Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, endozomları zaman içinde üç boyutlu uzayda veya dört boyutta doğru bir şekilde görüntülemektir. Bu, önce yılan kaslarının diseksiyonu ve dokunun görüntüleme kabında düzenlenmesi ile gerçekleştirilir. İkinci adım, endozom oluşumunu uyarmak için dokuyu hayati boyalarla boyamaktır.

Daha sonra, preparat bir veya daha fazla nöromüsküler kavşak için dört boyutta görüntülenir. Son adım, makro endozomların davranışını karakterize etmek için dikkatli veri analizidir. Sonuç olarak, presinaptik boşluk içinde zaman içinde endozomların varlığı ve hareketi, dört boyutlu floresan görüntüleme ile gösterilebilir.

Bu tekniğin temel avantajı, yılan karın kasının sadece tek bir lif kalınlığında olmasıdır, bu da standart epi floresan mikroskobu kullanılarak yüksek kaliteli görüntülerin oluşturulmasına olanak tanır Bu protokolde jartiyer yılanından elde edilen doku preparatları kullanılacaktır. Sürüngen dokusu düşük sıcaklıklarda tutulmalıdır, böylece daha uzun süre ve daha az bakteri kontaminasyonu ile fizyolojik kalır. Lizozomal hayati boya boyaması için, boya soğuk sürüngen halkalar çözeltisi içinde bir ila 5.000 arasında çözülür.

0.2 mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için, boyayı dokuya ekleyin ve 15 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. 15 dakika sonra, tüm FM 1 43 boyaması için dokuyu birkaç kez soğuk halkalarla yıkayın. Boyamadan önce numuneyi manyetik pimli bir görüntüleme kabına önceden monte edin.

Bu videonun amacı doğrultusunda, potasyum klorür stimülasyonu kullanılarak sadece FM 1 43 boyaması gösterilecektir. Yedi mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için yüksek potasyum klorür halkalarında bir ila 500 oranında seyreltilen boya, dokuya eklenir ve daha sonra doku, maksimum 30 ila 60 saniye boyunca dört santigrat derecede inkübe edilir. Daha sonra, durulama başına yaklaşık bir dakika boyunca soğuk zil sesleriyle üç kez hızlı bir şekilde yıkanır.

Tüm dokular lekelendikten sonra mümkün olan en kısa sürede görüntülenmeli ve soğuk ringer solüsyonu ile yıkanmalıdır. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılıyorsa, alt kısmında ince yuvarlak bir kapak kayması bulunan bir görüntüleme odası kullanın. Tipik olarak, görüntüleme odası 25 milimetre çapında ince bir paslanmaz çelik tabana sahip olmalıdır.

Görüntüleme hazırlığını yapılandırmak için merkezde bir numaralı kalınlıkta cam kapak kayması. Manyetik pimler kullanarak yönlendirin, böylece kas görüntüleme kabı içinde mümkün olan en iyi şekilde ortalanır ve mümkün olduğunca düz bir şekilde uzanır. Preparasyonu küçük bir hacimde zil çözeltisi ile örtün.

Çanağı, sahnenin ortasına mümkün olduğunca yakın yerleştirerek monte edin. Mümkün olan en yüksek 3D çözünürlüğü elde etmek için uygun bir hedef seçin. Bu gösterideki tüm deneyler için 63 x su hedefi kullanılacaktır.

Bu yordama başlamak için, slayt kitabı 5.0'daki görüntüleme penceresini açın. Burada sekmelerde birkaç menü bulunur. İkinci sekme Z'yi kullanarak 63 x su hedefini seçin.Z yığın aralığını ayarlayın.

Bu örnekte, canlı görüntüleme için 1,5 mikronluk bir Z adımı kullanılmıştır. Hızlandırılmış kare hızını seçin. Optimal bir oran, hareket etkileşimleri veya füzyon olayları gibi zamanla değişiklikleri sorunsuz bir şekilde çözmek için yeterli olan orandır.

Örneğin, toplam beş dakikalık bir zaman aralığı için 32. aralıklarla 10 zaman noktası. Ardından, ilgilenilen odağın en üstüne manuel olarak odaklanmış terminali canlı görüntülerken toplam alan derinliğini seçin ve ardından biraz üzerine çıkın. Set üstünü seçin.

Her şey odak dışına çıkana kadar örneğe yavaşça odaklanın. Yine, görüntülenen uçak sayısı ve toplam hareket değerleri, yakalama penceresinde seçilen alan derinliğini gösterecektir. Az önce seçilen parametreleri aktarmak için kullanılan üst ve alt konumlar radyo düğmesini seçin Görüntü yakalama için, görüntü alımını başlatın.

Belirli bir hazırlık için tüm canlı görüntülemeyi tamamlayın. Tüm ham veri dosyalarını saklayın, dijital depolama ise genellikle bir sorun değildir. İşlem süresi, hızlı kişisel bilgisayarlarda veya iş istasyonlarında bile önemlidir.

Bu nedenle, görüntüleri ilgilenilen bir bölgeye kırpmak, tüm süre boyunca ilgilenilen bölgenin tamamının kırpılan pencerede kalmasını sağlar. Kurs D, uygun yazılımı ve doğru nokta yayılma fonksiyonunu kullanarak görüntü yığınlarını içerebilir, çözünürlüğün iyileştirildiğini ve evrişim algoritması tarafından herhangi bir artefakt oluşturulmadığını doğrulayabilir. Z eksenini genişletmek için bir enterpolasyon algoritması kullanın.

