Name: Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde protein-protein etkileşimlerini BRET tekniği ile gerçek zamanlı izlemeyi. Bu yöntem, patojenik mutasyonların etkilerini değerlendirmek ve hücresel süreçleri anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Max Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.

Plazmitlerin 1. Yaratılış <ol><li> (Şekil 1), standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, iki pLuc ve pYFP vektörlere ilgi her protein için cDNA&#39;lar alt-klonlanmıştır. Detaylı protokollerin Yeşil ve arkadaşları 13 bkz. </li><li> Sıra tüm ilgi duyulan proteinlerin herhangi bir araya giren durdurma kodonları ile Luc / YFP sekansı ile çerçeve içinde olduğunu doğrulamak için oluşturur. </li><li> Füzyon proteinleri biyolojik etkinliğini korumak olduğunu teyit etmek için arzu edildiği gibi fonksiyonel deneylerde yapın. Burada yer alan durumunda YFP füzyon proteinlerin hücre içi lokalizasyonu floresan mikroskobu ile tespit edildi. </li><li> PLuc ve pYFP ekspresyon vektörleri içine uygun hedefleme sinyalleri mühendislik tarafından uygun Luc ve YFP kontrol proteinleri için sentezleme plasmidleri olun. Burada yer alan durumunda, pLuc ve pYFP vektörlere bir nükleer lokalizasyon sinyali sokulmasıyla nükleer hedefli Luc ve YFP yapıları oluşturur. </li><li> YapmakLuc ve YFP tek polipeptid halinde birleşmiş olduğu bir pozitif kontrol yapısı. Burada yer alan durumunda, YFP kodlama dizisi pLuc vektör içine sokulduğu bir pozitif kontrol üretir. </li><li> Transfeksiyon karışımları DNA kütlesini eşitlemek için kullanılacak nötr dolgu plazmid seçin. Herhangi bir ökariyotik promoter içeren bir plazmid kullanarak ve bu nedenle, bir bakteri klonlama vektörü gibi memeli hücrelerinde transkripsiyonel olarak etkin olacaktır. </li></ol> DNA karışımlar 2. Hazırlanması <ol><li> 260 nm&#39;de absorbans göre Bölüm 1 &#39;de tarif edilen tüm plasmidlerin konsantrasyonunu tahmin (1 absorbans birimi 50 ug / ml DNA eşdeğerdir). 650 Da ile baz çiftlerinin sayısı çarpılarak her plazmid moleküler kütlesi belirler. Her bir plazmid hazırlama molar konsantrasyonunu hesaplamak için, konsantrasyon ve moleküler kütlesi kullanın. 36 nM&#39;lik bir konsantrasyonda plasmid DNA preparatları seyreltin. Bunlar çalışma stokları olacakBu transfeksiyon için DNA karışımları hazırlamak için kullanılacaktır. </li><li> Su 20 ul&#39;lik bir son hacim içinde dolgu plazmid 1800 ng DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. </li><li> PLuc kontrol konstruktunun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. </li><li> PLuc kontrol konstruktunun 5 ul pYFP ve kontrol yapısının 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. </li><li> Pozitif kontrol konstruktun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. </li><li> Aşağıdaki DNA, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul ve py 5 ul birleşerek DNA karışımı için ilgi, X bir proteinin homodimerizasyon test etmek için karışımları hazırlamakFP inşa. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X B) pLuc-X ve pYFP kontrol C) pLuc-X-X ve pYFP </li><li> Aşağıdaki DNA ilgi konusu olan proteinlerin bir çifti arasında bir etkileşim için test etmek için karışımları hazırlamak, X ve Y, her bir DNA karışımı için, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul birleştirmek ve pYFP 5 ul oluştururlar. