Farelerde Beyin Doğrudan İlaç Teslim heterotopik mukozal aşılanması Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, bileşikleri beyne iletmek için heterotrofik bir mukozal greftleme ameliyatını başarılı bir şekilde gerçekleştirmektir. Bu, önce bir donör fareden bir nazal septum greftinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, mukozal zarı septumdan bir alıcı faredeki bir kafatası defektine nakletmektir.

Daha sonra, beyin istenen bir süre boyunca greft yoluyla dozlanır. Son adım, verilen bileşiklerin beyne difüzyonunu göstermek için floresan, mikroskopi veya immünohistokimya kullanarak beyin dozlama prosedürünün sonucunu analiz etmektir. Parankim. Kan-beyin bariyerinin varlığı nedeniyle nörop ilaçlarının kullanımı oldukça sınırlıdır.

İnsan endoskopik transnazal cerrahisine dayanan, mukozayı kan-beyin bariyerindeki bir deliğe graflayabileceğimiz ve bunu doğrudan beyne ilaç iletimi için bir kanal olarak kullanabileceğimiz bir teknik geliştirdik. Burada, Boston Üniversitesi'ndeki Han'ın Laboratuvarı'nda doktora sonrası öğrenci olan Richie Komen, bu tekniği bir fare modelinde gösterecek. Kafatasını ortaya çıkarmak için ötenazi yapılmış bir farenin burun bölgesinin etrafındaki cildi çıkararak bu işleme başlayın.

Ardından pnömatik matkapla üç çizgiyi işaretleyin. Çizgilerden ikisi burun bölgesini yanal olarak çevreler ve üçüncüsü gözlerle aynı hizadadır ve bu da iki çizgiyi dik olarak birbirine bağlar. Ardından, ventral olarak detaya inin.

Nazal septumu çevre dokudan ayırmak için, septumu üzerine yapışmış herhangi bir dokudan serbest bırakın. Daha sonra mikroskop altında steril bir tuzlu su çözeltisinde saklayın, grefti temizleyin ve bağlı dokuları çıkarın. İdeal durum, kıkırdak septumun her iki tarafında bulunan mukozal membranlara zarar vermeden tüm bağ dokusunun başarılı bir şekilde çıkarılmasıdır.

Teolojik çerçeveye monte edilmiş standart aseptik aynalama cerrahi prosedürleri kullanarak bir fareyi uyuşturduktan sonra, kuruluğu önlemek için gözlere merhem sürün. Ardından, kafatasını ortaya çıkarın ve kafayı düzleştirin. Daha sonra pnömatik bir matkap kullanarak kafatası üzerinde 1,25 milimetre çapında dairesel bir delik açın.

Atu'yu hedeflerken, delinmiş alanı steril tuzlu suyla ıslatın ve kafatasını çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Bundan sonra, 30 gauge iğnenin ucunu kullanarak durayı manuel olarak çıkarın. Daha sonra, mukozal zarı beyin yüzeyinin üzerine yerleştirin ve epitel tarafını yaradan uzak tutmak için son derece dikkatli olun.

Bir çift cerrahi makasın ucunu kullanarak, kraniyotomi bölgesinin tüm kemikli kenarlarını cömertçe üst üste gelecek şekilde zarı kıkırdaktan ve kafatası ve beyin yüzeyine tutun. Daha sonra grefti steril bir nitril parçası ile örtün. Bu, iyileşme sırasında cildin grefte yapışmasını önler.

Gerekirse fazla zarı kesin ve greft ile temas ettiğinde nitrilin herhangi bir hareketinden kaçının. Ardından cildi dikişle kapatın ve bir sonraki adıma geçmeden önce farenin üç ila yedi gün iyileşmesine izin verin. Hayvanı dozlamak için uygun cerrahi sonrası tedavilerin yapıldığından ve düzenli analjeziklerin uygulandığından emin olun.

Anestezi uygulanmış fareyi stereotaksik çerçeveye sabitledikten sonra, dikişi makasla kesin ve kafatasının etrafındaki fazla deriyi çıkarın. Nitril bariyerini çıkarın ve kafatasının yüzeyini temizleyin. Greft görünene kadar alanı temizlemek için steril salin ve pamuklu çubuklar kullanın.

İstenilen yüzey alanından daha büyük büyütülmesi durumunda greftin jiletle kesilmesi gerekebilir. Daha sonra, kenarları kafatası ile temas edecek şekilde kuyuyu greftin üzerine yerleştirin. Daha sonra kuyu ile kafatası arasındaki kavşağa siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın.

Kuyuyu steril tuzlu suyla doldurun ve sızıntı olmadığından emin olmak için kontrol edin. Daha sonra, kuyuyu yerine sabitlemek için kafatasının üzerine çimento uygulayın. Daha sonra, tuzlu suyu bir pipetle kuyudan çıkarın.

Yapıştırıcının sızmadığını doğrulamak için kuyuyu birkaç kez yıkayın. Sonra 50 mikrolitre floresan dekstran ekleyin. Siyanoakrilat yapıştırıcı ile üste sabitlenmiş dairesel bir nitril parçası kullanarak kuyunun üstünü kapatın ve yapıştırıcının kuyu içeriği ile temas etmediğinden emin olun.

İstenilen süre geçtikten sonra, hayvana ötenazi yapın ve implantı ve beyni çıkarın. Grefti yerinde tutmaya dikkat edin. Çıkarıldıktan sonra yanıp sönün, beyni dondurun Kuru bir buz banyosunda soğutulmuş bir izobütan çözeltisinde, beyni OCT çözeltisine gömün ve 50 mikrometrede dilimleyin.

İstenilen dilimleri doğrudan bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Ardından, OCT çözeltisi kuruduktan hemen sonra dilimi bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Bu, transmukozal dozlamayı takiben bir fare beyin diliminin floresan mikroskop görüntüsüdür.

24 saat boyunca 40 kilodalton tetraetil Rumin konjuge dekstran ile mukozal greft beynin yüzeyinde görülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin düzgün bir şekilde gerçekleştirilmesi için toplam dört saatlik bir ameliyat süresi almalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bir nazal septumu izole edebilmeli ve beyne ilaç verilmesi amacıyla mukozal membranı bir kraniotomi bölgesi üzerinden transfer edebilmelidir.