Name: Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Öğrenin kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü proteininin Saccharomyces cerevisiae kullanılarak saflaştırılması yöntemini. Bu protokol, fonksiyonel CFTR üretimi için maliyet etkin bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma onun KFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu aracılığıyla ABD Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) tarafından finanse edildi. TR İngiltere&#39;de BBSRC öğrencilikle tarafından İngiltere CF Güven öğrencilik ve NC tarafından finanse edildi. Biz onların yardım ve tavsiye için ve kodon-optimize edilmiş tavuk KFTR dizisi ve arıtma etiketleri tasarımı için CFF CFTR 3D yapısı konsorsiyum meslektaşlarımızı kabul.

Tamponlar 1. Hazırlanması <ol><li> Proteaz inhibitörünün 100x stok yapmak için (PI) bir kokteyl 96 mg AEBSF, 3.5 mg kimostatin, 10 mg E64, 16.5 mg löpeptin, 16.5 mg Pepstatin 348 mg PMSF, ve 20 ml DMSO içinde 4 mg bestatin çözülür. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza olun Benzamidin bir 100X stok yapmak için, 720, 20 ml ultra saf su içinde mg (GKD 2 O) ve -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik alikolar içinde çözülür mağaza Bu miktar, bir saflaştırma için yeterlidir. Tüm tampon olarak, PI ve benzamidin stokları 1:100 dilüsyonda kullanılmıştır. </li><li> &#39;MPIB&#39; (0.3 M Tris, pH 8, 0.3 M sukroz, 2 mM DTT) ve &quot;CFTR &#39;hazırlayın (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 mM DTT) 4 ° C&#39;ye tamponlar ve soğuk . Kullanmadan önce, proteaz inhibitörü kokteyli 1:100 ekleyin ve mPIB hacmine göre 1:100 benzamidin (örneğin, 350 ml mPIB bir toplam hacim içinde 3.5 ml PI ve 3.5 ml benzamidin kullanın) hücre pelletini için kullanılır. </li><li> S hazırlayınolubilization tamponlar. Lizo-fosfatidil gliserol-14 (LPG) solübilizasyon tampon maddesi (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri (PI) ve% 4 (a / h) LPG) ve dodesil maltozit (DDM) solübilizasyon tampon maddesi (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri,% 4 (a / h) DDM). Bu kabarcıklar oluşturur gibi tampon, deterjan dağılmasına yardımcı olmak, ancak karışımın vorteks önlemek için bir sonikatör banyosuna (35 B, 40 kHz) içerisinde soniklendi edilebilir. Kullanımdan önce 4 ° C&#39;ye soğutun. </li><li> LPG saflaştırılması için CFTR saflaştırma tampon, 50 mM Tris,% 10 (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) LPG-14 ve proteaz inhibitörleri olduğunu. Bu tampon 350 ml ve aynı tamponu artı 1 M imidazol, 150 ml hazırlayın. 8 Her iki tampon pH ayarlayın. </li><li> DDM saflaştırma için tampon, 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) DDM oluşur. Bu tampon 350 ml, ve aynı tampon 150 ml ve 1 M imidazo hazırlanmasıle. 8 Her iki tampon pH ayarlayın. </li><li> LPG ihtiva eden jel nüfuz kromatografisi (GPC) tamponu sağlamak için, 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT,% 0.05 (ağ / hac) LPG-14 hazırlar. DDM kullanılarak GPC 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) DDM bir tamponu hazırlamak için. GPC kolonu üzerinde kullanılan bütün tampon ve GKD 2 O, süzüldü (0.2 mikron filtre) ve kullanılmadan önce gazı alınmış olmalıdır. </li><li> SDS-PAGE örnek tamponu (çalışma konsantrasyonunun 2): 50 mM Tris-HCl pH 7.6,% 5 (v / v) gliserol, 5 mM EDTA,% 0.02 (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi. -20 ° C&#39;de 700 ul alikotları ve mağaza olun Kullanımdan önce,% 20 200 ul (w / v) sodyum dodesil sülfat (SDS) ve taze 0.5 M DTT, 100 ul ilave edin. Jeli üzerinde yüklemeden önce, oda sıcaklığında numune ile en az 10 dakika boyunca inkübe edin. Isı etmeyin; Bu GFP denatüre ve CFTR araya neden olabilir. </li><li> Sulandırılacak lipid stok yapmak için E: bir 4:1 (ağ / ağ) karışımı çözülür coli lipidler bird kloroform ve metanol içinde kolesterol (2:1 v / v) ve bir lipid film oluşturmak için 2 saat boyunca N2 gazı altında cam bir şişede kuru. Ml 40 mg / bir lipid konsantrasyonu (no NaCI) ile GPC tamponu ilave edin ve çözeltiyi netleştirmek için tekrar vorteks ve sonikasyon (35 B, 40 kHz) kullanın. </li><li> ATPaz testi için, GKD 2 O 1 M DMSO, NaSCN 1 mM&#39;ye SCH28080 eritilmesi ile ve 100,% 2.5 mM (v / v) etanol ile oligomycin ATPase inhibitörlerinin 100x stokları hazırlamak. -20 ° C &#39;de parçalar halinde saklayın 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NH4CI, 5 mM MgSO 4 ile% 0.02 (ağırlık / hacim) NaN3 ile ATPase tamponu 100 ml olun. Bu, oda sıcaklığında depolanır ve çeşitli deneyleri için de kullanılabilir. Kullanımı ve buz üzerinde tutmak için hemen önce, 5 mM ATP stok hazırlayın. (NB kullanımlar Na 2 ATP deneyinde fosfattan fazla arka plan sinyalini önlemek için). SDS durdurma çözeltisi (% 12 (ağ / hac) SDS içinde GKD 2 O) hazırlayın. </li><li> Chifflet tespiti için w (A (% 3 tampon hazırlamak/ V) askorbat,% 0.5 (ağ / h) amonyum molibdat, 0.5 M HCI) kullanımdan hemen önce ve tampon B&#39;ye (% 2 (w / v) sodyum sitrat,% 2 (w / v) sodyum meta-arsenit,% 2 (v / v) asetik asit). </li></ol> Mantar mikrozomları 2. Izolasyonu <ol><li> O&#39;Ryan ve diğerleri de tarif edildiği gibi ifade eden tavuk CFTR S. cerevisiae büyütülür. (2012) 14. En fazla 6 ay boyunca -80 ° C &#39;de iki kısım halinde, bir 20 L fermantasyon malzemeyi saklayın. </li><li> Hızlı bir şekilde hücre, bir kısım buzunu ve hücre gramı başına 3 ml soğuk mPIB içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 425-600 um çapında cam boncuklar kullanılarak, bir bilyalı değirmen içinde hücreleri bozabilir. 