Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Bu prosedürün genel amacı, tek bir DNA bağlayıcı protein ile bir DNA molekülü arasındaki dinamik etkileşimi gözlemlemektir. Bu, özel olarak tasarlanmış bir mikroskopta iki tek molekül tekniğinin, çift optik cımbız ve floresan mikroskopisinin birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Bu düzenek ayrıca, görselleştirme ve örneğin nanometre düzeyinde stabilizasyonu için parlak alan aydınlatması ile donatılmıştır.

İkinci adım olarak, deney için gerekli tüm bileşenlerin verimli bir şekilde çağrılmasına ve bir araya getirilmesine olanak tanımak amacıyla, mikro akış sistemine entegre edilmiş çok kanallı bir akış hücresi inşa edilir. Ardından, deneyleri gerçekleştirmek için tek moleküllü yapı kurulur. İlk olarak, iki şerit titin kaplı mikroküre, ilk kanaldaki çift optik cımbızla yakalanır.

Ardından, her iki uçtan biyotin ile işaretlenmiş DNA şablonunun bağlanmasını sağlamak için hapsedilmiş iki boncuk ikinci kanala taşınır. Tek bir DNA molekülünün varlığı, üçüncü kanalda bir DNA kuvvet uzama analizi ile kontrol edilir. Son olarak, DNA dambılı olarak adlandırılan boncuk-DNA-boncuk yapısı, floresan işaretli laktoz baskılayıcı proteinin bulunduğu protein kanalına taşınır.

Tek bir gerilmiş DNA molekülü üzerinde tekil LAC eye moleküllerinin difüzyonu ve spesifik bağlanması ile LAC eye hareketinin kinetik parametrelerinin nicelendirilmesini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin mevcut tek molekül yöntemlerine göre temel avantajları, yeni moleküle uygulanan gerilimin kontrol edilebilme imkanı, bağlanan proteinlerin hareketlerinin nanometre düzeyinde kararlı bir noktada hassas bir şekilde izlenebilmesi ve lam yüzeyinden uzakta çalışabilme yeteneğidir. Bu yöntem, protein-DNA etkileşimleri, özellikle gen ekspresyonu regülasyonunun mekaniği ve hedef arama mekanizmalarındaki proteinlerin DNA boyunca difüzyon dinamikleri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemin gösterimi, akış hücresi numune işlemenin pratik yönlerini ve DNA boncuk yapısının kurulumunu göstermek açısından oldukça faydalıdır. Bu video, öncelikle bir lam yüzeyine yapışmış mikro boncukları referans olarak kullanarak, iki tuzaklama lazerinin odak kararlılığının nasıl kontrol edileceğini gösterecektir. Optik cımbız düzeneğinin tasarımı ve kurulumuna ilişkin ayrıntılar, beraberindeki protokol metninde bulunabilir.

24 by 60 milimetre boyutundaki bir lamel kullanarak, iki mikrolitre silika boncuğunu 24 by 32 milimetre boyutundaki bir lamelin yüzeyine yayın. İki parça çift taraflı bant kullanarak, 24 by 32 milimetrelik lameli bir mikroskop lamı üzerine yapıştırarak bir akış hücresi oluşturun.

Akış hücresini 50 millimolar fosfat tamponu ile doldurun ve silikon gres ile sızdırmaz hale getirin image. Aydınlık alan mikroskobunda yaklaşık 2000 kat büyütmede tek bir silika boncuk. Görüş alanı, boncuk görüntüsünün çapı yaklaşık 190 piksel olacak şekilde 768 x 576 pikselde elde edilmiş yaklaşık yedi çarpı beş mikrometre olmalıdır; termal kaymaları, XY konumunu görüntü merkezinden ve Z konumunu difraksiyon halkalarından hesaplayıp kaymaları düzelten bir geri besleme yazılımı ile telafi edin.

Nanometre hassasiyetinde veya daha iyisiyle bir piezo sahneyi hareket ettirerek sol tuzağın merkezini boncuk merkeziyle çakıştırın ve kuadrant dedektör fotodiyottan (QDP) konum gürültüsünü ve bunun standart sapmasını ölçün. Ölçümü sağ tuz için tekrarlayın; akış hücresini oluşturmak için DNA bağlayıcı proteinlerin hassas lokalizasyonuna izin verecek şekilde, konum gürültüsünün standart sapması birkaç nanometre dahilinde olmalıdır.

Öncelikle, dört giriş ve bir çıkış oluşturmak için 76 x 76 x 1 mm boyutlarındaki bir mikroskop lamı üzerinde elmas uçla bir milimetre çapında delikler açılır. Bu işlem, dört paralel tampon çözelti akışına olanak tanıyacaktır.

