Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Bu prosedürün genel amacı, bakterilerde hücre bölünmesi sırasında FTSZ proteinindeki dinamik değişiklikleri gözlemlemektir. Bu, FTS'nin söz konusu GFP füzyonunu ifade eden basil ince hücrelerinin küçük bir aros pedinin yüzeyine uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Ped daha sonra ters çevrilir ve cam kapaklı bir astar tabanı olan bir Petri kabına aktarılır.

İkinci adım, 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu veya 3D SIM görüntüleme sistemi kullanarak hücre bölünmesi sırasında bakterilerin hızlandırılmış görüntülerini elde etmektir. Daha sonra, ham verilerin kalitesi değerlendirilir ve foto ağartma nedeniyle yoğunluğu %30'dan fazla azalan görüntüler atılır. Son adım, F-T-S-Z-G-F-P proteininin zaman içindeki floresan yoğunluk dağılımını ölçerek hücre bölünmesi sırasında protein lokalizasyonundaki değişiklikleri kantitatif olarak analiz etmektir.

Sonuç olarak, bakterilerde hücre bölünmesi sırasında dion proteinlerinin ne kadar dinamik olduğunu göstermek için hızlı 3D SIM kullanılır. Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, yaşam hücrelerinde hücre bölünmesinde meydana gelen değişiklikler hakkında üç boyutlu bilgi elde etmemizdir. Bu yöntem bakteriyel sitokinez hakkında bilgi sağlasa da, M memeli hücreleri gibi dinamik protein değişikliklerine bakmak istediğimiz diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu fikri ilk olarak, sabit bakteri hücrelerinin geleneksel 3D sim görüntülerini gördüğümüzde, FDZ proteininin zed halkası etrafında homojen bir şekilde dağılmadığını gösterdiğimizde aklımıza geldi. Bu dağılımın Zed halkası daralması sırasında meydana gelen değişikliklerle bağlantılı olup olmadığını daha fazla incelemek istedik. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, yağlarının kırılma indisini numuneleriyle eşleştiremedikleri için mücadele edecek ve bu da düşük kaliteli görüntülere yol açacaktır.

Görüntüleme için en ince basil hücrelerini hazırlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücreleri orta üstel faza kadar büyütün. Ardından, önce ince polyester tabakayı çıkararak standart bir cam mikroskop lamına yapışkan bir çerçeve takın. Ardından, slaytın üstünde etkili bir kare kuyu oluşturmak için çerçevenin açıkta kalan yapışkan yüzeyini mikroskop lamının yüzeyine uygulayın, sonraki adımlarda kapak kaymasının yapışmasını önlemek için kalın polyester tabakayı çerçeveye bağlı bırakın.

Daha sonra, erimiş aros'un 67 mikrolitresini yapışkan çerçeveye kaynayan pipet haline gelene kadar mikrodalgada bir aro çözeltisini eritin. Düz bir yüzey oluşturmak için hemen aroların üzerine bir örtü astarı yerleştirin ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletin. Numune hasat edilirken kapak fişini bir ila iki dakika çıkarın.

8.000 RPM'de santrifüjlemeyi takiben, süpernatantın peleti 200 mikrolitre taze ortamda yeniden süspanse ettiği saniye boyunca numunenin bir mililitrelik bir alikotunu hasat edin. Konsantre numuneden 2,5 mikrolitre alın ve önceden hazırlanmış aros pedine pipetleyin. Numuneyi aros pedinin düz yüzeyi boyunca eşit şekilde yayın.

Ardından, aros pedine dokunmadan cımbız kullanarak yapışkan çerçeveyi mikroskop lamından çıkarın. Aros pedini mikroskoptan aktarın. 35 milimetre çapında, cam kapaklı bir petri kabına kaydırın.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için. Aros pedini, hücre süspansiyonu Petri kabının kapak kayması ile temas edecek şekilde ters çevirin. Deney günü, sistemin ve lazerlerin tamamen stabilize olmasını sağlamak için görüntülemeden en az bir saat önce OMX 3D SIM görüntüleme sistemini açın.

