Name: Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Öğrenin alg hücrelerinde nötral lipidleri Nile Red boyama yöntemiyle hızlıca ölçmeyi. Bu protokol, biyoprocess performansını izlemek için geleneksel yöntemlere zaman tasarruflu bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu proje için mali destek sağlamak için Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi teşekkür etmek istiyorum.

1.. Kuru Alg Biyokütle İzolasyonu Floresan Okumalar için Standartlar olarak kullanılır edilecek <ol><li> Kuru biyo-kütle, en az 200 mg olan artan alg kültürden bir numune hacmi kaldırma, 400-600 mg tercih edilir. </li><li> 10,000 x g de 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de santrifüj örneği. Süpernatant atılır ve büyüme ortamı ile aynı pH&#39;a formüle fosfat tampon maddesinin eşit hacmi ile pelet yıkayın. </li><li> 3 yıkama işlemi bir toplam adım 1.2 tekrarlayın. </li><li> De-iyonize su içinde pelet yeniden askıya ve ağırlık önceden tartılmış çanak aktarın. 48 saat boyunca 50 ° C &#39;de kuru olsun. Not: vakum altında kurutma, kurutma süresini azaltmak ve 50 ° C üzerindeki sıcaklıklarda kurutulması yeniden süspansiyon kültürü zor hale getirebilir. </li><li> Ileride kullanmak için oda sıcaklığında saklayınız kurutulmuş alg kültürleri. </li></ol> Hekzan Ekstraksiyon tarafından Nötr Lipidlerinin 2. Gravimetrik niceliksel (Bligh ve Dyer 4 uyarlanmıştır) <ol><li> Bir ağırlık tabak kuru alg biyokütlesinin yaklaşık 50 mg ölçün. Not: 40-80 mg kadar Kütleleri tekrarlanabilirlik kaybı olmadan kullanılabilir. </li><li> Bir havan heksan ile önceden yıkanmıştır biyokütle aktarın. Eğer gerekli ise, tam olarak harç için biyokütle transfer etmek için bir Pasteur pipeti kullanarak heksan küçük bir miktarı (1 mi) ile tartın çanak yıkayın. NOT: Hekzan derece uçucu ve zehirli bir maddedir. Bu uygun koruyucu giysi ile davlumbaz ele alınması gerekir. </li><li> Bir havan tokmağı kullanılarak 5 dakika boyunca alg biyokütlesinin öğütün. Nazik taşlama ile başlayan ve giderek şiddetini artırmak. 5 dakikalık bir süre içinde ince ve pürüzsüz bir hamur haline biyokütle öğütün. Harca biyokütle aktarırken fazla heksan kullanılırsa, bu heksan öğütme önce buharlaşması için beklemek en iyisidir. </li><li> Harç için heksan ile birkaç ml ilave edilir ve homojen hale gelinceye kadar havan tokmağı ile elde edilen bulamaç karıştırılır. Tüm hücre döküntüsü mor duvarlarına yapıştırılmış emin oluntar serbest kaldığında ve sıvı içinde süspansiyon haline getirilir. </li><li> Bir santrifüj tüpüne heksan-hücre kütlesi karışımı aktarın. Not: santrifüj tüpü cam ya da Teflon gibi heksan ile uyumlu uygun bir polimer şeklinde olmalıdır. </li><li> Tüm biyokütle santrifüj tüpüne (3-5x) transfer edilene kadar tekrar 2,4 ve 2,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Santrifüj 10,000 x g &#39;de 20 dakika boyunca 4 ° C&#39; de örnek. </li><li> Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış metal çanak içine tartın süpernatan pipetle. Davlumbaz saklayın. </li><li> Topağa heksan 3 ml ilave 1 dakika boyunca kuvvetlice girdaplanarak bir 2. heksan çıkarma yapın. </li><li> Tekrar 2.7 ve 2.8 adımları. Gerekirse, tüm hücre döküntüsü tam yerleşir sağlamak için ikinci çıkarma sırasında santrifüj içinde 30 dakika boyunca örneklerini yürüt. Hekzan tamamen buharlaşmış sonra gravimetrik çıkarılan yağın kütlesini belirlemek. </li></ol> Nil Kırmızı kullanma Nötr Lipidlerinin 3.. Florimetrik Kantitasyonu (RAPORU olarakted de la Hoz Siegler ve diğ. 11 oranında) Not: 5 g / L, bir alg süspansiyonu sadece 10 ul floresans okuma için gereklidir. Genel olarak, kültür sıvısının 1.5 ml kuru alg biyokütlesinin yeterli izolasyonu daha fazladır. Ayrıca, spektrofotometre içinde lambanın ışık yoğunluğu zamanla düşürebilir. Bu enstrüman varyasyonlar ölçümlerin gereksiz hata katmayan sağlamak için her deneyde standartlara dahil edilmesi önerilmektedir. <ol><li> Alkol reaktif dereceli etanol 10 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda bir Nile Red çözelti hazırlayın. 