Yüksek homojenizasyon ve Seri Konsantrasyon konsantre, Lipid-tabanlı Oksijen Mikro Emülsiyonlar imalatı

Bu prosedürün genel amacı, intravenöz oksijen iletimi için büyük hacimde, kendiliğinden birleşen, lipid tabanlı oksijen mikrobaloncukları veya OMS üretmektir. Bu işlem, OMS üretmek ve seri olarak konsantre etmek için yüksek kesme kuvvetli bir homojenizatör ve gaz sızdırmaz bir tank kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, hacimce %70 oksijen içeren bir LOM emülsiyonu ekstrüde etmek için modifiye şırıngalar kullanmaktır.

Ardından, hacimce %90 oksijen köpüğü elde etmek için emülsiyon santrifüjle konsantre edilir. Son adım, hacimce oksijen yüzdesinin hesaplanması ve ışık saçılma teknolojisi kullanılarak partikül boyut dağılımının değerlendirilmesi yoluyla kalite kontrolün gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, yüksek kesme kuvvetli homojenizasyon, hacimce %90 oksijen içeren iki litre OMS üretir.

Bu tekniğin sonikasyon ve amalgamasyon gibi mevcut üretim yöntemlerine göre temel avantajı, homojenizasyonun, terapötik oksijen iletiminin büyük hayvan deneyleri için gerekli olan litre düzeyindeki hacimlerde, kendi kendine birleşen mikrobaloncuklar üretmesidir. Bu tekniğin kullanım alanlarından biri, oksijen gazı ile doldurulmuş mikrobaloncukların oksijeni saniyeler içinde deoksiyhemoglobine aktarması ve kanın oksijen içeriğinin üç katını taşıması nedeniyle yüksek hipoksemiye sahip hastaların tedavi edilmesidir Visual. Bu yöntemin gösterimi, homojenizatör başlığının derinliği açısından önemlidir.

Tamamen oksitlenmiş bir ortamın sürdürülmesi ve konsantre LMS ile sulu fazın ayırt edilmesi zor olabilir. Lipid bazlı oksijen, mikrobaloncuklar veya OMS üretim sistemi; tek kademeli bir karıştırıcı ile donatılmış bir tutma ve konsantrasyon tankı (HCT), hat içi yüksek kesmeli bir homojenizatör, sıvıyı HCT ile homojenizatör arasında taşımak için bir silindir pompa ve bir ısı değiştiriciden oluşur.

Sistem kurulumuna başlamak için, iki taban portu ve üç yan portu bulunan sterilize edilmiş, geniş ağızlı, dört litrelik cam toplama kabını tek kademeli karıştırıcının altına yerleştirin; HCT port numarası bir olan taban portlarından birine, konsantre emülsiyonun toplanması için ucuna üç yollu musluk takılmış, yaklaşık 10 inç uzunluğunda, üç sekizde bir inç iç çaplı steril şeffaf hortum takın. Ardından, ikinci taban portu olan port numarası ikiye, yaklaşık 36 inç uzunluğunda, üç sekizde bir inç iç çaplı steril hortum takın. Bu hortumu roller pompadan geçirin.

Yüksek kesmeli homojenizatörün girişi, iki porta sahip bir T parçasıyla donatılmıştır. Port numara ikiyle roller pompayı birbirine bağlayan hortumu, T parçasının yan portuna bağlayın. Diğer portu, düşük akışlı bir oksijen gaz akış ölçer kullanarak bir oksijen tankına bağlayın.

Yüksek kesme homojenizatörünün çıkış portunu, 4 °C'de tutulan bir hat içi ısı değiştiricinin giriş portuna bağlayın. Isı değiştiricinin çıkış portunu, kapalı bir döngü sistemi oluşturacak şekilde HCT'nin dönüş portuna bağlayın. Oksijen tankını, bir debimetre aracılığıyla HCT'nin dört numaralı portuna bağlayın.

Son olarak, atmosfere açık bir gaz bileşimi monitörünü HCT'nin üst portuna bağlayın. Bu prosedüre başlamak için, HCT'nin tabanına 20 gram GMP bir iki DYS steer yağ, SN gliserol üç PHOSPHOCHOLINE veya DSPC ve 10 gram kolesterol yerleştirin. HCT'ye bir litre plasma light A ekleyin ve mümkün olduğunca çok lipidi sulu faza entegre ederek bir dakika boyunca elle karıştırın.

Tek aşamalı karıştırıcıyı, karıştırıcı başlığının tamamının sulu faz tarafından kaplandığından emin olarak sulu fazın içine indirin. Ortam havasının baş boşluğunu kirletmesini önlemek için, HCT'nin üst kısmının gaz sızdırmaz olduğundan ve açık yan portların bulunmadığından emin olmak amacıyla kauçuk contalar veya bant kullanın. Dördüncü porta bağlı gaz kaynağını açın ve HCT baş boşluğundaki oksijen fraksiyonu %95'in üzerine çıkana kadar bekleyin. Tek aşamalı karıştırıcıyı kullanarak öncül emülsiyonu beş dakika boyunca karıştırın. 5,000 RPM'de, elde edilen karışım soluk beyaz görünmeli ve görünür lipid topakları içermemelidir.

Karıştırıldıktan sonra, kullanılmayan lipid su karışımı, tek seferlik kullanımdan önce dört derece Celsius'ta 30 güne kadar saklanabilir. Roller pompayı 1.3 litre/dakika veya LPM hızında çalıştırarak tüm kapalı döngü sistemi öncü emülsiyon ile doldurun. Sistem doldurulduktan sonra, LO'ların üretimine başlamak için pompayı 1.3 LPM hızında açık tutun.