1 dakikalık dinlenme periyotları ile ayrılan hücre bozulması beş 1 dk dönemleri kullanın. (Dinlenme süreleri hücreler kesintileri sırasında ısıtılan emin olmak için gereklidir.) </li><li> Bilyalı değirmen alınan hücre lisatı bir 1 ml numunesinin santrifüjle hücre parçalanmasından sonra izlenmesi. Bir tezgah üstü centr Santrifüj (12.000 xg, 4 ° C, 5 dakika)ifuge. Bir küvet içinde mPIB ile 1:50 seyreltin ve süpernatant A 380 ölçer. A 380&gt; 0.1, ya da birkaç tekrarlanan boncuk yenerek döngüleri rağmen artan durduysa, aşağıdaki adıma geçin. Eğer değilse, 2,3-2,4 tekrarlayın. </li><li> Toplam hücre lizatı (12,000 x santrifüj g, 4 ° C, 20 dak.) Süpernatantı saklayın. (Kırılmamış hücreler ve mitokondri içeren) pelet atın, ama hücre kırılma verimliliği konusunda herhangi bir şüphe (bkz 2.4) varsa, o zaman da pelet korumak. </li><li> Önceki basamakta (200,000 xg, 4 ° C, 1.5 saat) süpernatant santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve CFTR tamponu peletlendi mikrozomal zarları tekrar süspansiyon. Mikrozomlar DDM kullanarak arıtma için tasarlanmıştır, 1 M NaCI ile tampon CFTR tamamlar. </li><li> 100,000 x (yeniden süspansiyon haline getirilmiş membran fraksiyonunun tekrar santrifüj g, 4 ° C, 1 saat) ve süpernatant atın. </li><li> Pelet haline mikrozomlarında süspanseCFTR tamponu minimum hacmi (nihai hacim 5-15 mi, total mikrozomal protein 70-200 mg). A Bradford tahlili mikrozomal proteinlerinin 25 toplam konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak membran floresans emisyon spektrumu ölçülmelidir (uyarım = 485 nm, emisyon = 500-600 nm) ve ayrı bir GFP floresan tepe (512 nm &#39;de maksimum) sahip olmalıdır. CFTR özel GFP floresan koşullar altında taranan bir SDS-PAGE jel üzerinde (Şekil 1) üzerine tespit edilebilir. </li><li> Flaş dondurularak sıvı azot içine daldırma ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve mikrozomları -80 ° C&#39;de saklayın, ya da 3 Adım devam edin. </li></ol> Mikrozomların 3. Çözündürülmesi <ol><li> Dondurulmuş, hemen 10 ° C&#39;ye ayarlanmış bir su banyosu içinde kullanılmadan önce mikrozomları defrost </li><li> Membran çözünmesi için, bir nihai deterjan konsantrasyonu vermek üzere, ilgili solübilizasyon tampon maddesi (Aşama 1.3) eşit hacmi ile mikrozomları seyreltik% 2 (a / h) ve bir mikrozomal protein konsantrasyonu 5 mg / ml. Çalkalama ile 4 ° C&#39;de (tüp döndürücü) 1 saat boyunca bu karışımın inkübe edin. Analizi için 200 ul saklayın. </li><li> Karışım (100,000 xg, 4 ° C, 45 dakika) santrifüje. Çözündürülmüş zar proteinleri içeren süpernatantı, 0.45 um&#39;lik bir şırınga filtresinden geçirin ve buz üzerinde saklayın. (Aşama 2.8 &#39;de olduğu gibi) süpernatanın flöresan ölçülür. </li><li> % 1 çözünmeyen fraksiyonu, çözünebilir fraksiyon eşit bir hacme kadar (ağ / hac) SDS çözeltisi yeniden süspanse edin. Bu fraksiyonun bir kısmı olarak floresan ölçülür ve SDS-PAGE analizi için 50 ul bir kısım korur. </li></ol> CFTR 4. Nikel afinite saflaştırma <ol><li> Seri bağlantı, iki 5 ml nikel sefaroz sütunlar. Daha sonra 1 M imidazol içeren, (1,4-1,5 Aşama) çözündürme tamponu 2 CV ile sütun yıkama, GKD 2 O 2 CV ardından (v / v) etanol, 2 kolon hacmi (CV) ile% 20 yıkayın. Solubilizat 2 CV ile tekrarlayıniyon imidazol eksik tampon. </li><li> Çözelti halindeki materyale (Basamak 2.8) ile 5 mM arasında nihai bir konsantrasyona kadar imidazol ilave edin ve otomatik bir sıvı kromatografi cihazı kullanılarak elle kolona veya bir örnek döngüye malzemeyi yüklemek. </li><li> 0.5 ml / dk &#39;lık bir akış hızında kolona çözündürülmüş malzeme yük, ve bağlanmamış malzemenin bertaraf edilmesi için aynı akış hızında imidazol-eksik tamponu 2 CV ile yıkayın. 50 ml Falcon tüpleri içinde fraksiyonlar toplayın. </li><li> İlk yıkama için, 1 ml / dk &#39;lık bir akış oranında, 40 mM imidazol ile arıtma tamponunun 3 CV kullanın. 2 ml fraksiyonlar toplayın. </li><li> İkinci yıkama, 100 mM imidazol ile arıtma tamponunun 3 CV kullanın. 2 ml fraksiyonlar toplayın. </li><li> 400 mM imidazol ile arıtma tampon 3 CV ile HisTrap kolondan Elute CFTR. 2 ml fraksiyonlar toplayın. </li><li> Yıkanmış fraksiyonlar (2.8 Aşama) içinde floresan izleyin. </li><li> SDS-PAGE analizi için pik fraksiyonların alikotları saklayın. Flaş dondurma kalan zirve fraction örnekler ve mağaza -80 ° C &#39;de, ya da bir sonraki saflaştırma aşaması için devam edin. </li></ol> CFTR 5. Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) saflaştırılması <ol><li> 1.2 CV GPC tamponu ile ve ardından 1.2 CV GKD 2 O sütunu (Superpose 6 10/300 GL) dengelenmesi. </li><li> Aşama 5.1 sırasında, 4 ° C &#39;de, bir santrifüj 100,000 bir MWCO filtre kullanılarak, en yüksek GFP floresan olan Ni-afinite ile saflaştırılmış fraksiyonları konsantre DDM içinde temizleme, bu önemli bir örnek kaybına neden olacak şekilde 0.3 mg / ml protein, protein konsantrasyonu Yukarıdaki örnekte konsantre kaçının. 100,000 x de konsantratör ve santrifüjden bakiyenin kaldırma büyük parçacıklar pelet 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca g. </li><li> Kolon üzerine enjekte edilir ve bu örnek 1,2 CV GPC tamponu izokratik gradyanı ile elüte. 0.5 ml fraksiyonları toplayın. </li><li> CFTR ihtiva eden kesirler belirlemek için bölüm 2.8 olarak GFP floresan ölçün. Küçük bir hacim korumak (örneğin &lt;/ Em&gt; SDS-PAGE ile analiz için her biri 50 ul). </li><li> -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza fraksiyonlar Freeze </li></ol> CFTR 6. Sulandırma <ol><li> Lipid-to-protein oranı 100:1 (a / a) de saflaştırılmış CFTR için lipitleri (Basamak 1.8) ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Benzer şekilde GPC tamponu aynı hacmi ile saflaştırılmış protein ile ikame, bir lipid tek kontrolünü ayarlayın. </li><li> Hidrofobik yüzerme boncuklar kullanılarak protein / yağ karışımından deterjan çıkarın. 5 CV GKD 2 O, 5 CV% 70 (v / v) etanol, 5 CV GKD 2 O ve deterjan eksik 5 CV GPC tamponu içinde adsorbent boncuk yıkayın. Saflaştırılmış proteinin ml başına yıkandı emen tanelerin 200 mg eklenir ve yavaşça çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ince uçlu bir pipet kullanarak yeni bir tüp içine emen boncuklardan yeniden oluşturma örnek toplamak. </li></ol> ATPaz aktivitesi 7. Ölçümü <ol><li> CFT oranını belirlemek96 oyuklu bir plaka biçiminde bir tadil edilmiş Chifflet 26,27 tahlili kullanılarak R-özgü ATPaz aktivitesi. Sodyum fosfat stok çözeltisi ile (0.65 mM) standartları olarak 50 ul nihai hacim içinde 0-20 nmol fosfat hazırlar. Fosfat stok seyreltilmesi CFTR tampon ve tampon ATPaz bir 1:1 karışımı kullanın. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde 1:100 (v / v) ATPase inhibitörleri (Basamak 1.9) ile yeniden CFTR ve boş hem de lipozomlar inkübe edin. Yeniden CFTR en az 5 ug kullanın. </li><li> 2 mM&#39;lik nihai konsantrasyona ATP (Basamak 1.9) ilave edilir ve 1 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. (Standartlar dahil olmak üzere) her bir (ağırlık / hacim) SDS (1.9 Aşama)% 10, 40 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. </li><li> Tampon A içinde 100 ul (1,10 Aşama) ve 10 dakika boyunca inkübe edilir. Her bir oyuğa 100 ul tampon B (1.10) ilave edin ve 96 oyuklu bir plaka uyumlu bir UV / Vis spektrofotometresinde 800 nm&#39;lik bir dalgaboyunda absorbans ölçümü. </li><li> Kullanarak serbest fosfat miktarında içine 800 nm&#39;de absorbans dönüştürmefosfat standartları. Arka plan sinyalinin (lipozom sadece kuyu) çıkarıldıktan sonra, ATP hidroliz hızını hesaplar. </li><li> Non-yeniden CFTR için plan okumaları için CFTR tampon kullanarak aynı protokolü izleyin. </li></ol>

<ol><li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+%28ABCC7%29+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li>
<li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK%3A+1947-2003%5BTitle%5D)+AND+%22EUR+RESPIR+J%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li>
<li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+chromosome+walking+and+jumping%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li>
<li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li>
<li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li>
<li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology%3A+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li>
<li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li>
<li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+of+MRP1+%28ABCC1%29+and+related+ATP-dependent+drug+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li>
<li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li>
<li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li>
<li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li>
<li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li>
<li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li>
<li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA%3A+Alternating+access+with+a+twist%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li>
<li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter%3A+structure+and+allosteric+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li>
<li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li>
<li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+functional+characterization%2C+and+NMR+studies+of+human+KCNE1%2C+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein%3A+Application+to+lens+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li>
<li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını ne de bu işe ilişkin diğer çelişkili çıkarları var.

