Name: ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin bakteri kolonilerinin gecikme süresi ve büyüme hızını yüksek verimli görüntüleme ile niceliksel analiz etme yöntemini. Bu teknik, tek varyant düzeyinde uzun gecikme ile yavaş büyümeyi ayırt ederek kalıcı enfeksiyon teşhisine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bacillus subtillis'in görüntüleri için Eliq Oster'a teşekkür ederiz. Çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi (# 260871) ve İsrail Bilim Vakfı (# 592/10) tarafından desteklenmektedir.

1.. Setup oluşturun <ol><li> Optik çözünürlüğe sahip bir masaüstü Tarayıcı seç: 4.800 dpi; Donanım çözünürlüğü: 4.800 x 9.600 dpi; renk bit derinliği: 48 bit, ilgili sıcaklık ve nem seviyelerinde çalışabilir. </li><li> Petri kapları genellikle ticari tarayıcılarında kullanılan kağıt aksine, önemli bir hacmi var. Koloniler, yaklaşık 5 mm tarayıcı yüzeyi üzerinde, agar tabakasının üstünde yer alır. Not: Çoğu tarayıcılar için koloniler odak noktası olacaktır. </li><li> Bazı tarayıcı şirketler aynı bilgisayara aynı türden tarayıcı birden fazla örneğinin bağlantısına izin vermez. Birden fazla tarayıcı bağlı ve benzersiz tespit edilebilir emin olun. </li><li> Aşağıda ayrıntılı olarak aksesuarları hazırlayın: <ol><li> Steril siyah hazırlayın adet plakaları kapsayacak bez (Şekil 1 adım 2) hissettim. </li><li> Yerinde Petri yemekleri tutmak için, tarayıcılar uygun beyaz plaka sahipleri (Gereç ve Yöntem) hazırlamak ve 6 hol vares yemekleri boyutu (Şekil 1 adım 3). </li></ol></li><li> Mikroorganizmanın büyümesi için gerekli ise, sıcaklık kontrollü bir ortamda tarayıcılar koydu. Bilgisayara tarayıcılar bağlayın. </li><li> İsteğe bağlı: bilgisayara rölesini bağlayın ve sıcaklık gradyanı aşmak için tarayıcının açık / kapalı anahtarını atlamasına. NOT: röle ünitesi son derece ısıya duyarlı mikroorganizmaların içindir. Elektronik dengesiz yüzey ısıtmak yok böylece tarayıcıyı kapatır. Tarayıcı yüzeyinin sadece bir kısmını kullanarak, benzer sonuçlar elde edilebilir. </li></ol> 2.. Tarama Yöneticisi yükleyin <ol><li> Http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html bir belirlenen dizine tüm &#39;Tarama Yöneticisi&#39; uygulama dosyalarını kopyalayın. </li><li> Onlar Bilgisayar Yönetimi-&gt; Aygıt Yöneticisi-&gt; Görüntüleme Cihazları (göründükleri gibi tarayıcılar isimlerine göre ScanningManager.exe.config dosyayı yapılandırın <strong&gt; Şekil 2). </li><li> &#39;Tarama Yöneticisi&#39; uygulamasının sorun giderme için, beni oku dosyasını bakın. </li><li> &#39;Tarama Yöneticisi&#39; uygulaması başka evrakların, Documentation.html bakın. </li></ol> 3.. Deneme gerçekleştirin <ol><li> Petri kapları (Şekil 1) hazırlanması: <ol><li> Yaklaşık 2.000 CFU / ml kültür seyreltin. Muntazam plaka yüzeyi üzerinde kültürünün 0.1 ml Plate. </li><li> Sömürgeler ve çanak arasında iyi bir kontrast elde etmek ve nemi absorbe, steril siyah bir parça ile kapak plakası bez hissettim. Plaka üzerinde kapak koymak. </li></ol></li><li> Tarayıcılar üzerinde tutuculara tabak yerleştirin. </li><li> Ekli tarayıcılar listesinden katılan tarayıcılar seçin: Tarama Yöneticisi (Şekil 3) başlatın. (Tekrarlari) alınacak resim sayısını, sonraki görüntüleri arasındaki zaman aralığını (Time boşluk), ve t başlamadan önce gecikme süresini seçino (sonra başlat) deneme. </li></ol> Görüntüler 4. Analizi NOT: hesaplama yöntemleri bir taslak http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications de ticari olmayan kullanım için serbestçe kullanılabilir &quot;ScanLag&quot; kullanılarak MATLAB görüntüleri analiz sağlanır. html. Mevcut Diğer fonksiyonlar yazılım kılavuzunda ayrıntılı olarak, ve bir örnek kod güçleniyor. <ol><li> Ayrı klasörlere her tarayıcıdaki görüntüleri sıralamak. </li><li> Matlab&#39;ın Komut penceresini kullanarak, aşağıdaki işlemleri çalıştırın. Bu işlemleri çalıştırmak için gereken parametreler yazılım kılavuzuna tanımlanır. <ol><li> Ön işleme gerçekleştirmek için PreparePictures çalıştırın: önişleme olarak, bir tarayıcıdan görüntüleri hizalanır. Her Petri görüntülerin her dizisinden kırpılır. Her resim toplandı hangi zaman damgası alınır. </li><li> E&#39;de algılama ve izleme gerçekleştirmek için çalıştırın TLAllPlatesach Petri ayrı ayrı koloniler tespit ve tanımlama numarası tahsis edilir. </li><li> Ekstre verilerin analizi: Her tespit kolonisinin boyutları, zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür. Kolonilerin görünümü dağılımını ayıklamak için Matlab&#39;ın komut penceresinde aşağıdaki fonksiyonları (daha fazla bilgi yazılım kılavuzunda mevcuttur) kullanın: <ol><li> Zaman (Şekil 4) karşı boyutu kolonilerin grafiği ile birlikte belli bir Petri kabı analizini görüntülemek için ScanLagApp çalıştırın. <ol><li> Plaka şimdiki zaman değiştirmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Zamanlama da koloniler alan grafik üzerinde eşleşen bir dikey çizgi ile gösterilir. </li><li> Ilişkili eğrisini görmek için kolonisi üzerinde tıklayın, ve tersi, ilişkili koloni bulmak için bir eğri üzerine tıklayın. Koloniyi belirledikten sonra, fenotip tespit Petri kabı koloni seçerek alınabilir. </li><li> Choo tarafından otomatik analizi filtre kusurlarBir koloni şarkı ve dışlamak butonuna tıklayarak. Koloninin sayısını dışlamak tıklayarak sarıya dönecektir. </li></ol></li><li> Her plaka analiz sonuçlarına geçtikten sonra, sonuçları Özetle: <ol><li> Görünüm kez bir histogram oluşturmak için AddHistograms çalıştırın. </li><li> Dağıtımının bir sağkalım eğrisi gösterimi oluşturmak için plotDeathCurve çalıştırın. </li><li> Deneyde tüm kolonilerin görünümü zaman almak için GetAppearanceTimes çalıştırın. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phenotypic+characterization+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+of+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li>
<li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Nature+of+Bacterial+Lag%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hyg+%28Lond%22%5BJournal%5D)">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li>
<li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+and+generation+time+of+bacteria%2C+with+special+reference+to+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture.</a> J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).</li>
<li>Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+growth+and+division+of+large+numbers+of+individual+bacteria+by+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).</li>