4 ° C de karanlıkta bu çözüm saklayın </li><li> 4 ° C&#39;de deiyonize su ve mağaza içinde% 30 (v / v) etanol çözeltisi hazırlayın </li><li> Aynı biyokütle konsantrasyonu (/ L 5 g önerilir) de ve ölçümünde kullanılan standartlar ile aynı şekilde tüm alg örnekleri hazırlayın. Olan uygun miktarda ya da süspansiyon önceden kurutulmuş numuneler ile bu Yapılacakfosfat tamponu (0.6 g / L potasyum fosfat dibazik, 1.4 g / L potasyum fosfat monobazik) ya da bulanıklık ölçüm sonra fosfat tampon maddesi ile 5 g / L büyüyen alg kültür konsantrasyonunun ayarlanması. NOT: Canlı alg kültürleri üzerinde yapılan ölçümler genellikle bulanıklık kalibrasyon eğrisinin hassas bağlı olarak onlarla ilgili büyük bir hata olacaktır. Kurutuldu örnekleri tam olarak yeniden süspanse biyokütle dağıtılması için bir homojenleştiricinin kullanımını gerektirebilir. </li><li> Her bir örnek için, 96 oyuklu bir plaka tek bir oyuk içinde% 30 etanol çözeltisi içinde 80 ul, Nile Red çözeltisinin 10 ul ve alg süspansiyonu 10 ul karıştırın. Uygun şekilde floresan ölçüm arasındaki farklılıkları hesaba amacıyla, her bir örnek 5 çoğaltır. </li><li> Enstrüman ve hazırlanmasında gün-gün varyasyonları için hesap için önceden hazırlanmış standartlar ile iki noktalı kalibrasyon eğrisi. S kullanarak floresan ölçümü için standartlar hazırlamak, örnek olarak ame prosedür. NOT: Genellikle iki nokta aletin kalibrasyon için, üç puan doğrusallık doğrulamak için çalıştırılabilir yeterlidir. </li><li> Bir çok-yuvalı plaka okuyucu spektrofotometre içinde floresans ölçümleri yapın. Aşağıdaki koşullar en tutarlı sonuçlar 11 elde bulundu: <ol><li> 30 saniye için, 1.200 rpm, yörünge 3 mm çalkalayın. </li><li> 10 dakika boyunca 40 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 30 saniye için, 1.200 rpm, yörünge 3 mm çalkalayın. </li><li> Tutanak floresan, 530 nm&#39;de eksitasyon, 604 nm emisyon. </li></ol></li><li> Iç standartları elde edilen sonuçları kullanarak yağ içeriği için floresans ölçümleri dönüştürme. </li></ol> 4. Floresan Mikroskopi Tekniği NOT: Bölüm 3 açıklanan boyama protokolü kantitatif analiz için tasarlanmış, ama aynı zamanda eğitici ve açıklayıcı pu için leke dayalı tekniklerin görsel temsillerini sağlamak için yararlı olabilirrposes. Örnek floresan biri görüntülerini üretmek için geleneksel iletim ve ek epifluorışıma aydınlatma kaynakları ile bir optik mikroskop gerektirir. 530 nm (yeşil) ve 604 nm (kırmızı) aralığında Eksitasyon ve emisyon ışık filtreleri, sırasıyla, Nile Red leke hem de yazılım ile bağlantılı bir mikroskop monte edilmiş bir kamera için ihtiyaç vardır. Bu çalışmada (Şekil 1) de gösterilen görüntüler RGB dönüştürücü ünite için bir kamera ve Monokrom ile donatılmış aydınlık alan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Bu araçları kullanarak Nil Kırmızı floresan görüntüleri üretmek için prosedür aşağıda özetlenmiştir: <ol><li> Protokol bölümü 3&#39;e uygun Nil kırmızı leke ile bir kültür örnek hazırlayın. Not: 5 g / L konsantrasyon aralığı içinde bir örnek aşırı kalabalık olmadan yeterli hücre yoğunluğunun slaytlar üretir. </li><li> Boyama protokolü adım 3.6 tamamladıktan sonra, standart laboratuar prosedürlere göre işlenen numunenin bir mikroskop slaydı hazırlar. </li><li> Iletim modunda mikroskop ile başlayarak, mikroskop içine hazırlanan slayt yük ve istenen büyütme (bu yazıda gösterilen