Name: Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Öğrenin tek molekül düzeyinde protein-DNA etkileşimlerini çift optik cımbız ve floresans mikroskobu kullanarak nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem, moleküler biyolojide gen regülasyonu mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz numune hazırlama ile yardım için Mikroakiskan ve Alessia Tempestini yardım için Gijs wuite, Erwin JG Peterman, ve Peter Gross teşekkür ederiz. Bu araştırma n 284.464 ° ve Ricerca 2013 RBFR13V4M2 Eğitim, Üniversite ve Araştırma FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro için İtalyan Bakanlığı ve çerçevesinde hibe sözleşmesi kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) tarafından finanse edildi Flagship Proje Nanomax.

Nanometre Stabilite ile 1. Optik Cımbız Kur Deney düzeneği% 1&#39;in altına yakalama lazer nanometre seviyesi ve yoğunluğu dalgalanmalar istikrarı işaret iki optik cımbız sağlamalıdır. Bu koşulların kombinasyonu tipik gerilim altında dambıl nanometre istikrarı sağlayacaktır (1 pN - Birkaç pN onlarca), tuzak sertlik (0.1 pN / nm) ve ölçüm bant genişliği (görüntü elde etme oranı 20 sn -1). Deney düzeneği bir şema, Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir. <ol><li> Optik cımbız tasarım ve inşaat 15,17: <ol><li> Mekanik titreşimleri azaltmak için aktif izolatörleri bir optik masaya deney cihazları monte edin. Akustik gürültüyü ve mikroskop yapının mekanik rezonans absorbe elastomerik yalıtkanları mikroskop yapıya monte edin. </li><li> R, lazer kaynağının yakınında, ayırma lazer yolunda bir optik izolatör kaydedinnedeniyle optik geribildirim rastgele genlik dalgalanmaları kent içi. </li><li> Mümkün olduğu kadar yakalama lazerin yol uzunluğunu azaltmak ve hava akımları ve türbülansa bağlı bir lazer işaret dalgalanmalarını azaltmak için bir kapalı kutu içinde bütün yolu içine alın. </li><li> Dik polarizasyonlarda iki kiriş içine: (YAG lazer, 1.064 nm dalga boyu Nd) tek bir yakın-kızılötesi lazer kaynağı bölerek çift optik cımbız oluşturun. Onlar gerilim 12 altında dambıl dalgalanmaya sebep nedeniyle zaman paylaşımlı tuzakları kullanmayın. </li><li> (En az) bir tuzak ve DNA gerginlik hassas düzenlenmesi ince hareketlerini sağlamak için Doğrudan Dijital Synthesizers (DDSS) tarafından tahrik acousto-optik deflektörlerini (AODs) kullanın. DDSS gerilim kontrollü osilatörler (VCO&#39;lar) daha iyi bir tuzak stabilite sağlar. </li><li> Alt nm hassasiyetle tuzak boncukların pozisyonunu tespit etmek için kondansatörün tekrar odak düzleminde iki kadran detektörü fotodiyotlar (QDPs) takın. </li></ol></li><li> Bu yoğunluk f edinmikroskop girişinde yakalama lazerin luctuations görüntü elde oranından daha büyük bir bant genişliğine sahip bir fotodiyot kullanılarak% 1 altındadır. </li><li> İki yakalama lazerlerin işaret istikrar Giriş: <ol><li> Fosfat tamponu içinde silika boncuk hazırlayın: silis boncuklar, 20 ul seyreltilmiş (1.54 um,% 10 katı) 1 ml aseton içine kısa bir süre, 30 saniye, vorteks sonikasyon ve santrifüj 2 dakika 19,000 x g&#39;de. 1 ml aseton ve tekrar yıkama süspanse edin. 50 mM fosfat, 1 ml tampon içinde yeniden süspanse 2 kez yıkanır ve son olarak 50 mM fosfat tamponu, 100 ul süspansiyon haline getirin. </li><li> Silis boncuklar ile optik cımbız kalibre: (yaklaşık 60 mikron kalınlığında) çift yapışkan bant kullanılarak bir mikroskop lamı bir coverslip takarak bir akış hücresi hazırlamak. 1 mg / ml BSA, akış ve 3 dakika bekleyin. Silis taneleri fosfat tamponu içinde 1/1000 seyreltilmiş Akış ve silikon gres ile akış odasını sızdırmaz. Tuzak her biri tuzağına boncuk ve güç spektrumu yöntemi 18 kullanarak tuzakları kalibre. </li&gt; <li> Pentil asetat ve nitro selüloz silika boncuk hazırlayın: silis boncuklar, 20 ul seyreltilmiş (1.54 um,% 10 katı) 1 ml aseton içine kısa bir süre, 30 saniye, vorteks sonikasyon ve santrifüj 2 dakika 19,000 x g&#39;de. 1 ml aseton ve tekrar yıkama süspanse edin. Ve pentil asetat, 1 ml içinde süspanse 2 kez yıkayın. Son olarak pentil asetat içinde çözülmüş,% 0.1 ile nitroselüloz pentil asetat bunları tekrar süspansiyon. </li><li> İkinci bir örtücü cam (60 x 24 mm) kullanılarak, bir lamel (24 x 24 mm) yüzeyi üzerine pentil asetat +% 0.1, nitroselüloz içinde çözülmüş 1,54 mikron çaplı silis boncuklar 2 ul yayıldı. Bir akış hücre oluşturmak için çift taraflı bant, iki adet kullanarak bir mikroskop lamı lamel takın. 