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X B) pLuc-X ve pYFP kontrol C) pLuc-kontrolü ve pYFP-Y D) pLuc-Y ve-kontrol pYFP E) pLuc-X-Y ve pYFP F) pLuc-Y ve-X pYFP </li></ol> 3. Transfeksiyon <ol><li> Hasat 75 cm 2 şişeden HEK293 hücreleri alt konfluent. Kültür ortamında 13 ml toplam hücrelerin% 10 seyreltin. Beyaz her oyuğuna hücre süspansiyonu 130 ul koyunnet 96 oyuklu doku kültürü plakası dipli. 24 saat boyunca kültür hücreleri. </li><li> 3 ile DNA karışımları sayısını çarpılarak transfekte edilecek kuyu sayısını hesaplayın., Oda sıcaklığına kadar, serum içermeyen kültür ortamı getirin. Serum-barındırmayan ortam içinde 6.3 ul ve oyuk başına 0.18 ul transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir ana karışımı hazırlayın. Vorteks ile karıştırılır ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Serum-barındırmayan ortam / transfeksiyon reaktifi ana karışımı 20 ul DNA karışımı 2 ul ekleyerek transfeksiyon karışımları hazırlayın. Vorteks. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Oyuk başına transfeksiyon karışımı 6.5 ul tevzi her transfeksiyon karışımı ile üç kuyu transfekte. Bir başka 36-48 saat için kültür hücreleri. </li></ol> Bret Sinyal 4. Ölçümü <ol><li> Vorteks ile DMSO içinde 34 mg / ml &#39;de, canlı hücre lusiferaz alt-tabaka içinde çözündürülür. </li><li> Alt-tabaka seyreltme ortamı p 1:1,000 ile yeniden canlı hücre lusiferaz alt-tabaka seyreltik37 ° C&#39;ye yeniden ısıtıldı 50 alt-tabaka seyreltme ortamı ul başına de izin verir. Karıştırmak için Vortex. Bir çökelti meydana getirebilir, ancak testi ile engel olmaz. </li><li> 96 oyuklu plaka kültür ortamı aspire. Her bir seyreltilmiş canlı hücre lusiferaz alt-tabaka 50 ul koyun. En az 2 saat (en fazla 24 saat) için Kültür hücreleri. </li><li> 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve luminometre içinde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Ayrıca bir anda Luc ve YFP itibaren emisyonunu ölçün. Uzun ve 470 nm dalga boylarında daha engelleyen bir filtre kullanılarak Luc adlı emisyonunu ölçün. 500-600 nm bant geçişli filtre kullanılarak YFP salmaları ölçün. 10 sn emisyon sinyalleri entegre. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan Luc emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır Luc emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm Luc emisyon okumalar bu Değ.Çıkar.</li><li> Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan YFP emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır YFP emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm YFP emisyon okumalar bu Değ.Çıkar. </li><li> Her bir kuyu için, düzeltilmemiş Bret oranını vermek arka plan çıkarılır Luc emisyon değeriyle arka plan çıkarılır YFP emisyon değeri bölmek. </li><li> Yalnızca pLuc kontrol plasmidi ile transfekte edildi, üç kuyu düzeltilmemiş BRET oranlarını ortalama. Düzeltilmiş Bret oranlarını vermek için tüm diğer düzeltilmemiş Bret oranlarından bu Değ.Çıkar. </li><li> Düzeltilmiş BRET oranlar kalan kümelerinin her biri için, bir son BRET oranını elde etmek için, üç transfekte kuyulardan değerlerinin ortalamasını alın. </li></ol>