görüntüler 100X amacı ile satın alındı) de hücreleri bulmak. </li><li> Odaklı kez epifluorışıma aydınlatma moduna iletim gelen mikroskop geçiş. Işık kaynağı artık (bu slayt ve objektif lens arasındaki boşluk gözlemleyerek görsel olarak teyit edilebilir) objektif lens doğrudan gelen edilmelidir. </li><li> Gözlem ışık yoluna ışık kaynağı ve kırmızı emisyon filtre içine yeşil bir uyarım filtre takın; boyalı hücrelerin floresans artık mercek doğrudan görünür olmalıdır. </li><li> Monte kameraya Mercekten mikroskop gözlem moduna geçmek ve floresanlama hücrelerin bir görüntü yakalamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Kameranın duyarlılığına bağlı olarak, örnek başlangıçta (önizleme penceresinde görünmeyebilir ekranında yani olacak) siyah olacak; Bu durumu düzeltmek için, hücreler görebilir bir düzeye maruz kalma süresi ve kameranın kazancını kontrol etmektedir. Özel ayarlar alet, ekipman ve hücre tipleri ile değişecektir. </li></ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+%26+Renewable+Energy%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Department+of+Energy%2C+Office+of+Energy+Efficiency+and+Renewable+Energy%2C+Biomass+Program%22%5BJournal%5D)">National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy.</a> U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf">http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf</a> (2010).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+microalgal+productivity+using+an+adaptive%2C+non-linear+model+based+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy.</a> Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Hara, A., Radin, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+of+tissues+with+a+low-toxicity+solvent%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent.</a> Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+methods+used+for+microalgal+lipid-content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Procedia%22%5BJournal%5D)">Review of methods used for microalgal lipid-content analysis.</a> Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).</li>
<li>Izard, J., Limberger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+quantitation+of+bacterial+cell+lipids+from+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reliability+of+fluorescence-based+neutral+lipid+content+measurements+in+microalgal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Res%22%5BJournal%5D)">Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures.</a> Algal Res. 1, 176-184 (2012).</li>
<li>de la Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+lipid+content+in+a+marine+dinoflagellate%2C+Crypthecodinium+cohnii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii.</a> J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).</li>
<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
<li>Guzmán, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li>
<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
<li>Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzini%2C+E+%22J.+Microbiol.+Meth%22">J. Microbiol. Meth</a>. 87, 17-23 (2011).</li>
<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Standart eğri kullanılan yosunlar, bu ölçülen ile aynı deney koşulları altında ekilen aynı tür olmalıdır. Medyum kompozisyonu, yetiştirme tekniği ve boyama protokolü önemli değişiklikler floresans okuma yoğunluğunu etkileyebilir. (Bölümler 1 ve 2&#39;de tarif edilmiştir) ekstre Heksan, standart eğri kullanılan numunelerin nötr lipid içeriğini belirlemek için kullanılmıştır. Doğru floresan yoğunluğu ölçümleri için, bütün numuneler aynı biyokütle konsantrasyonu (5 g / L, bu çalışmada kullanılmıştır) analiz edilmelidir. Ya...