Daha önce sıçangil CFTR 14&#39;ün aşırı ifadesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yayınlanmasından bu yana, aynı sistemi kullanarak CFTR birkaç farklı ortologlarını ifade ve saflaştırılmış var. DDM arıtma farklı ortologlar karşısında daha fazla varyasyon (veriler gösterilmemiştir) gösterdi iken, test edilen tüm ortologlar kadar, LPG deterjan iyi arıtılmış. Bu esneklik, maya yaklaşımın gücünü gösterir: belirli bir amaç için bir seçmek için göreli bir hızla çok yapıları taranması mümkündür. 1 M NaCl önce temiz bir mikrozom preparatında DDM sonuçlar, çözünürleştirme ve daha sonraki aşamada kirletici azaltır ihtiva eden tampon ile maya mikrozomları yıkama. Nihai CFTR örnek mikrozom yıkaması olmaksızın&gt;% 90 saf olduğu için bu adım, LPG protokolünde gereksizdir. Ayrıca, DDM saflaştırma çözündürme a için tamponlar için çeşitli değişiklikler gerektirirnd saflaştırılması, gliserol ve ilave tuzu yani eklenmesi. Hep birlikte, bu ilave önemli kolona DDM-çözündürülmüş proteinin bağlanma artmıştır. DDM saflaştırma metodolojisi iyileştirilmesi için, özellikle de kütle spektrometresi ile karar, bir 40 kDa ana kirleticinin kaldırılması, nikel reçinesi için doğal bir afiniteye sahip görünen maya ribozomal alt birimine L3, kaynaklanmaktadır bir kapsama sahiptir. Orada L3 protein içinde belirgin bir polyHis sekansıdır, ancak ribozom bağlandığmda da 3 boyutlu yapısının incelenmesi (PDB = 1FFK) katlanmış alt birim L3 potansiyel polyHis küme sahip olduğunu göstermektedir. Bu bant LPG-saflaştırılmış malzeme daha az sorunlu olduğu sert LPG deterjan nedeniyle olabilir. DDM yılında arıtma LPG daha fakir gibi görünüyor olsa da, bu tür DDM gibi hafif deterjanlar fonksiyonel ve yapısal analizler ile daha uyumlu olabilir ve zaten birkaç X-ışını crystall kullanılmıştırMembran proteinlerinin 15-21 arasında ographic çalışmaları. Ayrıca, sonuçlar LPG kullanımı DDM in saflaştırmaya CFTR nispetle ATPase fonksiyon kaybına yol açtığını göstermiştir. Bu nedenle bu tür post-translasyonel modifikasyonlar karakterizasyonunda gibi uygulamalarda örneğin, ya da antikorların üretilmesine de, LPG tabanlı bir protokol seçilecektir, saflık önemlidir CFTR üretilmesi için LPG-bazlı saflaştırma protokolü tavsiye . Proteinin aktivitesi, ve tam olarak yerel durum gerekli olduğu uygulamalarda Öte yandan, daha iyi bir seçenek olarak DDM tabanlı bir protokol önerecek olacaktır. Sonuç olarak, bu protokol zitteriyonik deterjan LPG-14 ya da non-iyonik deterjan DDM CFTR izolasyonu için tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Gibi daha önce 10-13 bildirilmiştir daha CFTR için arıtma koşullarının daha geniş bir yelpazede gösterir. Ilave miligram arıtılmış CFTR miktarları olabilirBöyle bir 20 L&#39;lik fermente edici ve bir 6 L düşük hızlı santrifüj rotoru olarak yüksek kapasiteli bir hücre toplama sistemi olarak, bir yüksek hacimli maya büyüme sistemi ile bir araya getirildiğinde, bu prosedürler kullanılarak elde edilmiştir. Elde edilen CFTR çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel tahlillerinde protein kolayca izlenmesini sağlayan bir bölünebilir GFP etiketi vardır. Bu makalede (tavuk CFTR ihtiva eden plasmid veya dondurulmuş maya hücreleri) de tarif edilen reaktif Kistik Fibroz Vakfı (USA) ile elde edilebilir.

Kistik fibrozis (CF) 2,500 canlı doğumda yaklaşık 1 insidansı ile Avrupa ve Kuzey Amerika&#39;da en sık görülen genetik bir hastalıktır. CF oluştuğunda, kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü (CFTR) epitel hücrelerinin 1 plazma membranında işlevi protein kaybı nedeni mutasyonlar. Bu kusurun en ciddi sonucudur yaşı 2,3 &lt;40 yıl hastalarının ömrü kısaltır dönüşümsüz akciğer hasarı vardır. CFTR bir iyon kanal 1,4 haline dönüşmüştür bir ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcı olduğunu. Hücrelerin plazma membranında onun oldukça değişmiş fonksiyonu olmasına rağmen, yine de, diğer ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği korur. İlgi çekici, CFTR (yani düzenleyici bölge ve N-ve C-termini) &#39;nin özel bir parça, diğer metazoan ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği paylaşan, dolayısıyla inci hiçbir ipucu vardırCFTR bu dizilerin e kökeni. Birincil yapısının temelinde, CFTR ABC transportör ailesinin bir C-aile üyesi olarak sınıflandırılır, ancak bu alt-aile için artık fonksiyonel bir bağlantı için güçlü bir kanıt yoktur. Diğer raporlar azalmış glutatyon ziyade gösteren daha, CFTR ATPaz aktivitesini inhibe olabileceğini düşündürmektedir rağmen, diğer C-aile üyelerinin 8,9 rolleri ile tutarlı olurdu, CFTR 5-7 için glutatyon taşımacılık faaliyetlerinin bazı raporlar olmuştur ABC nakliyecilere 10 karakterize tabaka kaynaklı uyarım. Iyon iletkenliği ölçümü bir CFTR moleküllerin kanal aktivitesi 1 incelenecek kanal özellikleri ve CFTR zamanın bir fonksiyonu, sıcaklık, ATP konsantrasyonu, membran potansiyeli ve fosforilasyon durumu yanı sıra olarak takip edilmiştir izin vermek için yeterince hassastır , küçük molekül inhibitörleri, kuvvetlendirici ve modifiye bir ana varlığı. Bunlarçalışmalar da ABC taşıyıcıları nasıl işlediğini bizim bilgilerimize önemli ekledik. Bununla birlikte, önemli miktarda ve daha sonra saflaştırma CFTR ekspresyonu özellikle zor ve başarı birkaç 10-13 laboratuarlar ile sınırlı olmuştur olduğu kanıtlanmıştır. Daha etkili ilaçların geliştirilmesi için ihtiyaç presleme, henüz bu işlem küçük moleküllerin taranması için arıtılmış, CFTR eksikliği tarafından engellenmiştir. CFTR ifade ve arıtma sorununun çözülmesi CF birincil kusur düzeltme amaçlı yüksek verimli ilaç tarama sağlayacak ve aynı zamanda rasyonel ilaç tasarımı konusunda yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar için bir yol açacaktır. Ayrıca, bu tür fonksiyonel oligomerik durum olarak protein, etkileşen protein ve ATPaz aktivitesi bile nispeten temel biyokimyasal özellikleri zayıf bir şekilde karakterize kalır. Daha önce GFP-ve His-etiketli murin CFTR büyük ölçekli ifadesi için bir protokol bildirmiştirS. cerevisiae 14 ve şimdi daha CFTR saflaştırılması için protokolleri açıklanmıştır. Biz örnek olarak tavuk CFTR saflaştırılması için beş CFTR orthologues ve mevcut veri arındırmak için bu yöntemleri kullandık. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır, biz saflaştırılmasında kullanılmak için iki zıt deterjanlar seçtik. Dodesil-β-D-maltozit (DDM) yaygın zar proteinlerinin 15-21 hem yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir iyonik olmayan deterjandır. Iyonik deterjan 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol) (LPG-14), CFTR çözünme son derece etkili olduğunu ve daha önce fonksiyonel membran proteinlerinin 10&#39;un saflaştırılması kullanılmıştır S arasından CFTR saflaştırılması dahil olmak üzere, 22,23, cerevisiae 24. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mu; M Şırınga Filtresi&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO santrifüj konsantratörü (PES membranı)</td><td>Vivaspin</td><td>VS0641</td><td></td></tr><tr><td>2 ml mikrofüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td><td></td></tr><tr><td>50 ml steril Falcon tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin trifosfat disodyum tuzu (Na<alt>2</alt>ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı kromatografi sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Aminoetilbenzensülfonil florür (AEBSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>Cam boncuk atan hücre bozucu</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj&nbsp;</td><td>HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Santrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü mikrofüj&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik Boncuklar SM-2 Adsorban</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>Jel görüntüleme sistemi</td><td>BioRad</td><td>170-808</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td> E. coli toplam lipid özütü</td><td>Avanti lipidleri</td><td>100500</td><td></td></tr><tr><td>Epoksisüksinil-lösilaminido-bütan (E-64)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Cam boncuklar, asit yıkanmış</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher</td><td>65017</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP sütunları (5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-05</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Coomassie Lekesi</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj JA-17 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Lizo-fosfatidil gliserol-14 (LPG)</td><td>Avanti lipidleri</td><td>858120</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Jel tankı SDS-PAGE sistemi</td><td>BioRad</td><td>165-8006</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodesil-&beta;-D-maltopiranosid (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Önceden boyanmış protein standartları</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>Tuz giderme kolonları (Sephadex G-25)</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonilflorür (PMSF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tiyosiyanat (NaSCN)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>251410</td><td></td></tr><tr><td>Jel filtrasyon 10/300 GL sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Star Labs</td><td>N2400-0001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik su banyosu</td><td>Ultrawave</td><td>F0002202</td><td></td></tr><tr><td>Çok modlu plaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>BTH1MF</td><td></td></tr></tbody></table>

olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü protein saflaştırılması<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) kusurlar protein kistik fibrozis (CF), şu anda yaş &lt;40 yıl hastalarının ortalama yaşam beklentisi sınırlar otozomal resesif hastalığa neden. CFTR aktivitesini geri yeni ilaç moleküllerinin geliştirilmesi tedavi CF önemli bir hedeftir, ve işlevsel aktif CFTR izolasyon bu hedefe ulaşmada yararlı bir adımdır. Bir ökariyotik heterolog ifade sisteminde, S&#39;den CFTR saflaştırılması için iki yöntem tarif cerevisiae. Prokaryotik sistemleri gibi, G. cerevisiae hızla düşük maliyetle laboratuvarda yetiştirilen olabilir, ama aynı zamanda trafik ve posttranslationally büyük membran proteinleri değiştirebilirsiniz. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır sonra, iki eş seçtikNihai CFTR preparat, daha sonra planlanan deneyler için uygun hale getirilmesine olanak saflaştırılmasında kullanılmak için deterjanlar ntrasting. Bu yöntemde, biz dodesil-β-D-maltoside CFTR saflaştırma (DDM) ve karşılaştırma sağlamak 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol) (LPG-14). Bu yöntem ile DDM saflaştınlabilir Protein fonksiyonel deneylerde ATPaz aktivitesi gösterir. LPG-14 arıtılmış, Protein verim ve yüksek saflıkta, post-translasyonel modifikasyonlar incelemek için kullanılabilir gösterir ve bu, küçük açı X-ışını dağılımı ve elektron mikroskopisi gibi yapısal yöntemleri için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha düşük ATPaz aktivitesi gösterir.