Her biri deney için gerekli farklı bileşenlerden birini (boncuklar, floresan işaretli DNA proteini ve görüntüleme tamponu) içeren tüpler hazırlayın. Mikroskop lamını etanol ile temizleyin ve portu, O-ring takılıyken ve yapışkan halka lam üzerindeki erişim deliklerini çevreleyecek şekilde merkezleyin. Parmak izlerinin yapıştırma işlemini bozmasını önlemek için bu adım sırasında eldiven takılması esastır.

İkinci bir lam tutucu yardımıyla nano portları lama sabitleyin ve tam yapışmayı sağlamak için lamı 180 °C'ye önceden ısıtılmış bir fırında bir saat bekletin. Bu sırada, akış hücresinin dış hat şablonunu bir kağıda çizin. Kanal yaklaşık üç milimetre genişliğinde olmalı ve mikroskop lamı üzerindeki tüm konumlarla uyumlu olmalıdır.

Çizimi iki adet profilin üzerine yerleştirin ve bir skalpel yardımıyla, çizilen ana hat boyunca keskin ve sürekli kesikler yapın. Oluşan çıkıntıları temizleyin; sadece temiz bir destek sağlamak amacıyla kullanılan alt parfüm tabakasını atın. Ardından, ekli nano portları içeren mikroskop lamını metal desteğe ters şekilde yerleştirin.

Parafilm hazne hattını deliklerle dikkatlice hizalayın; parafilmin, temizlenmiş bir mikroskop lamel ile kapatılmış hazne kapağının giriş ve çıkışlarının dışına taşmadığından emin olun ve hazne çevresindeki fazla parafilmi dikkatlice temizleyin. Akış hücresine homojen basınç uygulamak için üzerine önceden 120 °C'de ısıtılmış iki ısı bloğu yerleştirin. Parafilmin yaklaşık 25 dakika boyunca erimesini bekleyin.

Bir sonraki adım, basınç rezervuarının ve tampon çözelti kaplarının hazırlanmasıdır. Pleksiglastan imal edilen basınç rezervuarı, altı adede kadar tampon çözelti kabının yerleştirilmesine olanak tanır. İlk olarak, tampon çözelti akışını vana kolu dikey konumdayken açmak veya saat yönünde döndürülmüş konumdayken kapatmak için tampon çözelti kaplarının çıkışındaki kapatma vanalarını bağlayın.

Deneyler sırasında, akış hücresini mikroskop tablasına monte edin. Ardından, kapatma valflerini poli eter eter keton veya PEEK borularla, flanşsız bağlantıları ise akış odası girişlerine bağlayın. PEEK borular yaklaşık 150 µm iç çapa sahiptir; PEEK borular ile akış hücresinin nano port düzenekleri arasında bağlantı olarak yaklaşık 500 µm iç çapında, yaklaşık 3 cm uzunluğunda florlanmış etilen propilen borular kullanılır.

Bu işlem, akış hücresinin kırılmasını veya nano portun camdan ayrılmasını önlemek için oda girişindeki tampon akışını azaltmak adına gereklidir. Öte yandan, yalnızca geniş iç çaplı tüplerin kullanılması, çok büyük hacimlerde biyolojik örnekler gerektirecektir. Akış odası çıkışını, atmosferik basınçtaki açık bir Falcon tüpüne bağlayın.

Bu tüp, akış odasından dışarı çıkan tampon çözelti için atık tüpü görevi görür. Bu prosedüre başlamak için, her bir tampon çözelti kabına 1 mL tampon A ekleyin ve bağlantı tüplerini ve akış hücresini yıkamak için 200 mbar basınç uygulayın. Bir basınç kontrol sistemi kullanılabilir.

Son olarak, basınç rezervuarının içindeki hava basıncını ayarlayın. Akış pürüzsüzlüğünü bozabilecek hava kabarcıklarının varlığını kontrol edin. Çıkış tüpüne hafifçe vurmak kalan kabarcıkların uzaklaştırılmasına yardımcı olacaktır; basıncı 20 millibara düşürün ve tüm kanal ile tüplerin hava kabarcıklarından arındırıldığını ve tamponun tüm kanallarda benzer hızlarda aktığını doğrulayın.

Numuneleri 300 microliters nihai hacme hazırlayın. Bu deneyde strept kaplı polistiren boncuklar, laktoz represör bağlanması için spesifik hedef diziler içeren her iki uçtan biyotinillenmiş lineer DNA ve floresan işaretli laktoz represör proteini kullanılmaktadır. Her bir numuneyi şırınga kaplarından birine şu sırayla ekleyin: birinci kanala boncuklar, ikinciye DNA, üçüncüye görüntüleme tamponu ve dördüncü kanala işaretli protein.