Hat içi yüksek kesme homojenizatörünü 7.500 RPM'ye ayarlayın. Hemen ardından, homojenizatörün giriş kısmına 0,5 LPM hızında oksijen akışını başlatın. HCT'deki tek kademeli karıştırıcıyı 3.500 RPM'de açık tutun.

Oms, hat içi homogenizatördeki rotor kanatları ile emülsiyon süzgeçlerinin ara yüzeyinde oluşur. İlk birkaç dakika içinde sıvı gözle görülür şekilde daha viskoz hale gelmelidir. Sistemi 15 dakika boyunca çalıştırın ve ardından yüksek kesmeli homogenizatörü ve buna bağlı oksijen girişini kapatın.

Bu işlem faz ayrılmasını azaltır ve ürünün HCT içinde nispeten homojen kalmasını sağlar. Seri konsantrasyon aşaması sırasında gaz dolgulu emülsiyon hacminin yaklaşık iki ila üç kat artması gerektiğini unutmayın. Üretilen OMS'leri toplamak için kullanılan 140 mililitrelik luer lock şırıngalar, daha önce şırıngaya 100 mililitre hava çekilip ardından 140 mililitre işaretinin üzerindeki fazla piston ve şırınga materyalinin kesilip atılmasıyla modifiye edilmiştir.

Toplama kabının bir numaralı taban portuna bağlı olan stop kokuna steril modifiye bir şırınga takın; pistonu indirmek için dişli pens kullanın ve 100 mililitre sıvı çekin, şırınganın kapağını sıkıca kapatın ve tüm sıvı uzaklaştırılana kadar işlemi tekrarlayın. Şırıngaları, kapaklı uçları aşağıya bakacak şekilde, soğutmalı bir santrifüj kovasında 225 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası üç katman materyal belirginleşecektir; alt kısımdaki fazla bulanık sulu fazı boşaltıp atın.

İkinci katman parlak beyazdır ve konsantre oms içerir. Ortam gazı kontaminasyonunu önlemek için üç yollu bir musluk kullanarak konsantre köpüğü gaz geçirmez bir cam şırıngaya aktarın. Patlamış oms'lardan kaynaklanan serbest oksijen gazı içeren son katmanı atın.

Köpük kalitesi, gaz konsantrasyonu aşağıdaki şekilde hesaplanarak değerlendirilebilir. Yüksek kaliteli bir köpük, hacimce yüzde 90 veya daha fazla bir gaz konsantrasyonuna ulaşacaktır; ikinci bir kalite kontrol aşamasında ise partikül boyutunun beklenen aralıkta olup olmadığını belirlemek için optik ışık saçılımı ile mikro kabarcık boyutları ölçülür. Homojenizasyon süresindeki veya formülasyondaki bir değişikliğin kabarcık boyutunu değiştirebileceği ve konsantre oms içeren cam şırıngaların sıkıca kapatılması gerektiği unutulmamalıdır.

Luer lock uçlu şırıngalar 22 °C, 4 °C veya -20 °C'de saklanabilir. Daha düşük sıcaklıklar, raf ömrü stabilitesini artırabilir. Bu protokol kullanılarak 90 dakika içinde iki litreye kadar konsantre OMS üretilebilir.

10 µL'lik bir OMS örneğinin ışık mikroskobu ile görüntülenmesi, küresel OMS'lerin yanı sıra nispeten fazla miktarda lipid kalıntısı olduğunu ortaya çıkarmıştır. Aynı OMS örneği optik saçılım ile değerlendirildiğinde, ortalama partikül çapı 2,624 ± 0,332 µm olarak belirlenmiştir. OMS'lerin %90'ından fazlası 10 µm'den küçük çaplıdır ve popülasyon polidisperstir.

Emülsiyon viskozitesi, gaz fraksiyonuna ve dolayısıyla mikrobaloncuk konsantrasyonuna güçlü bir şekilde bağımlıydı. Hacimce %60, 70 ve 90 gaz içeren LOM emülsiyonunun iki mililitrelik alikotları, 40 milimetrelik paralel plakalar kullanılarak kararlı durum akış taraması ile incelendi.

Stres 0,1 ile 1000 gass arasında değiştirildiğinde, hacimce yüzde 60 gaz içeren OMS'nin geometrisi insan kanına benzer bir radyolojik profil sergilemiştir. OMS'nin oksijen içeriği, hacimce yüzde 60'lık OMS içindeki farklı hacimlerdeki oksijenin, bilinen bir oksijen açığına sahip desatüre insan kanı alıkotlarına eklenmesiyle test edilmiştir. OMS içinde eklenen oksijen hacmi ile kanın oksijen içeriğindeki hacimsel artış arasındaki ilişki 1,053 ± 0,03025 olarak belirlenmiştir.

Test edilen OMS'lerin yaklaşık %100 oksijen içerdiği, çok az hapsolmuş gaz cebi sergilediği ve in vitro ortamda tüm oksijen yüklerini insan kanına etkili bir şekilde aktardığı öne sürülmektedir. Bu teknik bir kez ustalıkla öğrenildiğinde, uygun ve verimli bir şekilde uygulandığı takdirde 90 dakika içinde iki litre LMS üretmek için kullanılabilir. Bu prosedür uygulanırken, biriken OMS'lerin görsel denetiminin sürdürülmesinin ve LOM köpüğü konsantrasyonu üzerinde kalite kontrol gerçekleştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu üretim prosedürünün ardından OMS'ler, terapötik gazların büyük ölçekli intravenöz enjeksiyonu ve iletimi için kullanılabilir.