Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, serum örneklerinden yüksek kaliteli RNA'yı izole etmektir. Ortak MRC'nin optimize edilmiş sürümünü kullanarak reaktif RTLS protokolünü deneyin. Bu, protein kontaminasyonunu azaltmak için önce serumun nükleaz içermeyen su ile bir ila beş oranında seyreltilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım, ilk santrifüjleme adımı için iki mililitre faz kilit tüpünün tanıtılmasıdır. Bu, fenol ve proteinler gibi kirleticilerin çoğunu organik fazda yakalar. Daha sonra, üçüncü ve son optimizasyon adımı, etanol yıkamalarından önce RNA peletinden kalan herhangi bir kontaminasyonu gideren 12.000 peynirde hızlı santrifüjleme dönüşüdür.

Son adım, daha yüksek bir toplam RNA verimi gerekiyorsa, aynı hastadan iki modifiye RNA preparatını bir araya getirmektir. Sonuç olarak, serumu nükleaz içermeyen suda çözündüren bu modifiye yöntemi kullanarak, ana kirleticileri yakalamak için bir faz kilitleme tüpü kullanır ve bir flaş dönüşü başlatır. Serumdan bir RNA izolasyonundan küçük kaplama olmayan RNA'ların geri kazanımını en üst düzeye çıkarmanın mümkün olduğunu gösteriyoruz.

Bu tekniğin standart triol RNA izolasyon protokolü gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, basit modifikasyonlar yoluyla serumdan RNA verimini en üst düzeye çıkarabilmemizdir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü küçük RNA'lar serumda düşük miktarlarda bulunur. Bu adımların optimize edilmiş yöntemi ve görselleştirilmesi, bu RNA'ların geri kazanılmasını iyileştirecek ve acemileri başarılı bir izolasyon İpucuna yönlendirecektir.

Önceden hazırlanmış donmuş serum örneğini buz üzerinde çözmeye başlamak için, daha sonra taze çözülmüş serumun 400 mikrolitresini etiketli bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, serumu 100 mikrolitre R nazsız su ile seyreltin ve mililitre başına bir miligram konsantrasyonda 50 mikrolitre proteinaz K ekleyin. Daha sonra seyreltilmiş serumu 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin, böylece 1.5 mililitre tri reaktif RTLS ve 100 mikrolitre dört promo anolde tam çözünmeyi sağlamak için yeterli protein sindirimine izin verin.

Homojenatı kısa bir süreliğine ters çevirin ve beş saniye boyunca tekrarlayan pipetleme yapın. Daha sonra karışımı etiketli iki mililitrelik ağır faz kilit tüpüne aktarın. Homojenatı 12.000 GS'de dört santigrat derecede 20 dakika döndürün.

Daha sonra, elde edilen sulu çözeltinin bir mililitresini dikkatlice taze bir DNA düşük bağlama tüpüne boşaltın. Organik ve arayüz, faz kilit tüpünün beyaz jelinin altında sıkışıp kalmalıdır. Daha sonra sulu çözeltiye beş mikrolitre glikojen ve 500 mikrolitre% 100 izopropanol ekleyin.

Çözeltiyi ters çevirerek karıştırın ve gece boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyonun ardından, numuneyi dört santigrat derece santrifüjde 12.000 GS'de 20 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, berrak süpernatanı atın ve dört santigrat derecelik bir santrifüjde 16.000 GS'de iki dakika boyunca bir flaş dönüşü yapın.

Bir pipet kullanarak, peleti çevreleyen berrak çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Daha sonra peleti bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın ve numuneyi 10.000 GS'de 10 dakika santrifüjleyin. Peleti görselleştirmek için, tüpü koyu bir arka planın önüne eğin ve yıkama solüsyonunu boşaltın.

Yıkamayı tekrarlayın. Yukarı çıkın. Peleti 10 mikrolitre RNA içermeyen suda süspanse ediyoruz.

Numuneyi 55 santigrat derecede beş dakika ısıtarak peletin tamamen çözüldüğünden emin olun. Bu süre zarfında, aynı hastadan alınan iki RNA preparatı olan daha yüksek bir toplam RNA verim havuzu için numuneyi tekrarlanan pipetleme ile karıştırın. Bir UV ve Spektrofotometre kullanarak yeniden süspanse edilmiş RNA'yı ölçün

ve bir 2100 biyoanalizör kullanarak RNA kalitesini değerlendirin. Ardından, havuzlanan RNA örneklerini sonraki uygulamalarda kullanmak için eksi 80 santigrat derecede saklayın. İnsan serumundan alınan RNA'nın spektrum fotometrik profilleri, geleneksel chum Chomsky yaklaşımına birkaç adımın eklenmesi nedeniyle RNA'nın gelişmiş verimini göstermektedir.

İnsan serumundan izole edilen tipik bir RNA UV profili, glikojen ve ekstra spin ilavesi dahil olmak üzere optimizasyon adımlarını kullananlarla çelişir ve bu araçların her biri bir araya getirilerek kirleticilerin azaltılması ve toplam RNA veriminin artması ile sonuçlanır. RNA örneğinin saflığı, fenol ve proteinleri yakalayan bir faz kilit jeli kullanılarak daha da arttırıldı. Ek olarak, serum hacminin arttırılmasının RNA verimi üzerinde kayda değer bir etkisi vardır.

Numunenin kalitesini daha fazla analiz etmek için bir biyoanalizör izlemesi yapıldı. Yaklaşık 21 nükleotidde tek bir sivri uç, mikro RNA fraksiyon dizisi profilini temsil eder ve prosedürü takiben QPCR gerçekleştirildi. Üç baş ve boyun kanseri ve bir normal S'nin bu dizi profili, mikroRNA'ların ekspresyonunu gösterir, hiyerarşik kümeleme kullanarak analiz eder ve mikroRNA'ların yukarı ve aşağı regülasyonunun görülebildiği bir ısı haritası olarak sunulur.

Aşağıdaki takip, spesifik mikroRNA'lar için QPCR amplifikasyon eğrileri oluşturuldu. Bu veriler daha sonra normal serum için ham BT değerlerini çizmek için kullanıldı Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, prosedürü takiben uygun şekilde gerçekleştirilirse, günümüzün maksimumunda yüksek kaliteli RNA üreten herhangi bir sayıda hastada gerçekleştirilebilir. Biyobelirteç keşfi ve doğrulaması gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.