50 mM fosfat tampon maddesi ile akış-hücre doldurun ve silikon yağı ile kapağını kapatın. </li><li> 2,000X büyütmede aydınlık görüntü mikroskopi bir silis boncuklar. Boncuk görüntü 190 p bir çapa sahip olacak şekilde görüş alanı, 768 x 576 piksel değerinde alınan 7 x 5 um olmalıdırixels. Ref. 17&#39;sinde olarak, kırınım halkaları görüntü sentroidi ve z xy pozisyonlarını hesaplar ve nm-doğruluğu ya da daha iyi bir piezo sahne hareket sürükleniyor düzeltir, bir geri bildirim yazılımı ile termal sürükleniyor dengeleyin. </li><li> Boncuk merkezi sol tuzağı orta örtü (QDP gelen xy sinyal seviyeleri kalibrasyon sırasında ölçülen aynı olması gerekir) ve pozisyon gürültü ve QDP onun standart sapmasının ölçülmesi. Doğru tuzak ölçümü tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Nanometre Doğruluk 2. Tek Molekül Yerelleştirme <ol><li> Floresan mikroskopi tasarım ve inşaat 15,19 <ol><li> Nanometre yerelleştirme doğruluğu için gerekli yüksek sinyal-gürültü oranları ulaşmak için yüksek kuantum verimliliği ve elektron-çarpılır CCD kullanın. </li><li> Bir görüntü piksel boyutu ~ 80 nm almak için optik seçin (örneğin, 16 mikron kalınlığında bir kamera piksel boyutunda bir görüntü büyütme ~ 200X). Bu suffi olduğunupixelation 8 dolayı lokalizasyon hatası ihmal Ciently küçük, ama yeterince büyük piksel başına fotonların önemli sayıda toplamak. </li><li> Uyarma kaynağı olarak ne olursa olsun, oryantasyonun bir tek kromoforların uyarılması üst düzeye çıkarmak için bir lazer (olmayan bir polarizasyon durumunu koruyan fiber optik vasıtası ile geçerek) olan ışığı polarize olmayan veya halka (bir λ / 4 dalga plakası içinden geçirilerek) polarize kullanır. </li><li> Verimli kesme hem uyarma ve tuzakla lazer ışıkları emisyon band geçiren filtreler seçin. Not: Deneylerimizde Atto532 boya ile işaretlenmiş protein ve 100 nm bant 600 nm&#39;de odaklanmış olan bant geçiş emisyon filtresi kullanılır. </li></ol></li></ol> 3. Mikroakiskan Tampon değişimi ve &#39;dambıl&#39; montaj, yani, iki optik tuzağa mikroküreler arasında tek bir DNA molekülünün ankraj, bir ısmarlama laminer kanallı akış kesin bir kontrol elde etmeksistem geliştirilmelidir. Bu, bir akış odasının, bir basınç deposu ve bir basınç kontrol sistemi (Şekil 2) tarafından tutulur. <ol><li> Akış Hücre hazırlama Not: bir protein-DNA etkileşim tek molekül deneyler için kullanılan akım odası 4 paralel tampon akımına izin vermek için fazla, tercihen 4 giriş ve çıkışa sahiptir 1, farklı deney için gerekli komponentlerden birini içeren her biri: boncuklar, DNA, protein ve görüntüleme tampon floresan etiketli. Akış kanallarında bileşenlerin ayrılması dambıl etkili düzeneğini sağlar. Ayrıca, görüntüleme kanal birkaç nanometre mertebesinde bir hassasiyette DNA bağlayıcı proteinin lokalizasyonu için gerekli olan yüksek sinyal-gürültü oranı difüzyon proteinlerden arka floresan önlemek ve elde etmek için faydalıdır. <ol><li> 4 giriş ve bir çıkış oluşturmak için bir elmas uç ile mikroskop lamı (76 x 76 x 1 mm) olarak Matkap 1 mm çaplı delikler. </li><li> Temiz inciE mikroskop etanol ile kayar ve sokulan O-ring ve erişim deliklerini çevreleyen slayt yapışkan halkası ile olan bağlantı noktası merkezi. Bu yapıştırma işlemi rahatsız olur parmak izi, önlemek için bu adımı sırasında eldiven giymek esastır. </li><li> Sürgüye NanoPorts Kelepçe ve tam bağlantıya olanak vermek üzere 1 saat boyunca 180 ° C &#39;de ısıtılmış fırında yerleştirin. </li><li> Bir kağıt parçası üzerinde akış hücresinin anahat desen çizin. Kanallar ~ 3 mm genişliğinde olmalı ve mikroskop lamı üzerine delikler konumunu eşleşmesi gerekir. </li><li> Parafilmlerin iki parça üstüne çizim yerleştirin ve bir neşter ile çizilen taslak boyunca keskin ve sürekli kesim yapmak. Oluşan herhangi bir çıkıntı çıkarın. Sadece temiz bir destek sağlamak için kullanılan Parafilm ™ alt tabaka, atın. </li><li> Ters metalik destek bağlı NanoPorts içeren bir mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Dikkatle emin th yapma, delik Parafilm odası anahat hizayaparafilm de odasının giriş ve çıkış zorla kabul ettirmek değildir. </li><li> Temizlenmiş bir mikroskop lamel (62 x 56 x 0,15 mm) ile kaplayın ve dikkatlice odayı saran aşırı Parafilm çıkarın. </li><li> Üzerinde sürekli bir basınç uygulamak için akış hücresi üzerine, daha önce 120 ° C&#39;de ısıtıldı, iki ısı blok, koyun. Parafilm yaklaşık 25 dakika boyunca erisin. </li></ol></li><li> Basınç rezervuar ve tampon kapları Basınç deposu pleksiglas (veya benzeri) imal edilmiştir ve altı tampon kapların yerleşimini mümkün olmalıdır. En az iki fazladan bir tampon kap içeren olasılığı alet rahatlığını artırır. Hava kabarcığı o şeffaf kaplar ve önemli ölçüde akış sistemi kullanımına yardımcı tüpleri ve sorun giderme unutmayın. Dalma pistonları önceden kaldırılmış olan steril ve tek kullanımlık luer kilit ucu enjektörleri (2.5 mi), iyi bir tampon kapları ve boru girişi ile kolay bir bağlantı sağlar. Emin oluntoplam sıvı hacmi, basınç haznesi, düzgün ve kararlı bir akış elde etmek için gerekli bir şart içindeki hava hacmi ile