<li>Hertog, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+automated+image+analysis+for+detection+and+phenotyping+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+porous+supports+by+monitoring+growing+microcolonies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies.</a> PloS one. 5, (2010).</li>
<li>Levin-Reisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+imaging+with+ScanLag+reveals+previously+undetectable+bacterial+growth+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells.</a> Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).</li>
<li>Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li>
<li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li>
<li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environmental+stress+on+distributions+of+times+to+first+division+in+Escherichia+coli+populations%2C+as+determined+by+digital-image+analysis+of+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).</li>
<li>Pin, C., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+population+lag+times+as+a+function+of+cell+age%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell and population lag times as a function of cell age.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).</li>
<li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li>
<li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li>
<li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li>
<li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li>
<li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li>
<li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Irish+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li>
<li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li>
<li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li>
<li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence%3A+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Doğrudan gözleme dayalı mikroskobik yöntemler genellikle tek hücre davranışlarını incelemek için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir. Bakteri popülasyonlarında lag kez dağılımının ölçümü sağlar ScanLag, tek hücreli analizinden elde edilen dağılımı ile iyi bir uyum içinde veri sağlayan ve daha yüksek bir istatistik sağlar. Birkaç kritik adımlar iyi çalışması için bu yöntem için yapılması gerekir: Birincisi, iyi bir görüntü elde etmek için 4,800 x 9,600 olmalıdır tarayıcı çözünürlük, üzerinde uzlaşma yok. İkincisi, güç yönetimi modülü (adım 1.6) olmadan, sıcaklık gradyanı dorse yüzeyinde gelişebilir ve büyümeyi etkileyebileceğini unutmayın. Diğer önemli bir adım yanlışlıkla yazılım tarafından koloni sayılır olabilir toz gibi kusurların filtrasyon. Yazılımın dahili arka plan çıkarma genellikle bu kusurları üstesinden gelir, ama bazen &quot;yanlış&quot; kolonileri varel ile filtrelenebilir. (A) mikroorganizmaların büyüme hızı sıcaklıktan etkilenir: Ana sorun giderme adımları çeşitli nedenlerden dolayı, kurulum arası plaka değişimi ele alabilir. Farklı sıcaklık ve nem koşulları nedeniyle inkübatör çanak düzensiz havalandırma veya yere oluşabilir. (B) tarayıcının elektronik tarayıcının yüzeyi boyunca bir sıcaklık gradyanı ısınmasına ve neden olabilir. 10 birlikte önce tarayıcı yüzeyi üzerindeki sıcaklık ölçümleri ile, Bacillus bakteriler üzerinde mekansal ısı derecesinde etkisini gösterir ve Şekil güç yönetimi modülü uygulanmasından sonra (1.6 adım). Bu modül yeni tarayıcılar için gerekli olmayabilir, ve tarayıcı yüzeyinin sadece bir bölümü kullanılır ise, güç yönetimi gereksiz olabileceğini unutmayın. (C) agar besin farklı donukluk ile Tabaklar algılama farklı düzeylerde yol açabilir. 11. gösterileri inci Şekilfarklı opasiteler neden besin agar farklı hacimlerde e tolerans. Deneysel ScanLag tekniği gerçekleştirmek kolaydır ve sadece standart Petri yemekleri mikroorganizmaları plaka ve tarayıcının bir yüzeye koyun gerektirir. Geliştirilen yazılım tüm prosedürü kontrol eder. Görüntü elde etme otomatik olarak yapılır ve koloni izleme için görüntü analizi de otomatik olur. Ayrıca, sistem ölçekli kadar olabilir, aynı zamanda bir çok farklı koşullar ölçmek için. Son olarak, bu yöntem, ticari ofis tarayıcılar dayanır ve bu nedenle, düşük maliyetli. Bu teknik, E&#39;den farklı mikroorganizmaların çalışma uzatılabilir E. coli K-12, ancak bazı noktalar yapılması gerekir. İlk olarak, daha sonra olanlar erken görünen kolonilerin etkisi önceki bir yayında 7&#39;de ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi, değerlendirilmelidir. E. Coli K-12,plaka başına CFU maksimum yoğunluğu. kolonilerin farklı boyutlarda olan diğer suşlar 200 ve koloniler arasındaki diğer muhtemel çapraz talk, farklı bir yoğunluk gerektirebilir. İkinci olarak, plakaların analiz katı, orta ve koloniler arasındaki kontrast bağlı olarak, modifiye edilmesi gerekebilir özel yazılım tabanlı bir eşik için kalibre edilir. Yazılım lag ve büyüme oranı ötesinde diğer koloni özelliklerini elde etmek için de uzatılabilir. Yazılım kodu açıktır ve koloni şekli, parlaklık, yumuşaklık ve renk elde etmek için modifiye edilebilir. Ölçümleri tek hücrelerden köken kolonileri üzerinde yapılmış olduğundan, verileri nüfus seviyesi ölçümlerine göre edilemeyen yeni fenotipleri ortaya koymaktadır. Gecikme süresi dağılımının önemi antibiyotiklerin varlığında ortaya çıkar. Birçok antibiyotikler sadece artan hücrelerine karşı etkili olduğu bilinmektedir; Bu nedenle sürece hücreler gecikme aşamasında kalır ve büyümek değil, onlar proBu antibiyotik 21 etkilerinden koruma altında. Kalanlar bakterilerin sayıları antibiyotik tedavisi 15,22,23 sırasında zaman aralıklarında değerlendirildiğinde, persisters adı bakteri alt popülasyonu, çoğu zaman ortaya çıkar. Bazı durumlarda, antibiyotik tedavisine uzun süreli bağışıklık lag kaynaklanmaktadır. Bu kurulumu kullanarak, bu gecikme ortaya ve genellikle önemsiz olmayan bir dağılımı 24 (Şekil 6) vardır. Bu yöntem, aynı zamanda az bulunan mutantların alınmasını sağlar. Örneğin, mutasyona uğramış bir nüfus kaplama sonrası, mutantlan fenotip göre tespit edilebilir ve seçim olmadan, direkt olarak izole edilmiştir. Kurulum da at kolonilerinin yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak kolonilerin büyümesini ölçmek yoluyla hücre-hücre etkileşimleri izleyebilir ve bu çekirdek algılama veya sarılmış bakterilerin yayılması gibi olayları ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak gelecek deneylerle ortaya boyutlu bilgi mikrobiyal nüfusun daha iyi karakterizasyonu yol açacaktırs tıbbi ve çevresel araştırma gelişmeler.