Nedeniyle bazı stres koşullarında lipit cesetleri saklamak için kendi yeteneği, yosun potansiyel yenilenebilir bir yakıt kaynağı 1,2 gibi son yıllarda ilgi büyük aldık. Nötr lipidler uygun büyüme koşulları altında 3 hücre kuru ağırlığının% 60&#39;ın üzerinde hesap. Oysa sanayi düzgün, biyoproses performansını izlemek kültürleri analiz etmek ve yeni suşları için ekran için alg hücrelerinin lipid içeriğini ölçmek için, basit, temiz, hızlı ve güvenilir standart bir protokol yoktur. Bligh-Dyer gravimetrik yöntem yaklaşık 50 yıl önce bugün gelişmiş 4,5 kullanılan en yaygın teknikler arasında kalır. Bu işlem, basit, güvenilir ve yürütmek kolay olsa da, bu, zaman alıcıdır büyük örnek hacmi gerektirir, ve toksik çözücülerin kullanımı yapar. Bu fermantasyon vadede birçok örnekleri analiz veya yeni petrol zengini suşları için tarama için pratik değildir. Diğer yöntemler b vareen geliştirdi, ancak genellikle gelişmiş donanım gerektirmez ve 6 standardize edilmemiştir. Ilgi bir hayli topladı alternatif Nil Kızıl leke. Nile Red, polar olmayan ortamlarda tercihen floresant bir boya, nematodlar 7, 8, maya, bakteri 9 ve 10-19 yosunu dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda lipid organları belirlemek ve ölçmek için kullanılmıştır. Nile Red ilgili ilk teknikleri tek bir küvet spektrofotometri yöntemi ile ya da akış sitometrisi leke birleştirerek, niteliksel ya da yarı-nicel idi. Ayrıca, yeşil yosunu gibi yosun bazı sınıfları tekniği 10 aralığını sınırlı boya, çoğunlukla geçirmeyen kalın hücre kuyulara sahiptir. Nile Red boyama yöntemi için yeni gelişmeler protokol 10,11 ilk eksiklikleri bypass olduğu bildirilmiştir. Bir Carr mevcudiyetinde hücrelerin boyanmasıier 10, DMSO gibi bir çözücü veya etanol 10,11 güvenilir niceliksel ölçümler için izin veren, yağ içeriği ve absorbansı ile süre arasındaki ilişkiyi linearizes. Çözücü, Nile Red moleküllerin geçmesine ve böylece, hücre membran geçirgenliği sağlar. Buna ek olarak, mikro-plaka okuma yetenekleri olan bir spektrofotometre içeren kantitatif analiz için uygun olan yüksek verim protokolleri sağlar. Bu makale, detaylı olarak, etanol, bir uygun çözücü varlığında, Nil kırmızısı ile kültürleri boyanarak alg hücrelerinin yağ içeriğini ölçmek için basit bir yöntemdir. En doğru amacıyla ölçümlerde arka plan gürültü hesabı, yağ içeriği için floresan yoğunluğu ilişkilendirerek, standart bir eğri bilinen bir yağ bileşiminin yosun hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir. Bu yöntem, daha önce yayınlanmış protokollere 10,11 uyarlanmıştır. 96 çukurlu bir spektrofotometre kullanılarak, tek bir saat tha numune aynı miktarda analiz edebilmektedirt gravimetrik yöntemlerle izlemek için gün alacaktı. Ayrıca, istenen alg türlerinin temsili numuneler kullanılarak kalibre bu yöntemi doğrudan yorumlanabilir nispeten hassas ölçümler üretir. Farklı suşları ve uygulamalar için optimize Nil Kırmızı yosun boyama yöntemlerini özetleyen birçok protokol var; Bu çok daha fazla türlere ve sınıflar için muhtemel uygun olmasına rağmen burada sunulan protokol başlangıçta, Auxenochlorella protothecoides için de la Hoz Siegler ve ark. 11 tarafından Chlorella vulgaris, Scenedesmus&#39;u dimorphus ve Scenedesmus Obliquus geliştirilmiştir. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama ile dizayn edilmiştir ve bu büyüyen bir kültürden önce kurutulmuş bir numune ve sulu numuneler için aynı şekilde iyi çalışır.