karşılaştırıldığında küçüktür. <ol><li> Deneyler sırasında açık veya kapalı tampon akışını dönüm için tampon konteynerlerin çıkışında kesme vanaları bağlayın. </li><li> Mikroskop sahnede akış hücresi monte edin. Polietereterketon boru (iç çapı ~ 150 mikron) ve flangeless parçaları ile akış odası girişlerine kapatma vanalarını bağlayın. Boru ve akış hücresinin NanoPort takımları arasında bir bağlantı olarak flor ile birleştirilmiş etilen propilen boru ~ 3 cm (iç çap ~ 500 um) ekleyin. Bu adım, camdan akış hücresi veya NanoPort ayrılma kırılmasını önlemek için bölme girişinde tampon akışını azaltmak için çok önemlidir. Geniş iç çapı borunun kullanımı, tek başına, diğer taraftan, biyolojik örneklerin büyük miktarlar gerektirecektir. </li><li> Atmosfer basıncında açık bir Falcon tüpüne akış gözü çıkışının bağlayın. Buboru akış odacığının dışına akan tampon için dizayn olarak hizmet vermektedir. </li></ol></li><li> Basınç kontrol sistemi <ol><li> Ince basınç rezervuarın içindeki hava basıncını ayarlayabilme yeteneğine sahip bir basınç kontrol sistemi kurmak. İki bilgisayar kontrollü manyetik valfler, biri 0,5 atm basınç kaynağına bağlı (kompresör) ve atmosfer basıncında, ikinci biri kullanılarak yapılabilir. Solenoid vanalar art arda artırmak veya arzu edilen bir değer ulaşana kadar hattı içindeki basıncı azaltmak için yaklaşık 7 milisaniye boyunca açılır. NOT: Bu yaklaşım Carlos Bustamante 20 uyarlanmıştır, ve bir kademeli motor şırınga pompası 21 ile daha düzgün bir akış elde edilir edildi. </li><li> Basınç haznesi üzerinde uygulanan etkili bir baskı izlemek için özel yazılmış yazılımlar tarafından kontrol edilen bir basınç dönüştürücü ekleyin. Tipik çalışma basınçları dambıl toplanma ve akış sistemi bileşenlerinin yıkamak için 200 mBar&#39;a için 20 mBar&#39;a sırasına vardır. </li></ol></li&gt; </ol> Biyotinile deoksisitidin trifosfat 4. DNA Uzantısı (biyotin-dCTP) DNA molekülü, en fazla 1 um tuzak boncuklara akışı ve ankraj altında genişlemeye yardımcı olmalıdır. Ayrıca, uzun bir DNA, DNA bağlama proteini aydınlatılması kızılötesi ışık yakalama önleyecektir. Bunun nedeni IR ışık emilimini artırır photobleaching bir heyecan kromofor sonuçlarından özel öneme sahiptir. NOT: Bu çalışmada, DNA molekülü, 3.7 um uzundu. Molekül, birincil operatör O1 üç kopya ve iki yardımcı operatörler, O2 ve O3 her birinin bir kopyasını ihtiva etmiştir. Bu diziler, bu şekilde yakalanan boncuklar ve IR lazer ışınları yaklaşık olarak eşit mesafede edilen, molekülün ortasına yerleştirilmiştir. <ol><li> Biyotin-14-dCTP, 60 pmol, 5x terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT), tampon 4 ul (1 M potasyum Ca doğrusal DNA 3&#39;-uçlarının 1 pmol karıştırıncodylate, 125 mM Tris,% 0.05 (h / h) Triton X-100, 5 mM CoCl2 20 ul bir toplam hacim) ve 1.5 ul TdT ve GKD 2 O (25 ° C&#39;de pH = 7.2). 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe karışımı. Bu DNA, ekstremite başına en fazla 60 olan nükleotidlerin eklenmesi ile sonuçlanır. 3&#39;-çıkmalar gömme veya küt uçlar daha yüksek verimlilik ile kuyruklu olduğunu DNA unutmayın. </li><li> TdT reaksiyon tamponundaki CoCl2 kaldırmak kolonlanyla veya fenol / kloroform ile ekstraksiyon ve etanol ile presipitasyondan sonra uçlu DNA ile saflaştınlır. </li><li> Saflaştırmadan sonra, DNA, bir kaç hafta veya daha uzun süreler için -20 ° C de 4 ° C&#39;de saklanır tekrarlanan erimesi ve tekrar soğutulmasından önlemek olabilir. </li></ol> 5. Etiketleme protein tiol grupları ile ATTO532 Sistein kalıntılarının modifikasyonu yoluyla Etiketleme protein aktivitesini değiştirmemesi gerekir. Bu sorunu aşmak için, bir LacI mutant LacIQ231C, yüklenebileceğini els, protein stabilitesi 22 ile karışmaz gösterilmiştir pozisyonda 231. Bu mutant pozisyonda 231 yabani tip ve kimyasal modifikasyonlar ile aynı özellikleri koruyan bir monomer başına yalnızca bir sistein taşır. NOT: Biz ATTO532 maleimidi ile protein etiketlenmiş. <ol><li> Protein 7,0-7,5 ve 2 &#39;den 10 mg / ml arasında değişen bir konsantrasyonda kadar değişen bir pH değerine sahip bir tampon içinde çözülmüş olduğundan emin olun. Not: Bu deneylerde, Lacl potasyum fosfat, 0.3 M,% 5 glukoz, pH 7.5 (tampon A) içinde eritildi. </li><li> Çözündürülür Tris (2-karboksietil) H2O içinde 100 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar fosfin hidroklorür (TCEP); TCEP çözüm kullanmak için önce taze hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Dikkatli bir şekilde 3 ul TCEP ve vorteks ile proteinin 100 ul karıştırın. </li><li> Düşük ışık koşullarında çalışan, 10 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar N, N-dimetilformamid (DMF) içerisinde boya çözülür. Vortex kadar tamamen eriyene. </li><li> Tepki miX: dikkatlice protein + TCEP ve vorteks