Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Nil kırmızısı floresan boyası kullanarak alg hücrelerinin nötr lipid içeriğini ölçmektir. Bu, hücre duvarını ve hücre zarını geçirgen hale getirmek için önce hücrelerin bir etanol çözeltisi içinde askıya alınmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, hücrelere giren ve nötr lipit cisimleri de dahil olmak üzere hücrenin polar olmayan bölgelerinde biriken Nil kırmızısı floresan boyası eklenir.

Daha sonra, numuneler 530 nanometrelik bir uyarma ışık kaynağına maruz bırakılır ve nötr lipit cisimleri tarafından emilen Nil kırmızısının 604 nanometrede floresan olmasına neden olur. Sonuçlar, bireysel testlerin bir mikro kuyu çarpımında gerçekleştirilmesi ve hızlı floresan okumaları üretmek için bir spektrofotometre kullanılması yoluyla kütle ölçeğinde elde edilir. Okumalar, lgal hücrelerinin nötr lipid içeriği ile floresan ölçümünün yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki olduğunu göstermektedir.

Floresan ölçümlerinin yağ içeriğine dönüştürülmesi, bilinen yağ bileşimine sahip hücrelerle hazırlanan bir kalibrasyon eğrisi ile sağlanabilir. Bu tekniğin, Bly dire gravimetrik yöntemi gibi mevcut protokollere göre ana avantajı, çoğu laboratuvarda bulunan malzemeleri kullanarak nötr lipid içeriğinin hızlı bir şekilde belirlenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, alg yetiştiriciliği sırasında biyoproses performansı hakkında anında geri bildirim sağlar.

Ayrıca, 96 Kuyulu plaka okuyucunun izin verdiği yüksek verim, tarama çalışmaları ve faktöriyel deneyler için idealdir. Bu teknik chlorella ve s Desus için optimize edilmiş olsa da, diğer lgal türlerinin analizi için kolayca değiştirilebilir. Tamam. Başlamak için, büyüyen alg kültüründen en az 200 miligram kuru biyokütle sağlayacak bir numune hacmini çıkarın.

400 ila 600 miligram tercih edilir. Numuneyi dört santigrat derecede 10.000 kez 10 dakika santrifüjleyin. G, süpernatanı atın ve peleti, büyüme ortamı ile aynı pH'a formüle edilmiş eşit hacimde fosfat tamponu ile yıkayın.

Bu işlemi toplam üç yıkama adımı için tekrarlayın. Peleti deiyonize suda tekrar süspanse edin ve önceden tartılmış bir tartım kabına aktarın. Numuneyi 48 saat boyunca 50 santigrat derecede kurumaya bırakın.

Kurutulmuş alg kültürleri ileride kullanılmak üzere oda sıcaklığında saklanabilir. Bir peynir altı suyu kabında yaklaşık 50 miligram kuru alg biyokütlesini ölçün. Biyokütleyi gerekirse hekzan ile önceden yıkanmış bir harca aktarın, biyokütleyi tamamen harç siparişine aktarmak için peynir altı suyu kabını az miktarda hekzan ile geçmiş bir pipet kullanarak yıkayın.

Daha sonra, alg biyokütlesini bir havaneli kullanarak beş dakika boyunca öğütün. Nazik öğütme ile başlayın ve yoğunluğu kademeli olarak artırın. Biyokütleyi ince ve pürüzsüz bir macun haline getirin.

Beş dakikalık süre boyunca, harca birkaç mililitre hekzan ekleyin ve elde edilen bulamacı homojen hale gelene kadar havaneli ile karıştırın. Harcın duvarlarına yapışan tüm hücre kalıntılarının serbest bırakıldığından ve sıvı içinde asılı kaldığından emin olun. Daha sonra, heksan hücre kütle karışımını uyumlu bir santrifüj tüpüne aktarın.

Tüm biyokütle santrifüj tüpüne aktarılana kadar üç ila beş kez tekrarlayın. Numuneyi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 10.000 kez santrifüjleyin. G. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı, çeker ocakta saklanabilen, önceden tartılmış metal bir kaba dikkatlice pipetleyin.

Peletlere üç mililitre heksan ekleyerek ve kuvvetlice girdap yaparak ikinci bir heksan ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bir dakika boyunca, süpernatantın santrifüjlenmesini ve transferini tekrarlayın. Heksan tamamen buharlaştıktan sonra gravimetrik olarak çıkarılan yağ kütlesini belirleyin.

Floro metrik miktar tayini için, tüm alg numunelerini aynı biyokütle konsantrasyonunda ve ölçümde kullanılan standartlarla aynı şekilde hazırlayın. Bunu, önceden kurutulmuş numuneleri uygun miktarda fosfat tamponunda askıya alarak yapın. Gerekirse, kurutulmuş lgal hücrelerinin tekrar süspansiyonunu kolaylaştırmak için bir homojenizatör kullanın.