<table><tbody><tr><td>Kuru Ağırlık</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml tek kullanımlık pipetler</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Ampulü</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Nalgene Teflon Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Hekzan</td></tr><tr><td>Tartı Bulaşıkları</td> için gerekli Teflon (polipropilen)<td>Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpler</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma Fırını (Fisher 625D)</td><td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>Saklama şişeleri</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü mikrosantrifüj (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>Gravimetrik Miktar Tayini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porselen Harç (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>Porselen Havaneli (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Santrifüj tüpleri (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Cam tüpler de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Pasteur cam pipetler</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum tabakları tartın</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hekzanlar</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Yağ içeriğinin</td><td></td><td></td><td></td>florometrik miktar tayini</tr><tr><td>Floresan çok kuyulu plaka okuyucu</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>Floresan okuyucu yazılımı</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent Yazılımı 2.6</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı COSTAR 96 kuyulu plaka</td><td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nil Kırmızı</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (alkol reaktif sınıfı)</td> <td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme Floresan hücreler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMRXA2 (veya eşdeğeri) mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak fişleri</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

floresan kullanma alg hücrelerinde nötral lipidler Ölçüm basit ve hızlı protokolü

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Yosun doğal lipit depolama yetenekleri nedeniyle yenilenebilir yakıt kaynaklarından için mükemmel bir aday olarak kabul edilir. Alg fermantasyon süreçleri ve yeni petrol zengini suşları için tarama güçlü izleme hücre içi lipit içeriğinin belirlenmesi için hızlı ve güvenilir bir protokolü gerektirir. Güncel uygulamalar yağ içeriğini belirlemek büyük ölçüde gravimetrik yöntemler güvenmek, teknikler zaman alıcı ve büyük örnek hacimleri gerektiren onlarca yıl önce geliştirdi. Bu yazıda, Nile Red, organizmaların çok sayıda türleri lipid cisimlerin varlığının belirlenmesi için kullanılan bir floresan boya, Auxenochlorella protothecoides nötr lipid içeriği, yeşil bir ölçmek için basit, hızlı ve güvenilir bir protokole zikredilen alg. Yöntem, boyama önce hücre zarı ve fluoresans yoğunluğu ölçümleri sırasında örnek kapasitesini artırmak için, 96 oyuklu bir mikro-plaka nüfuz edilebilir kılınması için, etanol, nispeten hafif bir çözücü kullanmaktadır. Bu tasarım olmuşturİzleme biyoproses performansı belirli bir uygulama ile ed. Büyüyen bir kültürden önce kuru numune veya canlı numuneleri deneyde kullanılabilir.

Nile Red boya ile boyanmış Örnek yosun hücreleri, Şekil 1 &#39;de tasvir edilmektedir. Parça A ve A Şekil 1 ekran görüntülerinin B protothecoides oldukça düşük hücre içi lipid birikimine neden fazla nitrojen içinde büyütülür. A, C ve D parçaları, örneklerde azot sınırlaması altında yetiştirilen protothecoides gösterilmiştir. Iletim aydınlatma altında, hücrenin lipit organları onlar pa...

Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Nile red floresan boyası kullanarak alg hücrelerinin nötr lipid içeriğini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle hücre duvarını ve hücre membranını geçirgen hale getirmek için hücrelerin bir etanol çözeltisinde süspanse edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, hücrelere giren ve nötr lipid gövdeleri dahil olmak üzere hücrenin apolar bölgelerinde biriken Nile red floresan boyası eklenir.Ardından, örnekler 530 nanometrelik bir uyarım ışık kaynağına maruz bırakılarak nötr lipid gövdeleri tarafından absorbe edilen Nile red'in 604 nanometrede floresan yayması sağlanır. Bireysel testler bir mikro kuyucuk plakasında yürütülerek ve hızlı floresan okumaları elde etmek için bir spektrofotometre kullanılarak sonuçlar kitlesel ölçekte elde edilir. Okumalar, alg hücrelerinin nötr lipid içeriği ile floresan ölçümünün yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki olduğunu göstermektedir.Floresans ölçümlerinin yağ içeriğine dönüştürülmesi, yağ kompozisyonu bilinen hücrelerle hazırlanan bir kalibrasyon eğrisi ile gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin Blydire gravimetrik yöntemi gibi mevcut protokollere göre temel avantajı, çoğu laboratuvarda bulunan malzemeler kullanılarak nötr

a-simple-rapid-protocol-for-measuring-neutral-lipids-algal-cells

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Bu video, alg hücrelerindeki nötr lipidleri Nil kırmızısı boyası ile boyayarak tespit etmek ve ölçmek için bir protokol gösterir.

Nil kırmızısı boyama: alglerde hücre içi nötr lipidleri tespit etmek ve ölçmek için bir teknik

Mekanik hücre bozulması, solvent esaslı lipid ekstraksiyonu, transesterifikasyon ve miktar tayini ve gaz kromatografisi kullanılarak yağ asitlerinin tanımlanması göre mikroalg yağlı asit içeriği ve bileşimin belirlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bir tripentadecanoin iç standart ekstraksiyon ve eksik transesterifikasyon esnasında muhtemel kayıpları telafi etmek için kullanılır.

Mikroalglerden yağlı asit içeriği ve bileşimi analizi

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Burada, triacylglycerols hücrelerdeki yüksek üretilen iş deneylerde kültürlü dinamiklerini incelemek için lipid damlacık dizin (LD dizini) elde etmek için bir protokol açıklayın. LD dizin tahlil BODIPY 493/503 kullanır kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Bu tahlil dispendious lipid çekme ya da mikroskobu analiz ihtiyacı yok.

Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından

Burada, laboratuvar ölçekli kabarcık sütun photobioreactors oluşturmak ve onları kültür mikroalg için kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca kültür büyüme oranı ve tarafsız lipid içeriğin belirlenmesi için bir yöntem sağlar.

Kabarcık sütun Photobioreactors ve bir tahlil yeşil mikroalg ekimi için nötr lipitler

Bu protokol yağ asitleri ile stimülasyon üzerine insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık (LD) oluşumunun karakterizasyonu için bir test açıklar. Bu denemenin LD oluşumunun nicelleştirilmesi için nasıl kullanıldığını ve LD oluşumunu etkileyen ilaçlar için yüksek iş elde taramalarda nasıl kullanılabileceğini tartışıyoruz.

İnsan Bağırsak Organoidlerinde Lipid Damlacık Oluşumunun Karakterizasyonu ve Niceliği için Floresan Esaslı Bir Test

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Bu protokol, hücre ekzositozu ve endositoz döngüsü sırasında lipid membran trafiğini izlemek için pH'a duyarlı lipid florofor sınıfı kullanan bir floresan görüntüleme yöntemi sunar.

pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi

Bu protokol, spektral analize dayalı olarak kırmızı alglerdeki fikobiliprotein değişikliklerinin adım adım otofloresan görüntülemesini ve değerlendirilmesini açıklamaktadır. Bu, yalnızca kıt materyalin mevcut olduğu ve hücrelerin laboratuvar koşullarında yavaş büyüdüğü veya hiç büyümediği aşırı habitatlara hücresel adaptasyonu değerlendirmek için etiketsiz ve tahribatsız bir yöntemdir.

Kırmızı Alg Fizyolojisini Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Öğrenin alg hücrelerinde nötral lipidleri Nile Red boyama yöntemiyle hızlıca ölçmeyi. Bu protokol, biyoprocess performansını izlemek için geleneksel yöntemlere zaman tasarruflu bir alternatif sunar.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Daha fazla video keşfet