boyanın 33 ul ekle. Hızlı eğirme mümkün olduğu kadar fazla çözelti toplamak. </li><li> 20 ° C&#39;de bir çalkalayıcı (8.000 rpm) 2 saat boyunca reaksiyon karışımı inkübe (ya da 4 ° CO / G), ışıktan koruyarak. </li><li> L-glutatyon H2O içinde 100 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona (GSH) çözülür Reaksiyon karışımı 3 ul ve 15 dakika boyunca 8,000 rpm&#39;de çalkalayıcı içinde inkübe edilir. GSH tiyol gruplarının bloke reaktivitesi ile reaksiyonu durdurulur. </li><li> Standart jel filtrasyon sütunları, diyaliz veya sıkma konsantratörü kullanarak etiketli proteini arındırın. NOT: Bu deneylerde, etiketli Lacl 10 kDa kesme konsantratörleri sıkma kullanılarak saflaştırıldı. <ol><li> 8,000 xg, 1 saat, 4 ° C &#39;de, tampon A en fazla 12 ml tepkime karışımı seyreltik yoğunlaştırıcı cihaza uygulamak ve santrifüjlenir. LacI etiketli, böylece, yaklaşık 500 ul bir son hacme kadar konsantre edildi ve fazla boya flo membran iletirw-ile. Flow-through ve adımı tekrarlayın 5.8.1 en az üç kez atın. </li></ol></li><li> -80 ° C&#39;de küçük parçalar ve deposuna etiketlenmiş bir protein bölün. Tekrarlanan donma ve çözülme kaçının. </li></ol> 6. Kombine Optik Yakalama ve Tek-molekül Floresans Görüntüleme Deneyler <ol><li> Tampon kaplara tampon A içinde 1 ml ilave edilir ve bağlantı boruları yıkama ve akış hücresinin 200 mbar&#39;lık basınç altında uygulanır. DNA, burada ve aşağıdaki adımlardan in bağlayıcı proteinin difüzyonunu maksimize etmek için, A, düşük iyonik güçlü tamponla ikame edilebilir tampon. Not: Bu deneylerde, TBE 0.5x ikinci. </li><li> Akış düzgünlüğü kesebileceği hava kabarcıklarının varlığı, kontrol edin. Çıkış borusu üzerinde nazik bir fiske kalan kabarcıklarını çıkarmak için yardımcı olacaktır. </li><li> 20 mBar&#39;a basıncı azaltmak ve tüm kanallar ve tüpler hava kabarcıkları açık ve tampon tüm kanallarda benzer hızlarla akar doğrulayın. </li><li>300 ul son hacim olması için numunelerin hazırlanması: streptavidin kaplı polistiren taneleri 1.87 um; Bölüm 4 uyarınca her iki ekstremitelerde biyotinikasyon lineer DNA, 20UM; LacI tetramer 300 pM bölüm 5&#39;e göre ATTO532 etiketlenmiştir. </li><li> Aşağıdaki sırayla şırınga kapların biri her numune ekleyin: boncuk görüntüleme tampon tek (tampon A + oksijen tutucu sistemi) ve dördüncü kanal etiketli protein ile ikinci, üçüncü kanal birinci kanalın, DNA&#39;da konumlanmıştır. </li><li> 3 dakika için 200 mbar&#39;da akışını açın numuneler bir akış kanalı içine gelmesi izin vermek. Ardından 20 mBar&#39;a basıncı azaltmak. </li><li> Parlak bir alan aydınlatma altında ilk kanalını görüntüleme iken, iki optik cımbız açmak ve her tuzak içinde bir polistiren boncuk yakalamak. </li><li> Diğer boncuklar tuzaklarına düşmek önlemek için ikinci kanala hızlı hareket ettirin. DNA kanal varış boncuk akışının sonuna kolayca fark olduğuna dikkat edin. </li><li> O kullanmaNE AOD iki optik tuzak halkalar arasında akış uzatılmış DNA bağlanmasına olanak sağlamak için ileri ve geri diğer kordonun yakınında bir tuzak (boncuk) hareket eder. Bir DNA dambıl oluşturulduğunda, statik boncuk etkin ileri-geri hareket ettirildiği tuzak kordonun hareketini takip başlar. </li><li> Tampon kanala hızlı hareket ve tampon akışını kapatın. Tek bir DNA molekülünün varlığını doğrulamak üzere bir kuvvet-uzama eğrisi analizi 4,23-25 ​​gerçekleştirin. Birden fazla molekülün mevcut olmadığı takdirde, ve adım atmak dambıl 6,7 yeniden başlar (örneğin, kuvvet-uzama eğrisinin faz yükselterek entalpi, DNA kontur uzunluğundan daha kısa bir uzunlukta oluşur). </li><li> Tek bir DNA dambıl elde edildikten sonra tekrar akışını açın ve protein kanala dumbbell taşıyın. DNA ile etiketlenmiş-LacI&#39;daki etkileşimini izlemek için geniş alan floresan mikroskobu geçin. Akışını kapatın ve satın alma başlar. </li></ol>

<ol><li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li>
<li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms%2C+one+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li>
<li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+chemistry+chemical+physics+%3A+PCCP%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor%2C+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Son on yılda, tek bir molekül manipülasyon ve görüntüleme teknikleri mekansal ve zamansal çözünürlük açısından büyük bir ilerleme gördük. Manipülasyon ve görüntüleme teknikleri kombinasyonu artık örneğin DNA, RNA ya da hücre iskeleti lifleri gibi tek bir canlı polimerin mekanik koşulların kontrolünü sağlayan güçlü araçlar tabanı ve aynı polimer ile etkileşen proteinlerin tek devamlı yer olduğunu . Tuzak polimerin mekanik koşullarını kontrol özellikle tercih edilir. Aslında, canlı hücreler içinde, nükleik asitler sürekli...