Görünür çözünürlük, gerçek 1,5 mikronluk bir görüntü düzlemi ayrımından görünür 0,25 mikronluk bir ayırmaya altı katlık bir genişleme önerilir. Kontrast parlaklığı, gürültü filtreleme, fotoğraf ağartma ve diğer tipik görüntü işleme ayarlamalarını gerçekleştirin. İstenirse.

Görüntü işleme standartları, çoğu bilimsel çalışma için, aynı düzeltmelerin hem bir yığın içinde hem de farklı zaman noktalarında tüm görüntülere uygulanmasının uygun olduğunu belirtir. Belirli bir ayarlamanın sonucu, tüm görüntüler arasında değerlendirilmelidir. Çeşitli filtreleme ve görüntü geliştirme teknikleriyle denemeler yapın.

Örneğin, lelos ve filtreleme, arka plan üzerindeki küçük yapıların kontrastını artırmak için kullanışlıdır. Çalışan bir pencerenin ortasındaki piksellerin parlaklığı artırılırken, çevredeki alanların parlaklığı azaltılır. Bazı filtreleme yöntemlerinin birlikte iyi çalışmadığını unutmayın.

Preparatın zaman içinde önemli bir hareketi varsa sapma düzeltmesi uygulayın. Bu tür bir hareket, aksiyon potansiyellerini ve sinaptik potansiyelleri baskılamak için eklenen ilaçlarla bile canlı kaslarda yaygındır. Bir piksel kayıt algoritması, zaman atlamalı görüntüleri hizalar ve azaltabilir, ancak genellikle bu tür hareketleri tamamen ortadan kaldırmaz.

Bu çalışmada, makro endozomların veya ben'in plazma zarına doğru hareket edip etmediğini ve hızla kaybolup kaybolmadığını belirlemek için yılan nöromüsküler terminallerinin dört boyutlu canlı görüntülemesi kullanıldı, bu da bazılarının sitoya erişmesi nedeniyle sayılarının azaldığını düşündürdü. Veriler, 60 saniyelik bir kare aralığıyla altı zaman noktasında 3D hacim görünümleri olarak görüntülenir. Tek bir düğmenin Z derinliğini göstermek için, bir me'nin beş ve altı zaman noktaları arasında kaybolmadan önce birkaç kare boyunca kırmızı kesikli çizgiyle gösterilen Y ekseninden uzaklaştığı gözlemlenebilir, kaybolma için gereken sürenin, kaybolmadan hemen önceki ekzositoz ile tutarlı olan çerçeve aralığından daha az olduğu.

ME, baton plazma zarında yer alıyor gibi görünmektedir. Aynı ham veri kümesi, daha sonra daha düşük büyütme oranına sahip bir film olarak gösterilir. Dizi, kırmızı okla gösterilen yakında kaybolacak olan ben'e dikkat çekmek için Y ekseni etrafındaki her 24 3B dönüş adımının başında kısa bir süre duraklatılır.

ME görünür durumdayken, düğmenin kenarı yaklaşırken kayboluyor ve tüm görüntüleme perspektiflerinde geri dönmez. XY çözünürlüğüne kıyasla daha düşük Z ekseni çözünürlüğü nedeniyle, ME'nin şekli, görüntüleme perspektifine bağlı olarak uzuyor ve kısalıyor gibi görünüyor. Elektron mikroskobu çalışmaları, motor terminallerindeki endozomların ışığın kırınım sınırına yakın boyut olarak küçük olduğunu göstermiştir.

Bu nedenle, bu endozomların füzyonu, ışık seviyesindeki yakın uzamsal ilişkiden kesinlikle ayırt edilemez. Bu çalışmada, Mees yeşil ile gösterilen FM 1 43 ile etiketlendi ve asidik endozomlar veya AE'ler bir lizozomal ile etiketlendi. Dört boyutlu bir filmin bir zaman noktasından alınan kırmızı verilerle gösterilen hayati boya, üç yönde 3D hacim görünümleri olarak görüntülenir.

Birden üçe kadar olan üst paneller, XY düzleminin üstünden geleneksel görünümü gösterir. Dört ila altı arasındaki orta paneller, XY düzlemine dik ve büyük kırmızı ok yönünde bir görünüm gösterir. Yediden dokuza kadar olan alt paneller, büyük mavi ok yönünde yukarıdaki her iki görünüme karşılıklı olarak dik bir görünüm gösterir.

Bir ben yeşil bir okla ve iki AE kırmızı oklarla işaretlenir. Her iki renkte de sarı görünen floresan yapılar zaman zaman dört D görüntü kaydında not edildi. Bu örnekte, her iki boyayı da içeren bir endozom, üç, altı ve dokuzuncu panellerde sarı bir okla işaretlenmiştir.

Kırmızı ve yeşilin örtüşmesi, her üç ortogonal projeksiyonda da eşit derecede eksiksizdir ve varsayılan bir kaynaşmış em me ae'yi gösterir. Bu filmde, Y ekseninde saniyede bir kare hızında dönecek şekilde yapılandırılmış aynı veri kümesi gösterilmektedir. Varsayılan kaynaşmış MEAE, her açıdan sarı kalır.

Dijital evrişim çözme, 3D'nin yanı sıra dört D görüntünün çözünürlüğünü artırmak için kullanışlı bir araçtır. Ham veriler ile devredilen veriler arasındaki karşılaştırma burada gösterilmiştir. FM 1 ile stimülasyon sırasında boyanan tipik bir yılan sinir terminali için 43 Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 30 ila 60 dakika içinde yapılabilir.

Bu işlemi takiben, makro endozomların presinaptik belirteçlerle kolokalizasyonu gibi ek sorulara cevap vermek için immünohistokimya gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.