Bakteriler çok stresli koşullara yanıt gelişmiştir. Strese adaptasyon genel özelliği, büyüme dinamikleri 1,2 bir değişimdir. Üstel büyüme oranı ve gecikme süresi, yeni koşullara uyum için gerekli yani zamanı: Büyüme dinamikleri iki parametre çoğunlukla karakterizedir. Yüksek verimli yöntemler, çok sayıda büyüme oranı ölçümleri odak ise yeni koşullara uyum karakterizasyonu için önemli bir parametre olan, ancak, gecikme süresi, çoğu zaman bir gözden parametredir. Değişen koşullara uyum Kantitasyonu geleneksel zahmetli manuel yöntemler 3,4 kullanılarak yapılmıştır. Daha yakın zamanda, gelişmiş teknikler tek hücre 5,6 analizi için geliştirilmiştir. Ancak, büyümenin gecikmesi yavaş büyüme (yani bir gecikme süresi) 2,3 aşağıdaki normal büyüme ayırt etmek hala zor. Otomatik bir yöntem, ScanLag 7 inşa edildiBu iki benzer fenotip arasında ayrım. Gecikme süresi dağılımının çalışmanın önemini çarpıcı bir örnek antibiyotik tedavisi altında ortaya çıkar. Antibiyotik ve diğer gerilmeler çoğu sadece aktif olarak büyüyen hücrelerini öldürmek ve bu nedenle, &quot;geri kalmış&quot; edilmiş hücreler 8 korunur. Gecikme süresini izlemek için, bir mikroskop altında tek hücreleri gözlemlemek ve ilk bölümü için zaman izleyebilirsiniz. Bu yöntemin bir dezavantajı, büyük bir dinamik zaman aralığı sınırlı olduğunu; Erken büyüyen bu hücreler daha uzun etkili bir gecikme süresi ile hücrelerin büyümesini azaltarak, üstel bir oranda yüzeyini kapsamaktadır. Akış odaları kullanımı biraz bu 5 circumvents, ancak hücrelerin sınırlı sayıda izlenebilir ve nüfusun çoğunluğu artan başladıktan sonra lag faz çıkmak bakterilerin fraksiyonu gözlenen olamaz. Bu kısıtlamalara rağmen, çeşitli çalışmalar di düzeyinin etkisi değerlendirilmiştirfferent tek hücre mikroskopi 9-12 kullanılarak gecikme süresi dağılımına vurguluyor. Gecikme süresi dağılımını izlemek için başka bir yolu bulanıklık ölçümleri 13,14 geçer. Her biri tek bir hücreden ait birçok paralel kültürler, zamanla kültüründe bakteri sayısını ölçen bir optik yoğunluk okuyucu yetiştirilmektedir. Bu yöntem, ekstrapolasyon hassasiyeti ile bir plaka içinde kuyu sayısı ile sınırlıdır. Otomatik bir yöntem bile çok uzun bir gecikme süresine sahip bir popülasyonda bakterilerin küçük bir yüzdesi için, değerlendirilecek gecikme süresi ve büyüme süresi dağılımı sağlayan, ScanLag adlandırılan geliştirilmiştir. Yöntem, geleneksel besleyici agar plakaları 15 (Şekil 1) kolonilerin tespiti dayanmaktadır. Algılamasını 16,17 periyodik plakaların görüntüleri elde etmek için ev yazılım tarafından yönlendirilir ticari tarayıcılar 18 bir dizi otomatikleştirmek için tasarlanmış oldu. Yazılım olduotomatik olarak görüntüleri analiz ve bu süre 80 piksel 20 piksel büyümeye olarak burada tanımlanan her koloninin, her koloni ve büyüme zamanı görünüm zamanı olarak kantitatif parametreleri 19,20, çıkarmak için tasarlanmıştır. Burada sistemin kurulum ve daha iyi bir kullanıcı arayüzü ile geliştirilmiş otomatik bir görüntü analiz yazılımı kullanımı da dahil olmak üzere, detaylı bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, bu tür morfolojisi ve rengi gibi koloni diğer özelliklerini ölçmek için adapte edilebilir. Bu tür parametrelerin ölçülmesi boyutlu phenomics olarak sistem kullanılmasını sağlayacaktır. Yöntem, tek hücrelerden koloniler tespit gibi, sistem nüfus düzeyinde ölçümleriyle ölçülemez yeni fenotipi ortaya çıkarabilir. Bu teknik az varyantlarının saptanması ve alınmasını sağlayan ve istenen özellikleri için tarama kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB et suyu</td><td>BD</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 90 mm</td><td>Miniplast</td><td>20090-01</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection v37</td><td>Epson</td><td>B11B207201</td><td>Optik çözünürlüklü Düz Yataklı Tarayıcı: 4.800 dpi, Donanım Çözünürlüğü:&nbsp; 4.800 x 9.600 dpi, renk bit derinliği 48 bit.</td></tr><tr><td>Epson Perfection v200</td><td>Epson</td><td>B11B188011</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 3490</td><td>Epson</td><td>B11B177011</td><td></td></tr><tr><td>ADU200 USB Röle</td><td>ONTRAK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril siyah keçe kumaş parçaları</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Yaklaşık 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Beyaz plaka tutucular</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Yüzey boyutu, 6 x 99 mm çapında delikli</td></tr><tr><td>Özel yapım Petri kabının boyutunda Delerin halkaları</td><td>İç çap: 72 mm Dış çap: 86 mm Üst dış çap: 90 mm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

