği, BRET testi kullanılarak değerlendirildi. R 3 28 X, ancak R 5 53 H mutasyonu değil, donör olarak vahşi tip Fox B iki ve mutant Fox B iki kullanarak sonuçların dimerizasyonunu bozar.

Kabul eden gösterildiğinde, ters konfigürasyon için de aynı sonuçlar gözlendi. Bu videoyu izledikten sonra, protein protein etkileşimlerini izlemek için ekmek tahlilinin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu prosedürü takiben, gözlemlenen bir protein protein etkileşiminin fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için ilgilendiğiniz proteinin aktivitesini analiz etmek için ek teknikler uygulanabilir.