Ardından, ana denetleyici iş istasyonundaki metin protokolünde listelenen farklı bileşenleri açın. Simgeye tıklayarak OMX yazılımını açın. Veri kaydetme için dosya yolunu uygun bir veri klasörüne ayarlayın.

Ardından, soft work yazılımını başlatın. Ana ekranda ışık parametreleri bölümünde deneyler için gerekli olan lazerleri açınız. Kanal seçiminden FITC kamerayı etkinleştirin ve metin protokolünde listelenen parametreleri kontrol etmeye devam edin.

Objektifin üst kısmına bir damla yağ sürün. Hazırlanan hücreleri içeren numune Petri kabını sahne içine yerleştirin ve dairesel ısıtma kapağı ile kapatın. Yağ, numune Petri kabının dibine değene kadar sahneyi indirin.

Yemeğin 15 dakika boyunca ısınmasına izin verin, dengelenin Düşük pozlama ayarı kullanan sahnede, nano konumlandırma aşamasını kullanarak örneğe odaklanın.tage kontrolleri. Işığın numune odak düzleminin üstüne ve altına eşit şekilde yayılıp yayılmadığını belirlemek için numune boyunca yukarı ve aşağı odaklanın. Ardından 0,5 mikronluk adım boyutlarını kullanın ve deney sekmesinde numunenin ortasına dönmeden önce görüntü yığınının üstünü ve altını işaretleyin, numune alma kalınlığını ayarlamak için kalınlık al düğmesine tıklayın.

Geçerli pozlama ve iletilen ışık yüzdesi ayarlarıyla örnek görüntünün maksimum yoğunluk değerini belirleyin. Bu değer, görüntü penceresinin altında bulunur. Hızlandırılmış görüntüleme için, maksimum 1100 ila 1400 yoğunluk elde etmek için pozlamayı ve iletilen ışığın yüzdesini ayarlayın.

Arka planın üstünde. Görüntü için, deney sekmesindeki zaman atlamalı bölümünü etkinleştirin. Gerekli kare hızını ve veri dosyasındaki toplam süreyi ayarlayın.

Uygun bir dosya adı girin. Görüntü alımının başlangıcında görüntü alımını başlatmak için çalıştır düğmesine tıklayın. Zaman serisinin ilk karesi için görüntü alımının başlangıcında görüntünün maksimum yoğunluk değerine dikkat edin.

İlk karenin alınmasının sonunda, bu ilk kare için Zack aracılığıyla sinyal yoğunluğunda %10'dan fazla bir azalma olmadığını kontrol edin. Zaman serisinin alınmasının sonunda, elde edilen ham görüntü dosyasını bir DV sonekiyle açın ve zaman serisinin başlangıcından son görüntüye kadar maksimum sinyal yoğunluğundaki azalmayı tespit edin. İşlem menüsünden %30'dan fazla fotoğraf ağartma olan herhangi bir zaman noktasını atın, SI yeniden yapılandırma penceresini etkinleştirin.

Tüm parametreler için önceden var olan ayarları kullanın. Kullanılan kanala özel OTF düğmesini etkinleştirin ve standart filtre setine ayarlayın. Kullanılan kanala özel KO açıları düğmesini etkinleştirin ve standart filtre setine ayarlayın.

Ham dosyayı giriş dosyası alanına sürükleyip bırakın. Yap'ı tıklayın. 3B yoğunluk grafikleri oluşturmak için FTSZ'nin Z halkası etrafındaki dağılımını inceleyin.

Ardından bir 3D görüntü dosyası açın. Tek tek z dilimlerini görüntülemek için. Görünüm menüsü sekmesinin altında bulunan ses görüntüleyici aracını kullanın.

İlgilenilen bir bölgeyi kırpmak için, bu 3D görüntünün pencere numarasını giriş penceresine girin ve çıkış penceresine yeni ve kullanılmayan bir pencere numarası girin. Bölge seç düğmesi, orijinal 40 x 40 mikron görüş alanından ilgilenilen tek bir Z halkasını kırpmak için kullanılabilir hale gelecektir. Döndürme sekmesinde istenen ekseni ve dönüş derecesini ayarlayın.