Tek molekül (SM) teknikleri büyük ölçüde geleneksel, toplu çözüm ölçümler 1-3 bazı sınırlamaları aşmanın ihtiyaca cevap verecek son otuz yılda geliştirdik. Tek bir biyolojik moleküllerin manipülasyon Biyopolimerlerin 4 mekanik özelliklerini ölçmek ve protein-protein 5 ve protein-DNA etkileşimleri 6,7 mekanik parametrelerini kontrol etme fırsatı yaratmıştır. SM floresans saptama, diğer taraftan, lokalize ve nanometre hassasiyetle tek mölekülleri izleme olasılığına yol açan, in vitro ve in vivo olarak protein aktivitesini incelemek için son derece çok yönlü bir araç temsil eder. SM görüntü enstrüman nokta-yayılma-fonksiyonu takılması sayesinde, aslında, bir hassas sinyal-gürültü oranı (SNR) esas olarak ve yaklaşık bir nanometre 8,9 sınırı ulaşan lokalizasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bu metodolojiler güçlü buluyorummotor proteinlerinin aktif halde dinamikleri çalışma uygulamaları yanı sıra, DNA-bağlama proteinleri hedef arama altında yatan difüzyon prosesleri. Hedef bir DNA dizisinin bir fonksiyonu bekleme süresi olarak difüzyon katsayılarının hesaplanmasına ve doğru bir tek boyutlu difüzyon olaylar sırasında incelenmiş DNA uzunluk ölçme özelliği, bir protein-DNA etkileşim dinamikleri çalışma ve araştırma için güçlü bir araç temsil eder Belirli hedef arama mekanizmaları. Son zamanlarda, bu iki tekniğin bir kombinasyonu, örneğin (örneğin bir tel ya da aktin bir DNA molekülü) bir karşılıklı etkileşim eşinin enzimin ve bulma / lokalizasyonu biyolojik bir alt-tabakanın aynı anda işleme ortamı deney düzeneğinde, 10-14 yeni nesil (üretti miyozin ya da bir DNA-bağlama proteini). Bu tekniklerin avantajları başta böylece ena, tuzağa polimer üzerinde mekanik kontrol uygulamakla olasılığı dinlenmekuvvetleri veya momentleri karşı etkileşim dinamikleri çalışma bling. Ayrıca bu yöntem, klasik yöntemler SM, yani bir yüzey üzerinde çalışılan moleküllerin immobilizasyonu için ihtiyacı (cam slayt, ya da mikro-) ana sınırlamalarının kaçınarak yüzeyden uzak biyokimyasal reaksiyonları ölçülmesine imkan verir. İki tekli moleküller tekniklerin kombinasyonu özellikle mekanik stabilite ve 15 (özellikle nm hassasiyet ile yerelleştirme gerektiren) yeterli SNR şartlarından doğan, çeşitli teknik zorlukların üstesinden gerektirir. Optik cımbız, gürültü azaltma ile SM floresens bağlanması ve bindirme kızılötesi lazer 16 ve biyolojik komplekslerinin düzeneği ve deneysel ölçümler 11 yapılması için biyokimyasal tamponların denetimi ışıkla Özellikle zaman, büyük önem taşımaktadır. İşte, başarılı performans için yöntemleri tarifBir çift hapsi / SM Floresans yerelleştirme kurulum ölçümleri. Metodoloji, spesifik LacI bağlayıcı dizileri (yani, operatörler) ihtiva eden laktoz represör proteini (Lacl) floresan (Atto532) ile etiketlenmiş ve (iki optik cımbız arasında sıkışan) bir DNA molekülüne bağlanan olarak algılanan bir örnekle gösterilmiştir. Bu hedef arama işleminin kontum boyunca DNA ve difüzyona LacI bağlayıcı tespit yönteminin etkinliğini göstermektedir. Bu yöntem, DNA dizisi, DNA bağlama proteini, herhangi bir kombinasyonu gibi başka sistemler (mikrotübüllerin veya aktin filamentler ve onlarla etkileşim motor proteinlerinin) için de geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>Elastomerik izolatörler</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Mikroskop ağırlığına ve rezonans frekanslarına bağlı olarak uygun Newdamp elastomeri seçin</td></tr><tr><td>Optik izolatör</td><td>Araştırma için Optik</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG lazer, 1.064 nm dalga boyu</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Akusto-optik deflektörler (AOD'ler)</td><td>A& A optoelektronik</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Doğrudan Dijital Sentezleyiciler</td><td>Analog Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kadran dedektörü fotodiyotlar</td><td>OSI optoelektronik</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>DIO ve FPGA kartı</td><td>Ulusal Aletler</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>Halojen lamba</td><td>Schott</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Kondenser</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td><td></td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA suya daldırma</td><td></td></tr><tr><td>532 nm lazer</td><td>Tutarlı</td><td>Safir</td><td></td></tr><tr><td>CCD 200X ve 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>Elektronla Çoğaltılmış CCD</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Piezo aşaması ile nm hassasiyetli</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon</td><td>Filtresi Chroma Technologies</td><td>600 / 100m</td><td></td></tr><tr><td>Silika boncuklar (1.54 mm)</td> <td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N / 5303</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serumundan albümin (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Pentil asetat ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Yanıcı sıvı ve buhar (No 1272/2008)</td></tr> <tr><td>Nitroselüloz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Yanıcı katı&nbsp; (Sayı 1272/2008)</td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>, 2 çıkarılabilir bloklu; 120 ° C'de önceden ısıtılmış; C</td></tr><tr><td>NanoPort montajları</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Polietereterketon boru & nbsp;</td><td>Upchurch Bilimsel A.