scanlag: yüksek verim colony büyüme niceliksel ve zaman lag

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Büyüme dinamikleri mikroorganizmaların temel özellikleridir. Büyümenin kesin olarak ölçülmesi mikrobiyolojide önemli bir hedeftir. Büyüme dinamikleri, hem mikroorganizmanın iki katına çıkma süresinden hem de bir durumdan diğerine geçerken büyümedeki herhangi bir gecikmeden, gecikmeden etkilenir. ScanLag yöntemi, bu iki bağımsız özelliğin, her biri tek bir hücreden kaynaklanan koloniler düzeyinde karakterizasyonunu sağlayarak, gecikme süresinin ve büyüme süresinin iki boyutlu bir dağılımını oluşturur. ScanLag'de, geleneksel besleyici agar plakalarındaki kolonilerin tespit edilmesi için geçen sürenin ölçümü, kurum içi bir uygulama tarafından kontrol edilen bir dizi ticari tarayıcıda otomatikleştirilir. Petri kapları tarayıcılara yerleştirilir ve uygulama periyodik olarak görüntüler alır. Koloni büyümesinin otomatik analizi daha sonra her bir koloninin ortaya çıkma süresini ve büyüme hızını döndüren bir uygulama tarafından yapılır. Koloninin şekli, dokusu ve rengi gibi diğer parametreler, hücre alt popülasyonlarının çok boyutlu haritalanması için çıkarılabilir. Son olarak, yöntem, daha fazla karakterizasyon için spesifik büyüme fenotiplerine sahip nadir varyantların elde edilmesini sağlar. Teknik, bakteriyolojide antibiyotiklerin kalıcılığına neden olabilecek uzun gecikmenin tanımlanması için ve ayrıca fenotipik ekranlar için genel bir düşük maliyetli teknik olarak uygulanabilir.