Her numune için 80 mikrolitre hazırlanmış% 30 etanol çözeltisi, 10 mikrolitre hazırlanmış Nil kırmızısı çözeltisi ve 10 mikrolitre yosun süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğunda karıştırın. Floresan ölçümünün değişkenliğini doğru bir şekilde hesaba katmak için, her numunenin beş kopyasını gerçekleştirin. Ardından, daha önce hazırlanmış standartlarla iki noktalı bir kalibrasyon eğrisi çalıştırın.

Cihazdaki günlük değişiklikleri hesaba katmak ve floresan ölçümlerini çok kuyulu bir plaka okuyucu spektrofotometresinde gerçekleştirmek için hazırlık yapmak için, parametreleri 1.200 RPM'de sallanacak ve 30 saniye boyunca üç milimetre yörüngede dönecek şekilde ayarlayın, ardından 10 dakika boyunca 40 santigrat derecede inkübasyon yapın. 1.200 RPM'de başka bir sarsıntı ve 30 saniye boyunca üç milimetre yörüngede ve 530 nanometrede uyarma ve 604 nanometrede emisyon ile floresan kaydetmek. Ardından son adım olarak koşuyu başlatın.

Floresan mikroskobu gerçekleştirmek için dahili standartlardan elde edilen sonuçları kullanarak floresan ölçümlerini yağ içeriğine dönüştürün. Standart laboratuvar prosedürlerine göre proses numunesinin mikroskop slaytını hazırlamak için Nil kırmızısı boyası ile hazırlanan numuneyi kullanın. Mikroskop iletim modundayken başlayarak, hazırlanan lamı mikroskoba yükleyin ve hücreleri istenen büyütmede bulun.

Odaklandıktan sonra, mikroskobu iletimden epi floresan aydınlatma moduna geçirin. Işık kaynağı şimdi doğrudan objektif merceğinden gelmelidir, bu da slayt ile objektif merceği arasındaki boşluğu gözlemleyerek görsel olarak doğrulanabilir. Işık kaynağına yeşil bir uyarma filtresi ve gözlem ışığı yoluna kırmızı bir emisyon filtresi yerleştirin.

Lekeli hücrelerin floresansı artık göz merceğinden doğrudan görülebilmelidir. Mikroskop gözlem modunu göz merceğinden takılı kameraya geçirin ve floresan hücrelerin görüntüsünü yakalamak için görüntüleme yazılımını kullanın. Belirli ayarlar aletlere, ekipmana ve hücre tiplerine göre değişecektir.

Nil kırmızısı boyası ile boyanmış temsili alg hücreleri, nitrojen sınırlaması altında yetiştirilen bir OID'lerin örneklerinin aksine, çok düşük hücre içi lipid birikimine yol açan fazla nitrojen içinde büyüyen bir prothe'nin görüntüleri gösterilmektedir. İletim aydınlatması altında, hücrelerin lipid cisimleri, parlak dairesel yapılar olarak göründükleri ve hücre hacminin çoğunluğunu oluşturdukları yerlerde dikkatli bir inceleme ile görselleştirilebilir. Burada gösterilen hücreler kuru ağırlıkça sadece %5 oranında yağdır ve uygun ışık koşulları gösterildiğinde önemli düzeyde lipit cisimleri içermezler.

Bu örneklerdeki farklılıklar büyütülür. Yağ yağsız hücreler, koyu cisimlere sahip floresan halkalar olarak görünürken, yağ açısından zengin hücreler, birikmiş lipit cisimlerine sahip oldukları yerde parlak turuncu kırmızı bir parıltı gösterir. Nil kırmızısı, nötr lipitlerin, hücre duvarında bulunan fosfolipidlerin ve polar olmayan hücresel proteinlerin varlığına bağlı olarak farklı dalga boylarında floresan floresan yayılır, bu nedenle yağ yağsız hücreler koyu cisimlere sahip floresan halkalar olarak görünür.

Bu özgüllük aynı zamanda, testin optimize edilmiş koşulları altında nötr lipitlerin spektrofotometre ölçümleri sırasında arka plan floresan seviyesine neden olan şeydir, 0.980'den büyük R kare değerlerine sahip kalibrasyon eğrileri kolayca elde edilebilir. Hücre yağı içeriği ve floresan arasındaki ilişki, hücreler etanol gibi bir taşıyıcı çözücüden yoksun bir çözelti içinde boyanırsa doğrusal olmayan hale gelir. Burada sunulan veriler 0.395'lik bir R kareye sahiptir ve protokolün %0 etanol çözeltisi içinde gerçekleştirilmesiyle elde edilmiştir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 15 ila 20 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, tüm numunelerin aynı biyokütle konsantrasyonunda hazırlandığından emin olmak çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hem geleneksel heksan ekstraksiyon protokollerini hem de daha basit NAL kırmızı floresan boyama prosedürünü kullanarak lgal hücrelerinin nötr lipid içeriğini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.