Yap düğmesine tıklayın. İstenen perspektifi, Z halkasını elde etmek için ses seviyesinde ilerleyin. Tek bir Z halkası etrafında yeni bir ilgi alanı oluşturmak üzere sütun satırı boyutlarını ayarlamak için veri denetçisi aracını kullanın.

Bu yeni ilgi alanını konumlandırmak için görüntünün merkezini tıklatın. Metin görüntüsü verileri, ilgilenilen bölgedeki her pikselin floresan yoğunluğunu görüntüleyen otomatik olarak oluşturulan bir tablodur. Yoğunluk grafiğini başlangıçta görüntülemek için 3B grafik düğmesine tıklayın.

Alternatif olarak, metin görüntüsü verileri, tablo verilerini kaydet düğmesine tıklanarak dışa aktarılabilir. Dosya menüsünde, kaydedilen metin dosyasındaki görüntü verilerini yeni bir elektronik tabloya kopyalayın. Elektronik tablodaki tüm hücreleri seçin ve yeni bir 3B yüzey grafiği oluşturun.

Zaman atlamalı veriler için 3B yoğunluk grafiğini yayınlanmak üzere biçimlendirin. 3D görüntü dosyasındaki farklı zaman noktalarının her birinde bu adımları tekrarlayın. Konvansiyonel geniş alan floresan mikroskobu ile görüntülendiğinde, Z halkası basil inceliklerinde tek bir enine floresan bandı olarak görünür.

Bu bant boyunca floresan yoğunluğu eşittir. Lokalizasyon modeli, FTS'nin söz konusu polimerlerin burada halka içindeki yapısal organizasyonu ve dağılımı hakkında çok az fikir verir, aynı hücreler incelenir. HIZLI 3D sim yöntemini kullanma.

3D sim görüntüsünün Z ekseni etrafında döndürülmesi, Z halkasının üç boyutlu uzayda gerçek bir halka yapısı olarak görselleştirilmesini sağlar. Çözünürlükteki iyileşme, FTSZ'nin halka içindeki heterojen dağılımının görselleştirilmesine izin verir. Bu teknikle görselleştirilen Bacillus Z halkalarının ek örnekleri, Z halkasının etrafındaki floresan yoğunluğunun asla aynı olmadığını göstermektedir.

Ayrıca, çok düşük floresan yoğunluğu veya boşlukları olan bölgeler gözlenir. Bu gözlemleri ölçmek için, Z halkasının 3D yoğunluk grafikleri oluşturuldu. Yoğunluk grafikleri, floresan miktarının, basilin en ince Z halkasının farklı bölgelerinde dört kata kadar değişebileceğini göstermektedir.

3D yoğunluk grafikleri, boşlukların Z halkası içinde meydana gelen dinamik değişiklikleri analiz etmek için neredeyse arka plan floresansının temel seviyelerini okuduğunu göstermektedir. Zamanla, 3D sim hızlandırılmış çekim yapılır. Bu film, basil ince Z halkası içindeki FTSZ'nin nasıl sürekli değiştiğini ve her görüntü için oluşturulan bir yoğunluk grafiği ile nasıl ölçüldüğünü gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, bakteri hücrelerinin nasıl büyütüleceği ve hazırlanacağı, 3D Sim kullanılarak nasıl görüntüleneceği, nicel veriler elde etmek için nasıl analiz edileceği ve son olarak sunum kalitesinde görüntülerin nasıl sağlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Görüntü elde etme sırasında hücrelerinizin sağlığını izlemek ve ayrıca floresan proteinin edinimi sırasında ekspresyon seviyesini izlemek gerçekten önemlidir. Bu teknik, bakteri hücre biyolojisi alanındaki diğer insanların diğer süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemlerini kullanmasının ve diğer bakteri proteinlerini farklı organizmalarda lokalize etmesinin yolunu açtı.

Bu prosedürü takiben, FDS'nin söz konusu proteinindeki zaman içindeki dinamik değişikliklere bakmak için foto-aktif lokalizasyon mikroskobu gibi diğer süper çözünürlüklü mikroskopi formları gerçekleştirilebilir.