Yukarıda tarif edilen protokol ham mikrozomal hücre kopması ve hazırlık (Şekil 1) CFTR hemen hemen tamamen geri kazanımı ile CFTR bakımından zenginleştirilmiş mikrozomlarının izole etmek için etkili bir araçtır. Diğer hücre kopması yöntemler de etkili bir şekilde kullanılabilir. Biz eşit verimlilik ile bir Fransız basınç hücresi ve diğer high-pressure/cavitation cihazlar (aynı zamanda bir yakut hedefe karşı etkileyen ile birlikte) kullanmıştır. Kolaylık ve ekipman düşük başlangıç ​​maliyeti, biz boncuk dayak yöntemini iyi bulmak. CFTR çözündürülmesi ve saflaştırılması için LPG kullanılarak&gt;% 90 saflık ile (Şekil 2), 80 ug protein / L kültür vermiştir. Yüksek verim nedeniyle LPG (Şekil 2b, kuşak 2 ve 4 ile karşılaştırınız) ile CFTR etkili çözündürülmesi amaçlanmıştır. Buna ek olarak, etkili ve kolona sıkı bağlanma minimal bağlanmamış fraksiyon CFTR kaybı ve yıkama fraksiyonları CFTR yokluğunda (Şekil 2, bölmeler 3, 5 sonuçlandı ve6). Elüt edilen protein, Coomassie-lekelenmiş SDS-PAGE jelleri tarafından tahmin edilir ve CFTR ve kirletici bantların densitometrisi kullanılarak,&gt;% 90 bir saflığa sahip olmuştur. Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC), düşük molekül ağırlıklı kirletici maddeler LPG ile saflaştırılmış CFTR (Şekil 4, alt panel) ayrıldı. DDM kullanarak CFTR arıtma için protokol, yaklaşık% 60 ve yaklaşık 50 ug / L verimle (Şekil 3) saflık verir. Yaklaşık 10 ml (Şekil 4) en elüsyon GPC olumsuz lekeli fraksiyonlarının elektron mikroskopisi (EM) DDM-arıtıldı CFTR 20-30 nm çaplı agrega hem de 10 nm çapında (veriler gösterilmemiştir) daha küçük parçacıklar içerdiğini göstermiştir. Bu küçük agregalar tersine çevrilerek EM-tespit birikimlerin çıkması için başarısız ilişkilendirmek ve bir 1 MDa kesme filtresi ile ultrafiltrasyon ayırmak için mümkündür. LPG ile saflaştırılmış malzeme dolayısıyla boyanmamış fraksiyonların Krio-EM ile incelenmiştir, bir parıltı deşarjı kılavuza adsorbe değildi. Bu gösterdinispeten küçük, çok homojen bir partikül popülasyonu (6-8 nm çap, veriler gösterilmemiştir). Son olarak, saflaştırılmış proteinlerin ATPaz aktivitesi (Şekil 5) ölçülmüştür. ABC protein ailesinin bir üyesi olarak, CFTR ATP bağlanması ve / veya hidrolize edebilen iki nükleotid-bağlayıcı etki (NBDs) sahiptir. Veriler, saflaştırılmış protein, LPG-çözündürülmüş halde ATP hidrolize etmek mümkün değildi ve DDM mevcudiyetinde (Şekil 5, dolgusuz bar) zayıf ATPase aktivitesi göstermiştir göstermektedir. Lipidler ve deterjan kaldırma ilave edildikten sonra ATPaz aktivitesi DDM (13 nmol ATP / dakika / mg protein) saflaştınlabilir edilmiş numuneler için 4 kat daha yüksekti. Lipidler ve LPG kullanılarak izole edilmiştir CFTR LPG için benzer şekilde geri aktivitesi çıkarılması, ancak ek DDM-saflaştırılmış ve yeniden malzemeden daha düşük bir oranda bir son (1.5 nmol ATP / dakika / mg protein). <img alt="Şekil 1"FO: İçerik-width = &quot;5in:&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1. Hücre lizatı tavuk CFTR (CL) izlenmesi düzeyi, yüzer (S) ve mikrozom izolasyon ve yıkama için kullanılan çeşitli santrifüj adımları sırasında peletleri (P). SDS-PAGE jelleri, GFP-jel floresan kullanılarak görselleştirilmiştir tag. 14,000 xg hücre kopması ve santrifüjlemeden sonra süpernatan (bozunma ürünleri de dahil olmak üzere) hemen hemen tüm CFTR içerir. Tüm tam uzunluklu CFTR yüzer bazı parçalarını bırakarak 200,000 xg sediment ultrasantrifugasyon. Tuz-yıkanmış mikrozomlar pelet bazı ilave parçalarının kaldırılması ile neredeyse tüm CFTR 100.000 xg&#39;de Ultrasantrifügasyon. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> Hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi ile LPG tavuk CFTR Şekil 2.. Saflaştırılması. Fraksiyonlar Coomassie lekelemesi (üst panel) ve GFP etiketi (alt panel) flüoresanla tespiti ile takip edilen SDS-PAGE ile analiz edildi. Tracks: (1) Mikrozomlar. (2) LPG-çözünür mikrozomlar. (3) bağlı olmayan bir malzeme. (4) Çözünmeyen materyal. (5) ve (6) 40 ve 100 mM imidazol yıkama. (7) malzeme 400 mM imidazol ile elüt edilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> Hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi ile DDM tavuk CFTR Şekil 3.. Saflaştırılması. Fraksiyonlar Coomassie lekelemesi ile SDS-PAGE ile analiz edildi. Sol taraftaki panel elüsyondan önce kesirler gösterir. Birkaç ardışık yıkama fraksiyonlar CFTR ile sağ panelinde gösterilirok ile endikedir. Daha sonra parçacıklar ribozomal protein L3 olarak kütle spektrometresi ile tespit edilmiş olan bir 40 kDa kirletici içinde zenginleştirilmiştir. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> Jel geçirim kromatografisiyle tavuk CFTR Şekil 4,. Saflaştırma Ni afiniteli kromatografi ile saflaştırılmıştır. CFTR konsantre edildi ve bir GPC sütununa uygulanmıştır. CFTR (üst panel) için bir elusyon profili LPG-14 (katı hat) ya da DDM (kesik çizgi) üst üste ihtiva eden tampon içinde saflandırıldı. SDS-PAGE (alt panel) CFTR 8 ve 11 ml arasında elüt olduğunu ortaya koydu. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Şekil 5. ATPaz faaliyeteDDM veya LPG saflaştınlabilir y arıtıldı tavuk CFTR fraksiyonların. Protein F-, P-ve V tipi ATPaz (dolgusuz bar herhangi bir arka plan ATPaz aktivitesini ortadan kaldırmak için ATPase inhibitörleri kokteylinin mevcudiyetinde bir tadil edilmiş 26 Chifflet tahlili kullanılarak tahlil edilmiştir .) ATP hidrolizinin oranı, aynı zamanda deterjan ilave kaldırma ve lipid (dolu çubuklar) sonra ölçülmüştür. Arsa ortalama ve standart sapma gösterir (n = 3). Ortalama varlığı ve lipidin yokluğunda ATPase aktivitesi için değerleri ve DDM ve LPG olarak aktivitesi arasındaki fark arasındaki farklar p &lt;0.05 için önemlidir.

Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel kistik fibrozis transmembran iletkenlik düzenleyici veya CFTR proteininden büyük miktarlarda izole etmektir. Bu işlem öncelikle, tavuk CFTR proteininin Charmy visi içinde heterolog aşırı ekspresyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım ise maya hücrelerinin parçalanması ve biriken mikrozomal fraksiyonun izole edilmesidir.Ardından CFTR çözülür ve saflaştırılır. Son adım, proteinin fonksiyonel kalıp kalmadığını değerlendirmek amacıyla saflaştırılmış protein tarafından gerçekleştirilen TP hidroliz hızının ölçülmesidir. Nihayetinde, s visi içindeki aşırı ekspresyon, miligram miktarlarda yüksek saflıkta ve fonksiyonel olarak yetkin CFTR üretimine olanak tanır.Bu tekniğin memeli hücre hatlarında ekspresyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mayaların laboratuvarda yetiştirilmesinin kolay, hızlı ve maliyet etkin olmasıdır. Saflaştırılmış protein, şu anda geliştirilmekte olan ilaçlar ile CFTR proteini