Gecikme süresi dağılımı ekstre bir örnek olarak, Şekil 5, bir tarama deneyinde yapılabilir gibi, zaman içinde tek bir plaka üzerinde belirli özelliklere sahip her bir koloni tespit etmek ve izlemek için ScanLag yeteneğini göstermektedir. Mikroorganizmanın kültür heterojen olduğunda, farklı popülasyonlar deneyi sırasında kendilerini ortaya çıkarabilir. Örneğin, Şekil 6, bu görünüm niceliğini gösterir ve dolayısıyla E bir mutant suşu içinde bimodal duraklama süresi dağılımı ortaya koymaktadır coli. Hücrelerin büyüme hızı koloninin ortaya çıkış zamanı etkilemektedir. Koloniler aynı oranda Olgunlaştıklarında geç ortaya gecikme süresi (Şekil 7) atfedilebilir. Yöntem, gerçekten tek hücre gecikme süresini ölçen doğrulamak için, tek hücreli bir mikroskopi kullanılarak elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında, ScanLag; Bu doğrulama azalan birönceki bir yayında 7 ayrıntılı ribed. Bu yöntem mikroskobu ile değerlendirilebilir çok daha fazla hücre izlenmesini sağlar. Mikroskopi kullanılarak ve ScanLag kullanılarak elde edilen dağılımlar, büyük ölçüde üst üste gelir. ScanLag dağılımı biraz daha geniştir; teorik analizler bölünme zaman, standart sapmanın düzenin olduğu tahmin genişletmektedir. Büyüme süresi, her bir suş için farklı ise, görünüşte gecikmenin kökeni ayrıca diğer yöntemler kullanılarak incelenmelidir. Daha sonra kolonilerin görünüşüne erken görünen kolonilerin etkisi incelenmiştir. Kontrol deneyleri 7 daha sonra görünüm olarak uzun plaka başına kolonilerin sayısı (Şekil 8) 200&#39;ü aşmadı olarak etkilenmez olmadığını doğruladı. Başka bir kontrol deneyi plaka üzerinde koloninin yeri görünümü zaman 7 etkileyen olmadığını doğruladı. P analizilates büyüme ortamı veya mikroorganizma türü mevcut besin bağlı olarak değişiklik gerekebilir belirli eşikleri kalibre edilir. Şekil 9&#39;da gösterildiği gibi Bununla birlikte, analiz eşik geniş bir ürün yelpazesi için oldukça sağlamdır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Kolonisi görünüm dağılımını oluşturmak için gerekli adımların şematik diyagramı. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Bağlı tarayıcılar, ve yapılandırma dosyasının isimlerini gösteren Aygıt Yöneticisi bir ekran görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Tarama Yöneticisi Şekil 3.. Bir ekran görüntüsü. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. ScanLagApp bir ekran görüntüsü. Plakasının bir görüntü, sol bölmede üzerinde olduğunu ve kılavuzda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi her koloninin büyüme eğrileri, sağ bölmedeki vardır. Iki veya daha fazla koloni birleştirme zaman koloniler alan eğrilerinin bazı ani ortaya çıkar. Kolonilerin birleştirme durumda, bu kolonilerin alan bağlantı bölgesi olarak kabul edilir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Bir plakanın analiz temsili bir sonucu. (A), deney sonunda tespit uygulamanın çıkışı bir görüntü. Her koloni alanı tespit renkli ve benzersiz bir kimlik numarası atanır. Oklar Koloni (yoğunluk bir eşiğe dayalı olarak tespit edilir B&#39;de ölçülen temsil etmektedir koloniler LB agar veya M9 agar üzerine E. coli kolonileri için, bu eşiği 0.03 &#39;tür. Başka bir ortama veya bakteriler, bu eşik işlev ProcessPictures ayarlanabilir .) 10 piksel üzerinde sadece nesneleri (bu eşik işlev MatchColonies değiştirilebilir) sayılır. Bir koloninin Algılama yaklaşık 10 5 bakteri başlar. Bu plakanın dört temsili koloni zamana karşı piksel olarak alanın (B) araziler. Koloni tespit edildiğinde her koloninin &#39;görünümü zamanı&#39; olduğunu. Zaman sağa sola büyümeye olarak her koloninin &#39;büyüme zamanı&#39; burada tanımlanmıştır80 piksel (bu sınırların işlevini getAppearanceGrowthByVec kullanarak ayarlanabilir) m 20 piksel. Yazılım üst sınır ulaşmadan önce birleşerek kolonileri dışlar. Kendi özelliklerine göre özel bir koloni tanımlanması belirlenmesi sayısı ve her bir koloni atanan renk sayesinde son derece kolaydır. Örneğin 1. kolonilerinin, 56, 77 ve 124 hem de grafikler vurgulanır. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6.. Görünüm miktar modlu gecikme süresi dağılımını ortaya çıkarabilir., Iki farklı suşları için görünüm kez ScanLag analizi histogramlarının Karşılaştırılması. Mavi hat: yabani tip suşu katlanarak (Toplam: 1.320 koloniler) büyüyor; kalmış bakterilerin (: 1.529 koloniler Toplam) ile zenginleştirilmiş kırmızı hat-yüksek kalıcılık mutant. (A) Normalleştirilmiş görünüm histogramları. Pikkatlanarak büyüyen hücre görünümünü bir tespit koloni büyümeye tipik zamandır. Ankastre: Bimodal gecikme süresi dağılımını gösteren log-aralıklı bidonları üzerinde gerçek gecikme süresini almak için üstel kültürünün zirve zamanını düşüldükten sonra mutant suş aynı histogram. (B) logaritmik bir ölçekte, (A) &#39;da anlatılanla aynı verilerin Survival fonksiyonu. Bu gösterim mutant suşunun geç ortaya kuyruk artırır. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. Görünüm dağıtım ve büyüme süresi dağılımı. (A) ve (B) iki boyutlu görünüm zaman histogramlarını ve iki farklı koşullar (Yazılım üst sınır ulaşmadan birleşti kolonileri hariç) büyüme zaman gösterecek. (C) histogramları karşılaştırılmasıBüyüme kez (D) benzer iken iki suşları görünümü zamanında fark göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Şekil 8,. Erken Kolonilerin görünümü, daha sonra koloni görünümü ile karışmaz. (A), tek başına kaplama, vahşi tip hücre süre dağılımı kalmaktadır. (B) izin veren sıcaklığa transfer edildikten sonra, tek başına soğuk hassas bir soyun süre dağılımı kalmaktadır. (C) ile aynı koşullar altında bir araya kaplama her iki soy süresi dağılımı kalmaktadır. Siyah çizgi ayrı ayrı gerginlik ölçerken elde edilen verilere dayalı beklenen dağılımını gösterir. İyi birbeklenen ve ölçülen dağılımları arasında greement sürece plaka başına kolonilerin toplam sayısı 200, aşağıda olduğu gibi elde edilir. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. Şekil 9 algılama eşiği koloni görünüm dağıtım şeklini etkilemez koloni görünümü dağılımı iki farklı boyutlarda eşik kullanarak aynı veri kümesi için analiz edilmiştir; (A) eşik büyüklüğü 10 piksel; (B) eşik boyutu 50 piksel. Histogramının başına hücre sayısı: yakl. 1.500. Farklı algılama eşiği sadece algılama zaman bir kayma ile sonuçlanır. <img alt="Şekil 10," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> 10. Sıcaklık kararlılığı ölçümleri ACR ŞekilGüç Yönetimi olmadan tarayıcı üzerinde yetiştirilen Bacillus subtillis kolonileri ile bir levhanın oss tarayıcının yüzey. (A) görüntü. Yüzey alt sıcak olan ve bu nedenle koloniler daha hızlı büyür. Plakanın yanındaki kademeli hattı ısı derecesinde bir şematik temsilidir. (B) ısı stabilitesi, tarayıcının yüzeyi boyunca yerleştirilmiş iki termokupl ile ölçüldü. Tarayıcı her tarama sırasında ve zamanla ısınır. (C) Güç Yönetimi ile, sıcaklık üniforma ve koloniler benzer oranlarda büyür. (D) Güç Yönetimi modülü ile (B) aynı. ± 0.2 ° C sıcaklık kararlılığı <img alt="Şekil 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Şekil 11. Görünüm dağılımındaki farklılıklar di bağlı olabilirKatı ortamın hacimlerde fferences. Aynı bakteri kültürü agar yüzeyinden farklı yükseklikte sonuçlanan LB agar farklı hacimlerde plakaları üzerine kaplanmıştır. Farklı yükseklikleri plakaların farklı donukluk ve bu nedenle farklı bir zamanda algılama yol açtı. Arası plakalar fark kontrol ve farklı yükseklik koşulları arasındaki fark edildi. LB Agar 30 ± 0.5 ml eşit hacimlerde plakaları arasındaki (A) tipik farklar. Farklı yükseklik koşullar arasında (B) Fark: görünüm dağıtımı 30 ± 0.5 ml (yeşil) ve 40 ± 0.5 ml (mavi), 20 ± 0.5 ml (kırmızı) hacimli plakaları için ölçülmüştür. Her koşul, 6 farklı plakalar ortalamasıdır. Sürece levhaların hacmi ± 5 ml aralığı içinde olduğu gibi, benzer bir donukluk ve benzeri bir görünüm süresi dağılımına yol açar.

