Dorsal Kök Potansiyel Kayıt By Farelerde Spinal Presinaptik Engellenme Ölçme

Presinaptik inhibisyon, omurilikteki en güçlü inhibitör mekanizmalardan biridir. Presinaptik inhibisyondaki patolojik değişiklikler, birçok hastalık mekanizmasında önemlidir. Örneğin; nöropatik ve enflamatuar ağrının yanı sıra anormal santral ağrı işleme süreçlerinde rol oynar.

Omurilik yaralanmalarında ve motor hipereksitabilite ile seyreden merkezi sinir sistemi bozukluklarında bu durum önem taşımaktadır. Bu nedenle, söz konusu bozuklukların hayvan modelleri incelendiğinde, presinaptik inhibisyonun gücünün bilinmesi önemli bilgiler sağlayacaktır. Burada, bir fare modelinde presinaptik inhibisyonun nasıl değerlendirileceğine dair bir yöntemi sunmaktayız.

In vivo presinaptik inhibisyon, duyusal presinaptik lifler üzerindeki GABAerjik akso-aksonal sinapslar tarafından indüklenen primer afferentlerin depolarizasyonu ile gerçekleşir. GABAA reseptör aktivitesi, klorür iletkenliğinde bir artışa yol açar ve bu durum, lokal iyon konsantrasyon dağılımı nedeniyle primer afferent depolarizasyonunu tetikler. Bu depolarizasyon, aksiyon potansiyellerinin akson terminallerine yayılımını engeller ve şiddetlerini azaltarak kalsiyum girişinin azalmasına ve nörotransmitter salınımının düşmesine neden olur.

Böylece, monosinaptik olarak uyarılmış nöronlardaki eksitatör postsinaptik potansiyeller, postsinaptik membran potansiyelini ve nöronların uyarılabilirliğini değiştirmeden inhibe edilebilir. Bu birincil depolarizasyonun hacimsel olarak iletilen potansiyeli, omurilikteki presinaptik inhibisyonun doğrudan bir ölçümünü sağlar ve bu potansiyeller, stimülasyon sonrası omurilik dorsal köklerinden ölçülebilir; bunlara dorsal kök potansiyelleri denir. Dorsal kök potansiyellerinin ölçümü iyi tanımlanmıştır ve kedilerde, sıçanlarda ve kurbağalarda yaygın olarak kullanılmıştır, ancak farelerde kayıtlar neredeyse tamamen ex vivo, izole omurilik preparasyonlarında gerçekleştirilmiştir. Burada, anestezi altındaki farelerde in vivo olarak bu kök potansiyellerinin nasıl kaydedileceğine dair bir yöntemi açıklıyoruz; bu yöntem, sağlam organizmada presinaptik inhibisyonun doğrudan ölçülmesine olanak tanımaktadır.

Farelerde in vivo DRP kaydı için aşağıdaki ekipmanlar gereklidir. Standart şeker enstrümanları, stimülasyon elektrodunun, kayıt elektrodunun ve referans elektrodunun sırasıyla konumlandırılması için üç manuel stereo mikroskop. Ayrıca, stimülasyon ve kayıt için fare gövde ısısını kontrol etmeye yarayan bir fare çerçevesi ve ısıtma düzeneği veya stimülatör.

Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için standart bir amplifikatör ve veri toplama sistemi gereklidir. DRP kaydı sırasında, özel yapım kesit elektrotlarının hazırlanması gerekir. Standart bir pipet çekici ile geleneksel cam tüpler çekilmelidir.

Uç açıklığını genişletmek için elektrodun ucunu elmas törpü ile kırın. Ucu pürüzsüzleştirmek için standart bir laboratuvar pürmüzü ile cilalayın. Hazırlığa başlamadan önce, hayvanı IP enjeksiyonu ile anestezi altına alın ve farenin kafasını stereotaktik çerçeveye sabitleyin.

Ardından, farenin arka patisini sıkarak anestezinin derinliğini test edin. Hazırlığa ancak patide herhangi bir çekilme görülmediğinde başlayın; anestezi derinliği prosedür boyunca tekrarlanan aralıklarla kontrol edilmelidir. Arka kuadriseps kasına tekrarlayan ketamine sine enjeksiyonları yapın.

Anesteziyi uzatın ve hayvanın vücut ısısını rektal prob ile izleyin. Dorsal kolon hazırlığı için cildi dorsal orta hat boyunca açın.