<ol><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li>
<li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li>
<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li>
<li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li>
<li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22BRET%29.+Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li>
<li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BRET+versus+FRET.+Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li>
<li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28eBRET%29+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li>
<li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+%CE%B2-arrestins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li>
<li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li>
<li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li>
<li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204(2013).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li>
<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li>
<li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+genetics+of+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li>
<li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li>
<li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability%2C+autism%2C+and+language+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li>
<li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li>
<li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1%2F2%2F4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li>
<li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li>
<li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Füzyon protein ekspresyon yapılarının tasarımı Bret tahlil kurma önemli bir adımdır. Burada yer alan deneylerde, ilgi duyulan proteinlerin veya lusiferaz YFP C-terminine kaynaştırılmıştır. De mümkündür, ve lusiferaz / YFP N-terminine proteinleri sigorta, gerekli olabilir. Bazı proteinler için, füzyonları, sadece protein yapısı ve işlevinin bozulmasını önlemek için N-veya C-terminalinde ya da kabul edilebilir. Ayrıca, zar proteinleri olarak N ve C termini lusiferaz / YFP protein etkileşim ortak olarak aynı yerde olan ucu...

Dizileme insan bozuklukları arasında bağlantı analizleri klasik ve yeni nesil Hem biyolojik yolların bir aralıkta yer alan proteinlerin klinik anlam açıklayıcıdır. Bu önce bu tür çalışmalarda kendi tanımlama, bu proteinlerin biyolojik rolünün çok az veya hiç soruşturma edildiğine, genellikle böyledir. Ilgi konusu bir proteinin biyolojik fonksiyonunu keşfetmek başlatmak için verimli bir yol onun fizyolojik bağlamında ile etkileşen diğer hangi proteinlerin tespit etmektir. Bu şekilde moleküler ağlar karakterize insan fenotip altında yatan biyolojik yollar içgörüler sağlar. En sık kullanılan büyük ölçekli tarama ilgi konusu olan proteinlerin aday etkileşim ortakları belirlenmesi için yaklaşımlar maya iki-hibrid eleme 1 ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik 2 &#39;dir. Bu yöntemler potansiyel etkileşim proteinler düşündüren çok başarılı olabilir, ancak ar olabilirYanlış pozitif sonuçlar savunmasız e. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrometrisi tarama ile belirlenen bir etkileşim onay ikinci bir teknik kullanılarak etkileşim doğrulaması gerektirmektedir. Tipik olarak, bir ko-immünopresipitasyon veya çekme-down deney bu amaçla 3 için kullanılır. Doğrulama için bu gibi teknikler kullanılarak bir dezavantajı, belirli bir protein etkileşimlerini muhafaza edilmesi için gerekli olabilir, hücre içi koşullar yok hücre lisisi, için bir gerekliliktir. İkinci bir dezavantaj, zayıf ya da geçici protein etkileşimleri yıkama adımları sırasında bozulabilir olmasıdır. Ayrıca, bu deneyler, önemli eller zaman talep aynı anda işlenebilir numune sayısı sınırlıdır ve genellikle reaktiflerin ve protokoller zaman alıcı optimizasyon gerektirir. Ko-immünopresipitasyon deneyleri ile ilişkili problemlerin bazılarının üstesinden gelebilmek için, çeşitli tahliller, floresan ve biolum göre geliştirilmiştircanlı hücreler olarak kullanılabilir inescent proteinleri. Bu alandaki ilk deneyler Floresans (veya Förster) rezonans enerji transferi (FRET), üst üste binen emisyon ve uyarım spektrumları 4, iki floresan protein arasındaki enerji radyatif olmayan transferi dayandırılmıştır. Enerji transferi etkinliği bu nedenle, FRET olgusunun gözlem verici ve alıcı floroforlar yakın olması gerekir, güçlü bir mesafe bağımlıdır. Ve akseptör-floroforu (yaygın sarı floresan proteini; YFP) ile bir füzyon olarak ikinci, ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim test etmek için, bir protein, donor-florofor (CFP genel olarak mavi floresan protein) ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim CFP donör YFP akseptör göreceli ışık emisyon ölçülebilir bir artışa neden olur ki, enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın bir verici ve alıcı florofor getirebilir. FRET canlı hücreler 4 protein-protein etkileşimlerini tespit başarılı olmuştur. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için FRET kullanılmasının başlıca dezavantajı, donor-florofor uyarma dış aydınlatma için bir gerekliliktir. Emisyon sinyali, alıcı istenmeyen uyarma ve verici ve alıcı florofor hem ışıkla ağartma yüksek arka dış aydınlatma sonuçlanır. Bu etkiler, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için, tahlilin hassasiyetini azaltır. Dış aydınlatma yüksek bir arka plan sorununu ortadan FRET deneyinin bir modifikasyonu Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) tahlili 5,6 olan. BRET sisteminde donor-floroforu bir lusiferaz enzimi ile değiştirilir. Bu durumda, alıcı fluorofor uyarılması için enerji gereksiz dış aydınlatma ile, bir lusiferaz alt-tabakanın oksidasyonu ile, sistem içinde oluşturulur. ÇoğundaBu tahlilin ortak bir yapılandırma, verici Renilla lusiferaz reniformis ve akseptör (alternatif donör ve akseptör proteinlere ilişkin bir tartışma için Pfleger et al. bakınız: 5) YFP olmasıdır. Bu duruma göre, bu sistemde, ilgi konusu bir protein lusiferaz ve potansiyel olarak etkileşen protein YFP için, veya tam tersi kaynaşır. BRET deney lusiferaz için bir substrat olarak koelenterazin eklenmesini gerektirir. Coelenterazine hücre-geçirgen olduğu için, canlı hücrelerde BRET deneyleri gerçekleştirmek mümkündür. Bununla birlikte, doğal coelenterazine sulu çözelti içinde kararsız olduğu ve koelenterazin enzim bağımsız arıza tahlil için alt-tabaka mevcut konsantrasyonunu azaltır ve lusiferaz aktivitesi ölçümlerinin hassasiyetini azaltır autoluminescence oluşturur, her ikisi de. Canlı hücrelerdeki BRET kullanılması, sulu çözelti içinde stabil olan, ancak sitosolik esteraz ile bölünen korunan coelenterazines, geliştirilmesi ile kolaylaştırılmıştırhücre 7 içindeki aktif coelenterazine oluşturmak için hücre zarından difüzyon sonra s. Lusiferazı ve YFP-füzyon proteinlerini eksprese eden hücrelere substrat ilave edildikten sonra, protein-protein etkileşimleri kaynaklanan enerji transferi lusiferaz ve YFP gelen emisyon izleyerek ölçülür. Protein etkileşimleri, çok oyuklu plakalar içerisinde canlı hücreler doğrudan izlenebilir için, BRET deney maliyet ve zaman tasarruflu, varsayılan etkileşimlerini doğrulamak için basit bir ölçeklenebilir bir yöntem içerir. Proteomik tarama çalışmalarda tanımlanan varsayılan inter aktörlerin onaylamaya ek olarak, BRET sistem aynı zamanda, ilgi konusu bir protein üzerinde önceden biyokimyasal ve yapısal çalışmalarından gelen test aday uygulayıcı için kullanılabilir. , Bir protein-protein etkileşiminin varlığı (BRET yöntemi kullanılarak ya da diğer teknikler yoluyla) bir kez kurulduktan sonra BRET deney emp olması için potansiyel vardırloyed ayrıca etkileşimlerini karakterize etmek için. Örneğin, etkileşim bölgeleri proteinlerinin kesilmiş versiyonları üreterek eşlenebilir ve bu etkileşimde belirli tortuların katılımı nokta mutasyonlar oluşturarak kanıtlanabilir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri ile ilgili çevrim sonrası modifikasyon veya (ilaç veya ligandlar gibi) küçük moleküller modüle edici etkisinin 8-10 araştırılabilir. Tahlil, aynı zamanda, hasta BRET DNA tanımlanan mutasyonlar araştırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Durumda, bir mutasyon için nedensel rol BRET fenotip 11 moleküler etiyolojisi hakkında daha fazla ortaya çıkarabilir kullanılarak protein-protein etkileşimlerine mutasyonun etkisi araştırılarak kurulmuştur burada. Çeşitli potansiyel olarak zarar veren mutasyonların rele olduğu açık değildir, bu durumda, bir birey içinde tespit edilmesi için yeni nesil dizileme yöntemleri gelişiyle bu yana, giderek daha yaygın olduğufenotip 12 adjuvant. Bu durumda BRET deney protein işlevi üzerindeki mutasyonlar etkisini değerlendirmek için de değerlidir ve bozukluğa dolayısıyla alaka olabilir.

