Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, serum örneklerinden yüksek kaliteli RNA izole etmektir. Bu işlem, yaygın olarak kullanılan MRC try reagent RTLS protokolünün optimize edilmiş versiyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu işlem, öncelikle protein kontaminasyonunu azaltmak için serumun nükleaz içermeyen su ile bire beş oranında seyreltilmesiyle sağlanır.

İkinci adım, ilk santrifüj aşaması için iki mililitrelik faz kilitleme tüplerinin kullanılmasıdır. Bu işlem, fenol ve proteinler gibi kontaminanların çoğunu organik fazda hapseder. Ardından, üçüncü ve son optimizasyon adımı, etanol yıkamaları öncesinde RNA peletindeki tüm kalıntı kontaminasyonları uzaklaştıran 12.000 g hızındaki hızlı santrifüjleme işlemidir.

Daha yüksek bir toplam RNA verimi gerekiyorsa, son adım aynı hastadan elde edilen iki modifiye RNA preparasyonunu birleştirmektir. Nihayetinde, serumu nükleazsız su içinde çözerek ana kontaminantları hapsetmek için bir phase lock tüpü kullanan ve hızlı santrifüj (flash spin) işlemi ekleyen bu modifiye yöntemi kullanarak, serumdan yapılan bir RNA izolasyonunda küçük kodlamayan RNA'ların geri kazanımını maksimize etmenin mümkün olduğunu gösteriyoruz.

Bu tekniğin standart triol RNA izolasyon protokolü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, basit modifikasyonlar aracılığıyla serumdan elde edilen RNA verimini maksimize edebilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, küçük RNA'ların serumda düşük miktarlarda bulunması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Optimize edilmiş yöntem ve bu adımların görselleştirilmesi, bu RNA'ların geri kazanımını artıracak ve yeni başlayanları başarılı bir izolasyon İpucu'na yönlendirecektir.

Başlamak için, önceden hazırlanmış dondurulmuş serum örneğini buz üzerinde çözdürün, ardından taze çözdürülmüş serumdan 400 µL'yi etiketli bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sonra, serumu 100 µL RNase free water ile seyreltin ve 1 mg/mL konsantrasyonunda 50 µL proteinaz K ekleyin. Daha sonra, 1,5 mL tri reagent RTLS ve 100 µL four promo anole ile tam çözünürlüğü sağlamak için yeterli protein sindirimine olanak tanıyacak şekilde, seyreltilmiş serumu 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.

Homojenatı kısaca ters yüz edin ve beş saniye boyunca tekrarlı pipetleme yapın. Ardından karışımı, etiketlenmiş iki mililitrelik bir heavy phase lock tüpüne aktarın. Homojenatı 4 °C'de, 20 dakika boyunca 12.000 GS'de santrifüjleyin.

Ardından, elde edilen sulu çözeltinin bir mililitresini dikkatlice yeni bir DNA düşük bağlanma (low bind) tüpüne dekante edin. Organik faz ve ara yüzey, faz kilitleme (phase lock) tüpünün beyaz jeli altında tutulmalıdır. Daha sonra sulu çözeltiye beş mikrolitre glikojen ve 500 mikrolitre %100 isopropanol ekleyin.

Çözeltiyi tersyüz ederek karıştırın ve -20 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyunca süren inkübasyonun ardından, numuneyi 4 °C'lik bir santrifüjde 12.000 g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, berrak süpernatanı dökün ve 4 °C'lik bir santrifüjde 16.000 g'de iki dakika boyunca hızlı bir santrifüj (flash spin) işlemi gerçekleştirin.

Bir pipet kullanarak, pellet çevresindeki berrak çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırın. Ardından pellet'i bir mililitre %70 etanol ile yıkayın ve örneği 10.000 g'de 10 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. Pellet'i görüntülemek için tüpü koyu renkli bir arka plan önünde eğin ve yıkama çözeltisini boşaltın.

Yıkama işlemini tekrarlayın. Bir sonraki adıma geçin. Pelleti 10 µL RNA içermeyen su içerisinde süspande ediyoruz.

Numuneyi beş dakika boyunca 55 °C'de ısıtarak peletin tamamen çözüldüğünden emin olun. Bu süre zarfında, daha yüksek toplam RNA verim havuzu elde etmek için aynı hastadan alınan iki RNA preparasyonunu tekrarlayan pipetleme ile karıştırın. Resüspande edilen RNA'yı bir UV spektrofotometresi kullanarak niceliklendirin.

Spektrofotometre kullanın ve 2100 bioanalyzer ile RNA kalitesini değerlendirin. Ardından, havuzlanmış RNA örneklerini sonraki uygulamalarda kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. İnsan serumundan elde edilen RNA'nın spektrofotometrik profilleri, geleneksel Chomsky yöntemine eklenen birkaç adım sayesinde RNA veriminin arttığını göstermektedir.

İnsan serumundan izole edilen RNA'nın tipik UV profili; glikojen eklenmesi ve ek santrifüjleme (spin) dahil olmak üzere optimizasyon adımlarının uygulandığı profillerle karşılaştırıldığında, bu araçların her birinin kombinasyonunun kontaminantlarda azalma ve toplam RNA veriminde artışla sonuçlandığı görülmektedir. RNA örneğinin saflığı, fenol ve proteinleri hapseden bir faz kilitleme jeli (phase lock gel) kullanımıyla daha da artırılmıştır. Ayrıca, serum hacminin artırılmasının RNA verimi üzerinde belirgin bir etkisi vardır.

Numunenin kalitesini daha ayrıntılı analiz etmek için bir bioanalyzer analizi gerçekleştirilmiştir. Yaklaşık 21 nükleotitteki tek bir pik, mikro RNA fraksiyonunu temsil etmektedir; ardından prosedüre uygun olarak dizi profilleme ve QPCR işlemleri uygulanmıştır. Üç baş ve boyun kanseri ile bir normal S örneğine ait olan bu dizi profili, hiyerarşik kümeleme kullanılarak analiz edilen ve mikroRNA'ların artışı (upregulation) ile azalışının (downregulation) görülebildiği bir ısı haritası şeklinde sunulan mikroRNA ekspresyonlarını göstermektedir.

Belirli mikroRNA'lar için aşağıdaki QPCR amplifikasyon eğrileri oluşturulmuştur. Bu veriler daha sonra normal serum için ham CT değerlerini çizmek amacıyla kullanılmıştır. Uzmanlaşıldığında, prosedüre uygun şekilde yürütülmek kaydıyla, bu teknik günümüz şartlarında yüksek kaliteli RNA üreterek herhangi bir sayıda hasta üzerinde uygulanabilir. Biyobelirteç keşfi ve doğrulaması gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.