ScanLag, büyümedeki gecikmeyi, yani gecikme süresini ve paralel olarak binlerce hücre için kolonilerin büyüme hızını ölçmek için yüksek verimli bir yöntemdir. ScanLag kullanarak tarama, tek bir varyant düzeyinde uzun gecikme süresi ile yavaş büyüme arasında ayrım yapılmasını sağlar.

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Bu prosedürün genel amacı, tek bir varyant düzeyinde uzun lag süresi ile yavaş büyüme arasında ayrım yapabilmek için bir bakteri kültürünün lag dağılımını nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle tek bir bilgisayar tarafından tanımlanan bir tarayıcı dizisi düzeneği kurularak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, konvansiyonel besiyeri agar içeren Petri kaplarına tanımlanmış bir koloni oluşturan birim bakteri kültürü ekmektir.Ardından, kaplar tarayıcılardaki özel tutuculara yerleştirilir ve tarayıcılar ile kolonilerin zaman atlamalı (time-lapse) görüntüleri alınır. Son adım, görüntüleri otomatik olarak analiz eden ve her bir koloninin ortaya çıkma süresi ile büyüme süresi gibi kantitatif parametreleri çıkaran scan lag yazılımını kullanarak görüntü analizini gerçekleştirmektir. Son olarak, bu verileri kullanarak gecikme histogramini (lag histogram) oluşturmak için MATLAB fonksiyonları kullanılır.Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, yavaş varyantların tespitine olanak tanıdığı için kalıcı enfeksiyonların teşhisine kadar uzanmaktadır. Başlamak için, ilgili sıcaklık ve nem seviyelerinde çalışabilen, 4.800 DPI optik çözünürlüğe, 4.800 x 9.600 DPI donanım çözünürlüğüne ve 48 bit renk derinliğine sahip bir düz yataklı tarayıcı seçin. Bilgisayara birden fazla tarayıcının bağlanmasına ve tanımlanmasına izin veren bir tarayıcı seçin.Petri kaplarının kendine özgü, önemli bir hacmi vardır. Ticari tarayıcılarda genellikle kullanılan kağıdın aksine, koloniler agar tabakasının üzerinde, tarayıcı yüzeyinin yaklaşık beş milimetre yukarısında yer alır. Çoğu tarayıcı için koloniler odak noktasında olacaktır.Petri kaplarını yerinde tutmak amacıyla plakaların üzerini örtmek için steril siyah keçe bez parçaları hazırlayın. Mikroorganizmanın büyümesi için gerekliyse, tarayıcılara uygun ve kapların boyutunda altı deliği olan beyaz plaka tutucular hazırlayın. Tarayıcıları sıcaklık kontrollü bir ortama yerleştirin.Tarama yöneticisini yüklemek için tarayıcıları bilgisayara bağlayın. Tüm tarama yöneticisi uygulama dosyalarını tarama lag web sitesinden belirlenmiş bir dizine kopyalayın. Windows XP işletim sistemine sahip bir bilgisayar kullanın ve microsoft'un kurulu olduğundan emin olun.net framework sürüm 2.0 yüklendi. Durduruldu. Tarayıcı isimlerini bilgisayar yönetimi aygıt yöneticisi görüntüleme aygıtları bölümünde bulun. Ardından, tarama yöneticisi yapılandırma dosyasını bu isimlere göre düzenleyin.Bir deney gerçekleştirmek için öncelikle kültürü mililitre başına yaklaşık 2000 CFU olacak şekilde seyreltin. Ardından, kültürün 0,1 mililitresini konvansiyonel besiyeri agarı ile hazırlanmış Petri kaplarına homojen bir şekilde ekimleyin. Daha sonra, koloniler ile kap arasında iyi bir kontrast sağlamak ve nemi absorbe etmek için kabı steril siyah keçe kumaş bir parçasıyla örtün.Plakanın kapağını kapatın ve plakaları tarayıcılardaki tutuculara yerleştirin. Tarama yöneticisini başlatın. Bağlı tarayıcılar listesinden katılacak olan tarayıcıları seçin.Ardından, görüntü analizi için çekilecek görüntü sayısını, ardışık görüntüler arasındaki zaman aralığını ve deney başlamadan önceki gecikme süresini seçin. İlk olarak, MATLAB komut penceresini kullanarak her tarayıcıdan gelen görüntüleri ayrı klasörlere ayırın. Ön işleme adımlarını gerçekleştirmek için önce prepare images komutunu çalıştırın.Ön işleme aşamasında, tarayıcıdan elde edilen görüntüler hizalanır. Her bir Petri kabı, görüntü dizilerinin her birinden kırpılarak ayrılır. Her bir görüntünün toplandığı zaman bilgisi, zaman damgası kaydından alınır.Saptama ve takip işlemini gerçekleştirmek için tüm plakaların zaman atımlı görüntüleri alınır, her Petri kabındaki koloniler tespit edilir ve bunlara bir tanımlama numarası atanır. Tespit edilen her koloninin boyutu zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür. MATLAB komut penceresini kullanarak kolonilerin görünüm dağılımı çıkarılır.Öncelikle, belirli bir Petri kabının analizini kolonilerin boyuta karşı zaman grafiği ile birlikte görüntülemek için scan lag uygulamasını çalıştırın. Ardından, plakanın mevcut zamanını değiştirmek için kaydırıcıyı kullanın. Zamanlama, kolonilerin alan grafiği üzerindeki eşleşen bir dikey çizgi ile de belirtilecektir.İlgili eğriyi görmek için bir koloniye veya tersi işlem için bir eğriye tıklayın. Koloni tanımlandıktan sonra, tanımlanan Petri kabından koloninin seçilmesiyle fenotip elde edilebilir. Bir koloni seçip hariç tut düğmesine tıklayarak otomatik analizdeki hataları filtreleyin.Hariç tut seçeneğine tıklandığında, koloni numarası sarıya dönecektir. Her plağın analiz sonuçları incelendikten sonra sonuçları toplayın. İlk çalıştırmada, görünüm histogramı oluşturmak için histogramları ekleyin.Ardından, dağılımın bir sağkalım eğrisi temsilini oluşturmak için zamanlar üzerinden ölüm eğrisi grafiği çizilir. Lag süresi dağılımı çıkarımına bir örnek burada gösterilmiştir. Scan lag, bir tarama denemesinde yapılacağı gibi, tek bir plakadaki her bir koloniyi zaman içinde spesifik özellikleriyle tanımlayabilir ve takip edebilir.Mikroorganizma kültürü heterojen olduğunda, farklı alt popülasyonlar analiz sırasında kendilerini gösterebilir. Bu şekil, görünme miktarını göstermekte ve böylece bir e coli mutant suşundaki bimodal lag süresi dağılımını ortaya koymaktadır. Burada, iki farklı koşul için görünme süresinin ve büyüme süresinin iki boyutlu histogramları gösterilmiştir.İki suşun histogramlarının karşılaştırılması, büyüme süreleri benzer olmasına rağmen görünme zamanındaki farkı göstermektedir. Koloniler aynı hızda büyüdüğünde, geç görünme durumu lag fazı süresine bağlanabilir. Erken görünen kolonilerin, daha sonra görünen kolonilerin ortaya çıkışı üzerindeki etkisi incelenmiştir.Burada, tek başlarına ekilmiş yabani tip hücrelerin lag süresi dağılımı ve soğuğa duyarlı bir suşun lag süresi dağılımı gösterilmektedir. Permisif sıcaklığa aktarımdan sonra tek başlarına ekilen kontrol deneyleri, plaka başına toplam koloni sayısı 200'ü aşmadığı sürece daha geç ortaya çıkmanın etkilenmediğini doğrulamıştır. Bu prosedür takip edilerek.Fenotipin genetik mi yoksa epigenetik mi olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, ilgi çekici büyüme fenotipine sahip koloniler üzerinde tüm genom dizileme veya ekspresyon analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Kurokawa, M. ve diğerleri. Bakteriyel Büyümenin Kesin, Yüksek Verimli Analizi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, mikroplaka okuyucu kullanılarak bakteri büyümesinin yüksek verimli niceliklendirilmesini gösteriyor. Kültür hazırlığı, optik yoğunluk ölçümü ve büyüme dinamiklerinin analizi aşamalarını özetler.