<table><tbody><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Nanodrop</td><td></td><td>260 nm'de absorbansları okuyabilen herhangi bir spektrofotometre uygun olacaktır. Plazmitin moleküler kütlesinin belirlenmesi, transfeksiyon karışımlarında kullanılacak DNA miktarlarının hesaplanması için çok önemlidir.</td></tr><tr><td>96 mikro kuyulu plakalar, düz tabanlı, beyaz</td><td>Greiner Bio One</td><td>655098</td><td>Beyaz plakalar, kuyucuklar arasındaki karışmayı azaltır ve lüminesans algılama hassasiyetini en üst düzeye çıkarır. Açık tabanlı kuyular, hücre yoğunluğunun izlenmesine izin verir. Plakalar hücre kültürüne uygun olmalıdır. Üstten okunan bir luminometre kullanılıyorsa, plaka kapağı çıkarılmalıdır.</td></tr><tr>Kontrol yazılımı <td>TECAN'lı</td><td></td> <td>sonsuz F200Pro plaka okuyucu</td><td>Lüminesans ölçümü için 'Mavi 1' ve 'Yeşil 1' filtrelerini ve floresan ölçümü için GFP için filtre setlerini ve dikoik aynayı kullanın. Çift renkli lüminesans ve floresan ölçme özelliğine sahip herhangi bir üstten okuma plakası okuyucu uygundur.</td></tr><tr><td>pLuc, pYFP, pozitif kontrol plazmidi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plazmitler talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.</td></tr><tr><td>pGEM-3Zf (+)</td> <td>Promega</td><td>P2271</td><td>Transfeksiyon karışımlarında DNA kütlesinin dengelenmesi için dolgu plazmidi. Ökaryotik promotörü olmayan herhangi bir plazmit uygun olacaktır.</td></tr><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>ECACC</td><td>85120602</td><td>Makul verimlilikle transfekte eden diğer hücre hatları uygun olabilir.</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>ile Bu, HEK293 hücrelerini kültürlemek için kullanılan ortamdır. 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu. Farklı bir hücre hattı kullanıyorsanız, burada açıklanan büyüme ortamını hücre hattına özgü ortamla değiştirin.</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, fenol kırmızısı içermez (substrat seyreltme ortamı)</td><td>Gibco</td><td>21063</td><td>Bu, fenol kırmızısı içermediği için lusiferaz substratının (EnduRen) seyreltilmesi için kullanılan substrat seyreltme ortamıdır, bu da testin hassasiyetini azaltır. Hücreler CO2 inkübatörünün dışındayken lüminesans ölçümleri sırasında doğru pH'ı korumak için HEPES içerir. 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985</td><td>OptiMEM, GeneJuice transfeksiyon reaktifinin seyreltilmesi için kullanılır. Diğer serumsuz ortamlar da uygun olacaktır. Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>% 10 v / v konsantrasyonda hücre kültürü ortamının takviyesi için.</td></tr><tr><td>GeneJuice transfeksiyon reaktifi</td><td>Novagen</td><td>70967</td><td>HEK293 dışında bir hücre hattı kullanılıyorsa, transfeksiyon karışımlarında Genejuice transfeksiyon reaktifinin DNA'ya oranını ayarlamak gerekebilir. Diğer transfeksiyon reaktifleri kullanılabilir. Alternatif bir transfeksiyon reaktifi kullanılıyorsa, üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon karışımlarında kullanılan DNA miktarını optimize etmek gerekebilir.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Doku kültürü için uygun olan steril DMSO kullanın.</td></tr><tr><td>EnduRen canlı hücre substratı</td><td>Promega</td><td>E6481</td>, <td>EnduRen'i DMSO'da 34 mg / ml'de sulandırır. EnduRen'in kültür ortamında seyreltilmesi üzerine bir çökelti oluşabilir. Bu, tahlil ile etkileşime girmeyecektir. Mağaza EnduRen'i -20 &°C'de yeniden yapılandırdı; C ve çoklu donma-çözülme döngülerinden kaçının. Sulandırılmış EnduRen'in kültür ortamında seyreltmeden önce tamamen çözüldüğünden emin olun.</td></tr></tbody></table>