Omurgayı çevreleyen bağ dokusundan ayırmak için deriyi alttaki dokudan serbest bırakın. Omurganın her iki yanından iki kesi yapın ve dokuyu skalpel ile yanlara iterek kesileri genişletin. Ardından, küçük bir kemik pensi kullanarak S spinöz çıkıntıları çıkarın.

Lomber seviyelerden başlayın. Operasyon yarasının kurumasını önlemek için orta torakal seviyelere doğru ilerleyin. Yaranın etrafına küçük gazlı bez parçaları yerleştirin ve bunları %0.9 sodyum klorür ile nemlendirin.

Ardından, lomber bölgeden başlayarak omuriliği hazırlamaya başlayın. Kemik meme ucunun ucunu, yan yana iki omur arasındaki boşluğa dikkatlice itin. Omuriliğe uygulanan basıncı mümkün olduğunca azaltmaya özel özen gösterin.

Omuriliğin torasik seviyelerini yapay beyin omurilik sıvısı ile nemlendirin. Sonraki tüm adımlar boyunca bunu tekrarlayıcı olarak yapın. Durometri cihazını 30 gauge bir iğne kullanarak dikkatlice açın.

Ardından, birbirine komşu iki ipsilateral kökü omurgadan gevşetin ve ayırın. Daha sonra kökleri mümkün olduğunca distalden kesin. Prosedür sırasında.

Köklerin aşırı çekilmesini önleyin; çünkü bu durum nihayetinde başarılı bir DRP kaydını engelleyecektir. Referans elektrodu spinal kordun yakınına yerleştirdikten sonra, bir seksiyonelektrot ucunu bir dorsal kökün proksimal ucuna yakın bir konuma getirin. Ardından, dorsal kökü vakum elektrodunun uç açıklığının üzerine yerleştirin.

Ardından, elektroda bağlı bir şırınga aracılığıyla kısa süreli negatif basınç uygulayarak dorsal kökü elektrodun içine çekin. Daha sonra, çözelti elektrot içindeki hem dorsal kökü hem de gümüş klorür telini çevreleyene kadar düşük ve sürekli negatif basınç uygulayarak elektrodu A CSF ile doldurun. Sonrasında, herhangi bir sıvı köprüsünün elektrotu kısa devre yaptırmaması için elektrodun ucunu omurilikten yukarı kaldırın.

Aynı taraftaki ikinci komşu kök için adımları tekrarlayın. Her iki elektrot da yerleştirildiğinde, bir kökü uyarırken diğerinden kayıt alarak DRP kaydını başlatın ve stimülasyon voltajını supramaksimal seviyelere yükseltin. Dorsal kök potansiyellerinin tipik kayıtları, sol panelde gösterilen kayda benzer.

Kısa bir stimülasyon artefaktını, kısa bir pozitif sapma ve ardından uzamış bir negatif sapma takip eder. Son sapma, asıl dorsal kök potansiyelidir. Bunun genliği, stimülasyon kaydının hemen öncesinde kaydedilen baz hattına göre hesaplanabilir.

Solunum hareketlerinden veya EKG artefaktlarından kaynaklanan bir kök çiftinden gelen birkaç iz, kaydedilen DRP'yi etkileyebilir. Başarılı bir kayıttan sonra, stimülasyon ve kayıt bölgelerini değiştirmek ve ikinci bir kayıt gerçekleştirmek mümkündür. Sunulan kayıt yöntemi.

In vivo kök potansiyelleri, özellikle genetik olarak modifiye edilmiş farelerle kombine edildiğinde, primer girdi, anti-polarizasyon ve sağlam hayvanın değerlendirilmesine olanak tanır. Spinal inhibisyonun altında yatan mekanizmaları araştırmak için güçlü bir araç olabilir. Spinal entegrasyon, motor fonksiyon ve multimodal duyusal algı için kritiktir.

Bu yöntem; ağrı, omurilik yaralanması, periferik sinir yaralanması ve inflamasyonla ilgili araştırmalarda kullanışlıdır. DRP'nin in vivo kaydedilmesi, supraspinal aktivite ve pad etkileşimlerinin analiz edilmesine olanak tanır. Bu durum, farelerde DRP'yi ölçmek için genellikle kullanılan izole omurilik preparasyonlarında mümkün değildir.

Prensip olarak, kayıt sırasında spinal korda ilaç uygulaması mümkündür. Ek pipetler aracılığıyla yapılan lokal uygulama, lokal ilaç konsantrasyonunun kontrolünü artırabilir ve hızlandırabilir.