Mikroplaka okuyucu kullanarak bakteri büyümesinin hassas ve yüksek verimli analizi

Bu video, koloni oluşturan birim testi ile makrofajların Listeria monocytogenes enfeksiyonunu belirlemek için bir in vitro miktar tayin tekniğini göstermektedir. Agar plakasındaki bakteri kolonileri, konak savunma mekanizmasından kaçan ve makrofajlar içinde hayatta kalan hücre içi bakteri popülasyonunu temsil eder.

Konak Hücrelerde Bakteriyel Enfeksiyonun Koloni Oluşturan Birim Testi ile Miktar Tayini

Bu videoda, hücre dışı matris sertliğine bağlı Listeria monocytogenes'in endotel hücreleri yoluyla yayılımını değerlendirmek için kantitatif hızlandırılmış mikroskopi gösterilmektedir. Daha yumuşak bir hidrojel, daha sert muadillerine kıyasla endotel hücreleri yoluyla daha hızlı bakteri yayılımını kolaylaştırır ve matris sertliğinin bakteri yayılımı üzerindeki etkisini vurgular.

Hücre Dışı Matriks Sertliğine Bağlı Bakteri Yayılımını Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Maya mayalarındaki canlı hücrelerin bir hücreli katlanarak değerlendirilmesi (ODELAY) olarak adlandırılan zaman atlamalı mikroskobi kullanarak katı miyar üzerinde kolonilere dönüşürken tek tek maya hücrelerinin büyüme fenotiplerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kolonilere dönüşen genetik olarak özdeş hücrelerin popülasyon heterojenliği doğrudan gözlemlenebilir ve nicelenebilir.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.

Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Radyoaktif bakteriyel kültürlerin mikrotiter yemeklerde büyümesi, (p) ppgpp dahil olmak üzere birden çok teknik ve biyolojik çoğalan nükstrütit havuzu zenginliğini sağlayan yüksek verimlilik örneklemesini kolaylaştırır. Fizyolojik stres kaynakları tarafından provoke edilen büyüme geçişleri ve stres kurtarma etkileri izlenebilmektedir.

Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma

Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Bu yöntem, koloni oluşturma birimlerine (CFU'lar) plaka oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatı kullanarak mikrobiyal bolluğu ölçer ve tüm sinek homojenat numunelerinde Drosophila mikrobiyomuna uygulanır. CFU'lar, burada sağlanan otomatik bir görüntü analiz yazılımı ile sayılır.

Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı

Öğrenin bakteri kolonilerinin gecikme süresi ve büyüme hızını yüksek verimli görüntüleme ile niceliksel analiz etme yöntemini. Bu teknik, tek varyant düzeyinde uzun gecikme ile yavaş büyümeyi ayırt ederek kalıcı enfeksiyon teşhisine olanak tanır.

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Daha fazla video keşfet