Ş.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr>Pleksiglas <td></td><td></td><td></td>Luer kilit uçlu şırıngalardan<td>yapılmış akış odası basınç rezervuarının montajı için ev yapımı metalik tutucu</td></tr><tr><td>2.5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Kapatma vanaları&nbsp;</td><td>Upchurch Bilimsel A.Ş.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Flanşsız bağlantı parçaları&nbsp;</td><td>Upchurch Bilimsel A.Ş.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Florlu etilen propilen boru&nbsp;</td><td>Upchurch Bilimsel A.Ş.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>İki bilgisayar kontrollü solenoid valf</td><td>Clippard, Cincinnati, ABD</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Basınç dönüştürücü</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Terminal deoksinükleotidil Transferaz (TdT)</td> <td>Termobilimsel</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamid (DMF) &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Yanıcı Sıvı, Cilt emilimi ile zararlıdır. Tahriş edici, teratojen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280; P305; P351; P338; P311</td></tr><tr><td>Tris-(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatyon azaltılmış (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Akut toksisite, Oral (Kategori 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membran, 10&nbsp; kDa kesme spin yoğunlaştırıcıları</td><td>Merck Millipore UFC901024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin kaplı polistiren boncuklar 1.87 & mikro; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>Kıdemli Başkan Yardımcısı-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-dna etkileşiminin Çalışmaları tek molekül manipülasyon ve görüntüleme birleştiren

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Makale, protein-DNA etkileşiminin incelenmesi için optik cımbız ve tek moleküllü floresan tespitinin kombinasyonunu açıklamaktadır. Yöntem, çözelti içinde meydana gelen etkileşimleri araştırma (böylece diğer tek moleküllü yöntemlerde olduğu gibi yakın yüzeylerden kaynaklanan sorunlardan kaçınma), DNA uzantısını kontrol etme ve hem mekanik parametrelerin hem de DNA dizisinin bir fonksiyonu olarak etkileşim dinamiklerini izleme fırsatı sunar. Tek moleküllerin başarılı optik yakalama ve nanometre lokalizasyonu oluşturma yöntemleri gösterilmektedir. Atto532 ile etiketlenmiş laktoz baskılayıcısının (lacI) LacI bağlanması için spesifik hedef diziler (operatörler) içeren bir DNA molekülü ile etkileşiminin incelenmesine izin veren deneysel koşulları gösteriyoruz. Yöntem, operatörlerde belirli etkileşimlerin gözlemlenmesinin yanı sıra, hedef arama işlemi sırasında proteinin tek boyutlu difüzyonuna izin verir. Yöntem, protein-DNA etkileşimlerinin incelenmesine geniş ölçüde uygulanabilir, ancak aynı zamanda ortak iz polimerine (örneğin aktin veya mikrotübüller) uygulanan gerilimin kontrolünün arzu edildiği moleküler motorlara da uygulanabilir.

Başarılı bir deneyde, tek bir (veya daha fazla) etiketli proteinler, DNA molekülü (Şekil 3A) boyunca / Unbinding ve / veya difüzyon bağlama monodimensional tabi tutulur. DNA molekülü boyunca protein lokalizasyonu DNA dizisinin bir fonksiyonu olarak kinetik parametrelerin ölçümü sağlar. 1D difüzyon neden tampon koşulları uygulandığında, bu difüzyon katsayısı D 1D örneğin protein yörüngeleri takip ve tespit etmek mümkündür. Tek bir nokta hassas pozisyon, her karede,...

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Bu prosedürün genel amacı, tek bir DNA bağlayıcı protein ile bir DNA molekülü arasındaki dinamik etkileşimi gözlemlemektir. Bu, özel olarak tasarlanmış bir mikroskopta iki tek molekül tekniğinin, çift optik cımbız ve floresan mikroskopisinin birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Bu düzenek ayrıca, görselleştirme ve örneğin nanometre düzeyinde stabilizasyonu için parlak alan aydınlatması ile donatılmıştır.İkinci adım olarak, deney için gerekli tüm bileşenlerin verimli bir şekilde çağrılmasına ve bir araya getirilmesine olanak tanımak amacıyla, mikro akış sistemine entegre edilmiş çok kanallı bir akış hücresi inşa edilir. Ardından, deneyleri gerçekleştirmek için tek moleküllü yapı kurulur. İlk olarak, iki şerit titin kaplı mikroküre, ilk kanaldaki çift optik cımbızla yakalanır.Ardından, her iki uçtan biyotin ile işaretlenmiş DNA şablonunun bağlanmasını sağlamak için hapsedilmiş iki boncuk ikinci kanala taşınır. Tek bir DNA molekülünün varlığı, üçüncü kanalda bir DNA kuvvet uzama analizi ile kontrol edilir. Son olarak, DNA dambılı olarak adlandırılan boncuk-DNA-boncuk yapısı, floresan işaretli laktoz baskılayıcı proteinin bulunduğu protein kanalına taşınır.Tek bir gerilmiş DNA molekülü üzerinde tekil LAC eye moleküllerinin difüzyonu ve spesifik bağlanması ile LAC eye hareketinin kinetik parametrelerinin nicelendirilmesini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin mevcut tek molekül yöntemlerine göre temel avantajları, yeni moleküle uygulanan gerilimin kontrol edilebilme imkanı, bağlanan proteinlerin hareketlerinin nanometre düzeyinde kararlı bir noktada hassas bir şekilde izlenebilmesi ve lam yüzeyinden uzakta çalışabilme yeteneğidir. Bu yöntem, protein-DNA etkileşimleri, özellikle gen ekspresyonu regülasyonunun mekaniği ve hedef