biyoparlaklık rezonans enerji transferi kullanma canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri araştıran

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) dayalı tahliller, canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri izlemek için bir hassas ve güvenilir bir araç sağlar. BRET bir &quot;alıcı&quot; flüoresan protein için bir &#39;verici&#39; lusiferaz enzim enerji radyatif olmayan transferidir. Bu deneyde en yaygın yapılandırmada, verici Renilla reniformis&#39;e lusiferaz ve alıcı sarı floresan proteini (YFP) &#39;dir. Enerji transferi verimi güçlü mesafe bağımlı olduğu için, BRET olgusunun gözlem verici ve alıcı yakın olması gerekir. Kültürlenen memeli hücrelerde ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim için test etmek amacıyla, protein, bir lusiferaz ve YFP ile bir füzyon olarak, ikincisi ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim verici ve enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın akseptörü getirebilir. Protein-protein araştırmak için başka teknikler ile karşılaştırıldığındateractions, Bret tahlil duyarlı, küçük ellerini-zaman ve kaç reaktifler gerektirir, ve, zayıf geçici, ya da canlı bir hücrenin içinde bulunan biyokimyasal çevresine bağlıdır etkileşimleri tespit edebiliyor. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrofotometresi proteomik çalışmalar önerdiği varsayımsal etkileşimleri doğrulanması için ideal bir yaklaşımdır, ve ek olarak protein-protein etkileşimleri, çevirim sonrası değişikliklerin etkisini değerlendirmek, eşleme etkileşim bölgeleri için çok uygundur, ve Hasta DNA tanımlanan mutasyonların etkisini değerlendirmek.

BRET Analizin ilkesi Şekil 2&#39;de görüntülenmiştir. Burada yer alan deneyler boyunca kullanılan deney kurulumu, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Bir lusiferaz-YFP füzyon proteini ile transfekte edilmiş hücrelerin güçlü bir BRET sinyalin tespiti enerji transferi gözlemlenebilir olduğunu doğruladı Bu deney düzeneğinde (Şekil 4). Bizim araştırma beyin gelişiminde transkripsiyonel baskılayıcıların FoxP ailenin rolü üzerinde duruluyor. En belirgi...

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iki protein ve canlı kültür hücreleri arasındaki etkileşimi gözlemlemektir. Bu, memeli hücrelerinde protein ekspresyonu için vektörler oluşturmak amacıyla, ilgilenilen iki proteine ait cDNA'ların lusiferaz veya sarı floresan protein (kısaca YFP) kaplama dizilerini içeren plazmidlere alt klonlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, plazmidler kültür hücrelerine transfekte edilir ve bu da YFP ile lusiferaz füzyon proteinlerinin ekspresyonuna yol açar.Ardından, lusiferazdan ışık yayılımını başlatmak için hücrelere lusiferaz substratı eklenir. LUCIFERASE'den YFP'ye enerji transferine dayalı olarak, iki füzyon proteini arasındaki etkileşimi gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin ko-presipitasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein-protein etkileşimlerinin canlı hücrelerde gözlemlenmesine olanak tanımasıdır.Bu Yöntem, bir hastada bulunan bir mutasyonun protein-protein etkileşimlerini etkileyip etkilemediğini belirleyerek fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürün ilk adımını, laboratuvarımdan doktora öğrencisi RAB tric uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, metin protokolünde a

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Video, floresan proteinler, bir donör eGFP ve alıcı mCherry ile etiketlenmiş sitoplazmik proteinleri eksprese eden canlı bakterilerde protein-protein etkileşimini belirlemek için FLIM-FRET görüntüleme tekniğini açıklar. Kombine teknik ayrıca etkileşen proteinlerin miktarının belirlenmesine de izin verir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu için FLIM-FRET Görüntüleme

Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi.

BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT)

Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.

Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test

Burada, canlı HepG2 hücrelerinde Akt aktivasyonu ve fosforilasyonunun uzay-zamansal dinamiklerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme, kanser hücrelerinde insülin sinyal yolları ve metabolik düzenleme hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir araçtır.

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi

Öğrenin canlı hücrelerde protein-protein etkileşimlerini BRET tekniği ile gerçek zamanlı izlemeyi. Bu yöntem, patojenik mutasyonların etkilerini değerlendirmek ve hücresel süreçleri anlamak için değerlidir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Daha fazla video keşfet