arasındaki etkileşimleri incelemek ve hatta yeni ilaçlar aramak için kullanılabildiğinden, bu yöntem kistik fibrozis alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yöntem, CFTR saflaştırması hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca ekspresyonu ve saflaştırılması zor olan diğer membran proteinlerine de uygulanabilir.Genel olarak, bu yöntemi yeni deneyimleyen kişiler, CFTR'nin mayadaki proteolitik enzimler tarafından hızla degrade edilmesi ve çözelti içinde agregasyon eğilimi göstermesi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Bu protokolde, tavuk CFTR'si önceden dondurulmuş S SEI hücrelerinden saflaştırılacaktır. CFTR eksprese eden S SEI hücrelerinin büyütülmesi ve hasat edilmesine yönelik prosedürler önceki bir JoVE makalesinde gösterilmiştir.Mikrozomlar, ekteki makalede açıklandığı şekilde maya hücrelerinden izole edilir ve ardından 5 ile 15 mililitre arasındaki minimum hacimde CFTR tamponunda yeniden süspanse edilir. Toplam mikrozomal protein miktarını belirlemek için bir Bradford analizi kullanılabilir; bu miktarın 70 ile 200 miligram arasında olması gerekir ve membranların floresan emisyon spektrumu belirgin bir GFP floresan piki göstermelidir. CFTR'nin çözünürleştirilmesi ve saflaştırılmasında iki zıt deterjan kullanılacaktır: non-iyonik deterjan DDM ile iyonik deterjan LPG 14.Membranları çözünür hale getirmek için el yazmasındaki protokolü takip ederek uygun tamponları önceden hazırlayın. Mikrozomları, nihai deterjan konsantrasyonu %2 ve mikrozomal protein konsantrasyonu mililitre başına beş miligram olacak şekilde, ilgili çözünürleştirme tamponunun eşit hacmi ile seyreltin. Bu karışımı, dört derece Celsius'ta bir saat boyunca ajitasyonla inkübe edin.Bir saat sonra, karışımı 100,000 ×g'de ve 4 °C'de 45 dakika boyunca santrifüjleyin. Çözünmüş membran proteinlerini içeren süpernatanı ayırın ve saklayın.Çözünmeyen fraksiyonu, çözünür fraksiyona eşit bir hacme gelecek şekilde %1 SDS çözeltisinde yeniden süspande edin. Bu fraksiyondaki floresan miktarını ölçün ve SDS-PAGE analizi için 50 µL'lik bir miktar ayırın. CFTR'nin nikel afinite saflaştırma prosedürüne başlamak için, seri bağlı beş mililitrelik nikel Spheros kolonlarını iki kolon hacmi (CV) %20 etanol ile, ardından iki CV distile deiyonize su ile yıkayın. Bundan sonra, iki CV 1 M MiaSole içeren solubilizasyon tamponu ile, ardından iki CV MiaSole içermeyen solubilizasyon tamponu ile yıkayın.Çözündürülmüş materyale beş millimolar final konsantrasyon olacak şekilde MiaSole ekleyin ve ole içermeyen tampon ile iki kez yıkamanın ardından materyali otomatik bir sıvı kromatografisi cihazının örnek halkasına yükleyin. Bağlanmamış materyali uzaklaştırmak için kolonu, dakikada bir mililitre akış hızında 40 millimolar ole içeren üç CV saflaştırma tamponu ile yıkayın. Bu fraksiyonu 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.İkinci yıkama için, 100 millimolar ole içeren üç CV saflaştırma tamponu kullanın. İki mililitrelik fraksiyonları 96 kuyucuklu bir plakada toplayın. CFTR'yi, 400 millimolar ole içeren üç CV saflaştırma tamponu ile hiss trap kolonundan elüe edin. İki mililitrelik fraksiyonları 96 kuyucuklu bir plakada toplayın, elüe edilen fraksiyonlarda floresan değerlerini izleyin ve pik fraksiyonlardan alikotlar saklayın.SDS-PAGE analizi için, kalan pik fraksiyon örnekleri bir sonraki saflaştırma adımında kullanılacaktır. Bu prosedüre, kolon 1.2 CV distile deiyonize su ile dengeleyerek başlayın ve ardından kolon dengelenirken 1.2 CV jel permeasyon kromatografisi veya GPC tamponu uygulayın. En yüksek GFP floresansına sahip nikel afinite ile saflaştırılmış fraksiyonları, dört derece santigrat sıcaklıkta, 100.000 kilodalton moleküler ağırlık kesim sınırlı santrifüj filtresi kullanarak konsantre edin.DDM ile saflaştırma yapılıyorsa, ciddi örnek kaybına yol açacağı için örneği 0.3 mg/mL protein konsantrasyonunun üzerine yoğunlaştırmaktan kaçının. RENATE'yi konsantratörlerden santrifüj tüplerine aktarın ve büyük partikülleri çöktürmek için 4 °C'de 30 dakika boyunca 100,000 ×g hızında santrifüjleyin. Bu örneği dengelenmiş kolona enjekte edin ve 1.2 CV GPC tamponu içeren izokratik bir gradyan ile elüe edin.0,5 mililitrelik fraksiyonlar toplayın. CFTR içeren fraksiyonları belirlemek için GFP floresansını ölçün. CFTR'yi yeniden oluşturmak için her birinden SDS-PAGE analizi için küçük bir hacim ayırın.Saflaştırılmış CFTR'ye lipidler ekleyin. 100'e bir oranında lipid-protein oranı ekleyin. Benzer şekilde, yalnızca lipid içeren bir kontrol grubu hazırlayın.Saflaştırılmış proteini aynı hacimde GPC tamponu ile değiştirin. Her iki örneği dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, protein lipid karışımındaki deterjanı hidrofobik absorban boncuklar kullanarak uzaklaştırın.Saflaştırılmış proteinin mililitresi başına 200 mg önceden yıkanmış adsorbent boncuk kullanın ve hafif ajitasyonla dört °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, rekonstitüsyon örneğini ince uçlu bir pipet ucu kullanarak adsorbent boncuklardan yeni bir tüpe toplayın. Rekonstitüe edilen CFTR'nin CFTR spesifik APA aktivitesi, 96 kuyucuklu plaka formatında modifiye edilmiş bir Chloride assay kullanılarak ölçülür; standartlar olarak, CFTR tamponu ve APA tamponunun bire bir karışımında seyreltilmiş 0 ila 20 nmol sodyum fosfat kullanın. Hem rekonstitüe CFTR'yi hem de boş lipozomları, 1 ila 100 APA inhibitörleri ile buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin.Rekonstitüe edilmiş CFTR'den en az beş µg kullanın. Örnekleri 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve final konsantrasyonu 2 mM olacak şekilde TP ekleyip 25 °C'de bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, her kuyucuğa 40 µL %10 SDS ekleyerek reaksiyonu durdurun.Ardından, her kuyucuğa 100 µL tampon A ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Sonra her kuyucuğa 100 µL tampon B ekleyin ve absorbansı, 96 kuyucuklu