arama mekanizmalarındaki proteinlerin DNA boyunca difüzyon dinamikleri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntemin gösterimi, akış hücresi numune işlemenin pratik yönlerini ve DNA boncuk yapısının kurulumunu göstermek açısından oldukça faydalıdır. Bu video, öncelikle bir lam yüzeyine yapışmış mikro boncukları referans olarak kullanarak, iki tuzaklama lazerinin odak kararlılığının nasıl kontrol edileceğini gösterecektir. Optik cımbız düzeneğinin tasarımı ve kurulumuna ilişkin ayrıntılar, beraberindeki protokol metninde bulunabilir.24 by 60 milimetre boyutundaki bir lamel kullanarak, iki mikrolitre silika boncuğunu 24 by 32 milimetre boyutundaki bir lamelin yüzeyine yayın. İki parça çift taraflı bant kullanarak, 24 by 32 milimetrelik lameli bir mikroskop lamı üzerine yapıştırarak bir akış hücresi oluşturun.Akış hücresini 50 millimolar fosfat tamponu ile doldurun ve silikon gres ile sızdırmaz hale getirin image. Aydınlık alan mikroskobunda yaklaşık 2000 kat büyütmede tek bir silika boncuk. Görüş alanı, boncuk görüntüsünün çapı yaklaşık 190 piksel olacak şekilde 768 x 576 pikselde elde edilmiş yaklaşık yedi çarpı beş mikrometre olmalıdır; termal kaymaları, XY konumunu görüntü merkezinden ve Z konumunu difraksiyon halkalarından hesaplayıp kaymaları düzelten bir geri besleme yazılımı ile telafi edin.Nanometre hassasiyetinde veya daha iyisiyle bir piezo sahneyi hareket ettirerek sol tuzağın merkezini boncuk merkeziyle çakıştırın ve kuadrant dedektör fotodiyottan (QDP) konum gürültüsünü ve bunun standart sapmasını ölçün. Ölçümü sağ tuz için tekrarlayın; akış hücresini oluşturmak için DNA bağlayıcı proteinlerin hassas lokalizasyonuna izin verecek şekilde, konum gürültüsünün standart sapması birkaç nanometre dahilinde olmalıdır.Öncelikle, dört giriş ve bir çıkış oluşturmak için 76 x 76 x 1 mm boyutlarındaki bir mikroskop lamı üzerinde elmas uçla bir milimetre çapında delikler açılır. Bu işlem, dört paralel tampon çözelti akışına olanak tanıyacaktır.Her biri deney için gerekli farklı bileşenlerden birini (boncuklar, floresan işaretli DNA proteini ve görüntüleme tamponu) içeren tüpler hazırlayın. Mikroskop lamını etanol ile temizleyin ve portu, O-ring takılıyken ve yapışkan halka lam üzerindeki erişim deliklerini çevreleyecek şekilde merkezleyin. Parmak izlerinin yapıştırma işlemini bozmasını önlemek için bu adım sırasında eldiven takılması esastır.İkinci bir lam tutucu yardımıyla nano portları lama sabitleyin ve tam yapışmayı sağlamak için lamı 180 °C'ye önceden ısıtılmış bir fırında bir saat bekletin. Bu sırada, akış hücresinin dış hat şablonunu bir kağıda çizin. Kanal yaklaşık üç milimetre genişliğinde olmalı ve mikroskop lamı üzerindeki tüm konumlarla uyumlu olmalıdır.Çizimi iki adet profilin üzerine yerleştirin ve bir skalpel yardımıyla, çizilen ana hat boyunca keskin ve sürekli kesikler yapın. Oluşan çıkıntıları temizleyin; sadece temiz bir destek sağlamak amacıyla kullanılan alt parfüm tabakasını atın. Ardından, ekli nano portları içeren mikroskop lamını metal desteğe ters şekilde yerleştirin.Parafilm hazne hattını deliklerle dikkatlice hizalayın; parafilmin, temizlenmiş bir mikroskop lamel ile kapatılmış hazne kapağının giriş ve çıkışlarının dışına taşmadığından emin olun ve hazne çevresindeki fazla parafilmi dikkatlice temizleyin. Akış hücresine homojen basınç uygulamak için üzerine önceden 120 °C'de ısıtılmış iki ısı bloğu yerleştirin. Parafilmin yaklaşık 25 dakika boyunca erimesini bekleyin.Bir sonraki adım, basınç rezervuarının ve tampon çözelti kaplarının hazırlanmasıdır. Pleksiglastan imal edilen basınç rezervuarı, altı adede kadar tampon çözelti kabının yerleştirilmesine olanak tanır. İlk olarak, tampon çözelti akışını vana kolu dikey konumdayken açmak veya saat yönünde döndürülmüş konumdayken kapatmak için tampon çözelti kaplarının çıkışındaki kapatma vanalarını bağlayın.Deneyler sırasında, akış hücresini mikroskop tablasına monte edin. Ardından, kapatma valflerini poli eter eter keton veya PEEK borularla, flanşsız bağlantıları ise akış odası girişlerine bağlayın. PEEK borular yaklaşık 150 µm iç çapa sahiptir; PEEK borular ile akış hücresinin nano port düzenekleri arasında bağlantı olarak yaklaşık 500 µm iç çapında, yaklaşık 3 cm uzunluğunda florlanmış etilen propilen borular kullanılır.Bu işlem, akış hücresinin kırılmasını veya nano portun camdan ayrılmasını önlemek için oda girişindeki tampon akışını azaltmak adına gereklidir. Öte yandan, yalnızca geniş iç çaplı tüplerin kullanılması, çok büyük hacimlerde biyolojik örnekler gerektirecektir. Akış odası çıkışını, atmosferik basınçtaki açık bir Falcon tüpüne bağlayın.Bu tüp, akış odasından dışarı çıkan tampon çözelti için atık tüpü görevi görür. Bu prosedüre başlamak için, her bir tampon çözelti kabına 1 mL tampon A ekleyin ve bağlantı tüplerini ve akış hücresini yıkamak için 200 mbar basınç uygulayın. Bir basınç kontrol sistemi kullanılabilir.Son olarak, basınç rezervuarının içindeki hava basıncını ayarlayın. Akış pürüzsüzlüğünü bozabilecek hava kabarcıklarının varlığını kontrol edin. Çıkış tüpüne hafifçe vurmak kalan kabarcıkların uzaklaştırılmasına yardımcı olacaktır; basıncı 20 millibara düşürün ve tüm kanal ile tüplerin hava kabarcıklarından arındırıldığını ve tamponun tüm kanallarda benzer hızlarda aktığını doğrulayın.Numuneleri 300 microliters nihai hacme hazırlayın. Bu deneyde strept kaplı polistiren boncuklar, laktoz represör bağlanması için spesifik hedef diziler içeren her iki uçtan biyotinillenmiş lineer DNA ve floresan işaretli laktoz represör proteini kullanılmaktadır. Her bir numuneyi şırınga kaplarından birine şu sırayla ekleyin: birinci kanala boncuklar, ikinciye DNA, üçüncüye görüntüleme tamponu ve dördüncü kanala işaretli protein.Akışı 20 millibar seviyesinde açın ve örneklerin akış kanalının içine ulaşmasını sağlamak için kapatma vanalarını açın. Bu durum, boncuk kanalında kolayca tespit edilebilir. İlk kanalı parlak alan aydınlatması altında görüntülerken, iki optik cımbızı çalıştırın ve her bir tuzağa bir polistiren boncuk yakalayın.Diğer boncukların tuzaklara düşmesini önlemek için hızlıca ikinci kanala geçin. DNA kanalına varışın, boncuk akışının sona ermesiyle kolayca fark edilebileceğini unutmayın. Bir AO optik deflektör veya OD hareketi kullanarak, akışla uzatılmış DNA'nın optik olarak tuzaklanmış iki boncuk arasında tutunmasını sağlamak için, bir tuzak boncuğu diğer boncuğun yakınında ileri geri hareket ettirin.Bir DNA dambılı oluştuğunda, statik boncuk, tuzak tarafından aktif olarak ileri geri hareket ettirilen boncuğun hareketini takip etmeye başlar. Hızla tampon kanalına geçin ve tampon akışını kapatın. Tek bir DNA molekülünün varlığını doğrulamak için kuvvet-uzama eğrisi analizi gerçekleştirin.Bu işlem, DNA gerilimi ölçülürken iki boncuğun birbirinden ayrılarak gerçekleştirilir. Tek bir DNA dambılı elde edildiğinde, akışı tekrar açın ve dambılı protein kanalına taşıyın. Etiketli laktoz represör proteinin DNA ile etkileşimini izlemek için geniş alan floresan mikroskobuna geçin, akışı kapatın ve görüntüleme işlemini başlatın.Bu yöntem, gerilmiş bir DNA molekülü ile etkileşime giren tekil laktoz represör veya lacI moleküllerinin tespit edilmesini sağlar. Bu temsili şemada, bir lacI molekülü spesifik olmayan DNA dizileri boyunca difüze olurken, diğer bir lacI molekülü DNA molekülünün merkezinde yer alan bir operatöre spesifik olarak bağlanmıştır. Bu grafik, iki tuzak merkezini birbirine bağlayan yön boyunca iki lacI molekülünün konumunu göstermektedir.Moleküllerin konumları, zamana bağlı olarak radyal simetri merkezi algoritması ile belirlenmiştir; burada, gerilmiş bir DNA molekülü boyunca difüzyona uğrayan tek bir lacI molekülü için ortalama kare yer değiştirmenin (MSD) zamana karşı grafiği gösterilmektedir. Proteinin difüzyon katsayısı, verilerin doğrusal regresyonu ile kolayca elde edilebilir. Manipülasyon ve görüntüleme tekniklerinin kombinasyonu; DNA, RNA veya bir hücre iskeleti filamanı gibi tek bir biyolojik polimer üzerinde mekanik kontrol ve bu polimerle etkileşime giren tekil protein moleküllerinin eş zamanlı lokalizasyonuna olanak tanıyan güçlü bir yöntemdir.Bu Prosedür uygulanırken, tek molekül manipülasyonu ve görüntüleme tekniklerinin birleştirilmesinin, askıdaki polimerin nanometre düzeyinde stabilitesini sağlamak için deneysel düzeneğin dikkatli bir şekilde tasarlanmasını gerektirdiğini hatırlamak önemlidir. Öte yandan, tuzağı oluşturan G lazeri ile floresan prob arasında spektral ayrımı garanti altına almak için biyolojik probun uygun şekilde tasarlanması gerekir. Ayrıntılar için lütfen beraberindeki protokol metnine bakınız.Bu videoyu izledikten sonra, iki optik hızlı vuruş arasına DNA molekülünün nasıl monte edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yapının montajı, detaylı açıklamasını sunduğumuz çok kanallı akış hücresi ile daha iyi gerçekleştirilir. Ayrıca, tampon akışının nasıl optimize edileceğini ve aksi takdirde deneylerinizi riske atabilecek hava kabarcıklarının nasıl giderileceğini de belirttik.Birleştirilmiş metin protokolünde, streptavidin kaplı boncuklarla birleştirme için gerekli olan DNA'nın bioTE ile işaretlenmesi protokollerinin yanı sıra proteinlerin işaretlenmesine yönelik protokolleri bulabilirsiniz. Son olarak, tek bir laktoz baskılayıcı proteinin bir DNA molekülü üzerindeki bağlanmasının ve difüzyonunun miktarını belirlemek için gerçekleştirilen adım adım işlemleri örneklendirdik.

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Burada, DNA üzerinde birleşen EWS-FLI1 kondensatlarının biyofiziksel mekanizmasını incelemek için tek moleküllü görüntüleme yöntemi olan DNA Perdeleri'nin kullanımını açıklıyoruz.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Optik bir tuzakta yerinde tutulan doğrusal DNA molekülleri üzerindeki floresan etiketli, tamamen yeniden yapılandırılmış Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) helikazının hareketini doğrudan görüntülemek ve ölçmek için hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz.

Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Bu protokol, optik foton yeniden atamalı olan dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak derin, tam hücre tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) uygulanma prosedürünü özetler; böylece özel optik veya karmaşık aydınlatmaya ihtiyaç olmadan DNA-PAINT görüntüleme mümkün olur.

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Öğrenin tek molekül düzeyinde protein-DNA etkileşimlerini çift optik cımbız ve floresans mikroskobu kullanarak nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem, moleküler biyolojide gen regülasyonu mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Daha fazla video keşfet