Akışı 20 millibar seviyesinde açın ve örneklerin akış kanalının içine ulaşmasını sağlamak için kapatma vanalarını açın. Bu durum, boncuk kanalında kolayca tespit edilebilir. İlk kanalı parlak alan aydınlatması altında görüntülerken, iki optik cımbızı çalıştırın ve her bir tuzağa bir polistiren boncuk yakalayın.

Diğer boncukların tuzaklara düşmesini önlemek için hızlıca ikinci kanala geçin. DNA kanalına varışın, boncuk akışının sona ermesiyle kolayca fark edilebileceğini unutmayın. Bir AO optik deflektör veya OD hareketi kullanarak, akışla uzatılmış DNA'nın optik olarak tuzaklanmış iki boncuk arasında tutunmasını sağlamak için, bir tuzak boncuğu diğer boncuğun yakınında ileri geri hareket ettirin.

Bir DNA dambılı oluştuğunda, statik boncuk, tuzak tarafından aktif olarak ileri geri hareket ettirilen boncuğun hareketini takip etmeye başlar. Hızla tampon kanalına geçin ve tampon akışını kapatın. Tek bir DNA molekülünün varlığını doğrulamak için kuvvet-uzama eğrisi analizi gerçekleştirin.

Bu işlem, DNA gerilimi ölçülürken iki boncuğun birbirinden ayrılarak gerçekleştirilir. Tek bir DNA dambılı elde edildiğinde, akışı tekrar açın ve dambılı protein kanalına taşıyın. Etiketli laktoz represör proteinin DNA ile etkileşimini izlemek için geniş alan floresan mikroskobuna geçin, akışı kapatın ve görüntüleme işlemini başlatın.

Bu yöntem, gerilmiş bir DNA molekülü ile etkileşime giren tekil laktoz represör veya lacI moleküllerinin tespit edilmesini sağlar. Bu temsili şemada, bir lacI molekülü spesifik olmayan DNA dizileri boyunca difüze olurken, diğer bir lacI molekülü DNA molekülünün merkezinde yer alan bir operatöre spesifik olarak bağlanmıştır. Bu grafik, iki tuzak merkezini birbirine bağlayan yön boyunca iki lacI molekülünün konumunu göstermektedir.

Moleküllerin konumları, zamana bağlı olarak radyal simetri merkezi algoritması ile belirlenmiştir; burada, gerilmiş bir DNA molekülü boyunca difüzyona uğrayan tek bir lacI molekülü için ortalama kare yer değiştirmenin (MSD) zamana karşı grafiği gösterilmektedir. Proteinin difüzyon katsayısı, verilerin doğrusal regresyonu ile kolayca elde edilebilir. Manipülasyon ve görüntüleme tekniklerinin kombinasyonu; DNA, RNA veya bir hücre iskeleti filamanı gibi tek bir biyolojik polimer üzerinde mekanik kontrol ve bu polimerle etkileşime giren tekil protein moleküllerinin eş zamanlı lokalizasyonuna olanak tanıyan güçlü bir yöntemdir.

Bu Prosedür uygulanırken, tek molekül manipülasyonu ve görüntüleme tekniklerinin birleştirilmesinin, askıdaki polimerin nanometre düzeyinde stabilitesini sağlamak için deneysel düzeneğin dikkatli bir şekilde tasarlanmasını gerektirdiğini hatırlamak önemlidir. Öte yandan, tuzağı oluşturan G lazeri ile floresan prob arasında spektral ayrımı garanti altına almak için biyolojik probun uygun şekilde tasarlanması gerekir. Ayrıntılar için lütfen beraberindeki protokol metnine bakınız.

Bu videoyu izledikten sonra, iki optik hızlı vuruş arasına DNA molekülünün nasıl monte edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yapının montajı, detaylı açıklamasını sunduğumuz çok kanallı akış hücresi ile daha iyi gerçekleştirilir. Ayrıca, tampon akışının nasıl optimize edileceğini ve aksi takdirde deneylerinizi riske atabilecek hava kabarcıklarının nasıl giderileceğini de belirttik.

Birleştirilmiş metin protokolünde, streptavidin kaplı boncuklarla birleştirme için gerekli olan DNA'nın bioTE ile işaretlenmesi protokollerinin yanı sıra proteinlerin işaretlenmesine yönelik protokolleri bulabilirsiniz. Son olarak, tek bir laktoz baskılayıcı proteinin bir DNA molekülü üzerindeki bağlanmasının ve difüzyonunun miktarını belirlemek için gerçekleştirilen adım adım işlemleri örneklendirdik.