plakaya uyumlu bir UV-vis spektrofotometrede 800 nm dalga boyunda ölçün. Absorbans verilerini yeni bir tabloya aktarın.800 nanometredeki absorbansı, fosfat standartlarını kullanarak serbest kalan fosfat miktarına dönüştürün ve gösterilen adımları takip ederek bir TP hidroliz hızını hesaplayın. Bu videoda gösterilen protokol, hücre parçalama ve ham mikrozomların hazırlanması sırasında CFTR'nin neredeyse tamamen geri kazanımıyla, CFTR açısından zenginleştirilmiş mikrozomların izole edilmesi için etkili bir yöntemdir. Bu SDS-PAGE jel görüntüsü, mikrozom izolasyonu ve yıkama için kullanılan çeşitli santrifüjasyon adımları boyunca, bir GFP etiketi üzerinden Ingel floresansı ile izlenen tavuk CFTR seviyelerini göstermektedir.CL hücre lizatını, S süpernatantları ve P peletleri belirtir. Hücre parçalama ve 14.000 ×g'de santrifüj sonrası süpernatant, degradasyon ürünleri dahil olmak üzere CFTR'nin neredeyse tamamını içerir; 200.000 ×g'de ultrasantrifüjleme, tam uzunluktaki tüm CFTR'yi çöktürür ve süpernatantta bazı fragmanlar bırakır; 100.000 ×g'de ultrasantrifüjleme ise tuzla yıkanmış mikrozom peletlerini oluşturur.Bazı fragmanların ek olarak uzaklaştırılmasıyla neredeyse tüm CFTR'nin temizlenmesi ve tavuk CFTR'sinin LPG 14'te immobilize metal iyon afinite kromatografisi ile saflaştırılması, litre kültür başına %90'ın üzerinde saflıkta 80 mikrogram protein sağlamıştır. Üst panel, SDS-PAGE ile analiz edilen ve ardından Coomassie boyaması yapılan fraksiyonları göstermektedir. Alt panel ise aynı fraksiyonların GFP etiketi floresansı ile tespit edilişini göstermektedir.LPG yüklü solubilize mikrozomların bulunduğu ikinci şerit ile çözünmeyen materyalin yüklendiği dördüncü şerit arasındaki karşılaştırmada belirtildiği üzere, yüksek verim LPG 14 tarafından CFTR'nin etkin şekilde solubilize edilmesinden kaynaklanmıştır. Ayrıca, kolona gerçekleşen etkin ve sıkı bağlanma, üçüncü şeritte gösterilen bağlanmayan fraksiyonda CFTR kaybının minimum düzeyde kalmasını ve beşinci ve altıncı şeritlerle temsil edilen yıkama fraksiyonlarında CFTR'nin bulunmamasını sağlamıştır. Elüe edilen proteinin saflığı, Coomassie boyalı SDS-PAGE jelleri ve CFTR ile kontaminan bantların densitometrisi ile tahmin edildiğinde %90'ın üzerinde bulunmuştur.Tavuk CFTR'sinin saflaştırılması. İmmobilize metal iyon afinite kromatografisi ile DDM içerisinde yapılan işlem, yaklaşık %60 saflıkta, litre kültür başına yaklaşık 50 mikrogram protein sağlamıştır. Bu şekil, SDS-PAGE ve ardından yapılan Coomassie boyaması ile analiz edilen fraksiyonları göstermektedir; sol tarafta elüsyon öncesi fraksiyonlar ve sağ tarafta birbirini izleyen birkaç EEU fraksiyonu yer almaktadır.CFTR daha sonra okla belirtilmiştir. Fraksiyonlar, kütle spektrometrisi ile ribozomal protein L3 olarak tanımlanan 40 kilodaltonluk bir kontaminant açısından zenginleşmiştir. İmmobilize metal iyon afinite kromatografisi ile LPG 14 veya DDM kullanılarak saflaştırılan tavuk CFTR, jel permeasyon kromatografisi ile daha da saflaştırılmıştır.LPG 14 içeren tamponda saflaştırılan CFTR için elüsyon profili düz çizgi ile gösterilmiştir. DDM içeren tamponda saflaştırılan CFTR için elüsyon profili ise kesikli çizgi ile gösterilmiş olup; SDS-PAGE, jel permeasyon kromatografisinde sekiz ve 11 mililitre arasında ok ile işaret edilen LPG ile saflaştırılmış CFTR'nin, düşük moleküler ağırlıklı kontaminanlardan da ayrıldığını ortaya koymuştur. Son olarak, saflaştırılan proteinlerin APA aktivitesi ölçülmüştür.Sonuçlar, saflaştırılmış proteinin LPG ile çözünür hale getirilmiş durumda ATP'yi hidroliz edemediğini ve lipidlerin eklenip deterjanın uzaklaştırılmasının ardından DDM varlığında zayıf APA aktivitesi gösterdiğini belirtmektedir. DDM ile saflaştırılmış örnekler için APA aktivitesi, protein başına miligram başına dakikada 13 ATP ile dört kat daha yüksek bulunmuştur. Lipidlerin eklenmesi ve LPG'nin uzaklaştırılması, LPG kullanılarak izole edilen CFTR'nin aktivitesini benzer şekilde geri kazandırmıştır, ancak sonuçta protein başına miligram başına dakikada 1.5 ATP ile DDM ile saflaştırılmış ve yeniden yapılandırılmış materyale göre daha düşük bir hız elde edilmiştir.Bu teknik, uygun şekilde yürütüldüğünde iki gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, numunelerin işlem sonrasında her zaman buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Proteinin yapısı ve stabilitesine ilişkin ek soruları yanıtlamak için termal stabilite, elektron mikroskobu ve küçük açılı x-ışını saçılması gibi diğer yöntemler kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, büyük miktarlarda CFTR proteininin nasıl eksprese edileceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) ifade etmek için...

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), epitelyal bir klor kanalı, çeşitli proteinler ile etkileşim ve önemli hücre süreçlerini düzenleyen bildirilmiştir; aralarında CFTR PDZ motifi aracılı etkileşimleri de belgelenmiştir. Bu protokol bizim karmaşık bir sinyal PDZ bağımlı CFTR makromoleküler birleştirmek için geliştirilen yöntemler...

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Burada insan nazal epitel hücreleri kültürleri üç boyutlu küresel oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pulcuklarının sonra sürücüye Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) teşvik-bağımlı iyon ve CFTR işlevi için bir proxy gibi küresel luminal boyutunda değişiklik miktarının sıvı salgılanması.

İnsan nazal epitel hücre pulcuklarının nesil bireyselleştirilmiş Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör çalışma için

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

Öğrenin kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü proteininin Saccharomyces cerevisiae kullanılarak saflaştırılması yöntemini. Bu protokol, fonksiyonel CFTR üretimi için maliyet etkin bir alternatif sunar.

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet