Name: Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Öğrenin larval zebra balığında omurilik kesisi yöntemini, yüksek verimli ve tekrarlanabilir prosedürle. Bu teknik, sinir kök hücre yanıtını incelemek için immünofloresan mikroskobu kullanarak omurilik rejenerasyonunu araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz hayvancılık için Utah Üniversitesi Zebrafish tesisine borçluyuz. RID NIH R56NS053897 tarafından desteklenen ve LKB HHMI Med-içine-Grad girişimi tarafından desteklenen bir predoctoral stajyer oldu.

Zebrafish standart prosedürlere göre yükseltilmiş ve yetiştirilen; deneyler Utah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Cerrahi Plakların 1. Hazırlanması <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre, 60 mm Petri kapları ve Sylgard 184 Silikon Elastomer Kit kullanılarak cerrahi plakaları olun. Yarı dolu daha fazla yemekleri doldurun ve polimerize izin. Mağaza, oda sıcaklığında kapalı. </li></ol> Mikropipetler 2.. Hazırlanması <ol><li> Isıtma ve mikroenjeksiyon iğneler yapmak için aynı ayarları kullanarak bir mikropipet çektirmenin ince duvar borosilikat kılcal boru çekerek mikropipetler Üretiyor. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, forseps ile çapı yaklaşık 200 um mikropipet ucu kopar. </li><li> Konik kırık 25 ° &#39;de ikinci bir beveling ardından 35 ° başlangıçta microgrinder ile kenar. Ucu keskin ve smo olduğundan emin olunoth. Mağaza kil küçük bir miktar üzerinde bir Petri kabındaki eğimli mikropipet tamamladı. </li></ol> Zebra balığı Larva 3. Hazırlanması <ol><li> Ameliyat öncesinde 7 gün, erkek ve kadın zebrabalıkları çiftleşme tankları kurmak. </li><li> Işıklar maksimum verim sağlamak için gel 3 saat sonra, ertesi sabah embriyolar toplayın. Knu3, 28.5 ° C&#39;de çeşit döllenmiş embriyo 100/100 mm levha E3 25 ml: Böyle Tg (eGFP elevl3) gibi bir transgenik muhabir hattı kullanıyorsanız Yabani-tip kullanıldığında, sıralama 28.5 ° C&#39;de E3 25 ml embriyolar 25/100 mm plaka döllenmiş </li><li> Bir muhabir hattı kullanıyorsanız, 48 hpf floresan ifade embriyolar ekran. Embriyolar 28.5 ° tespit C&#39;de E3 25 ml 25/100 mm levha yoğunluğunda olgun izin verin </li><li> Larva 5 dpf olduğunda, E2 + 10 mg / L Gentamisin Sülfat (GS) + Tricaine ile Sylgard kaplayarak cerrahi plaka hazırlanması. <ol><li> 100 mm Petri dis 25 ml E2 + GS ekleyerek kurtarma tabak hazırlayınh. </li><li> Birlikte üç bezlerden bantlama tarafından neşter hazırlayın. Bu, üç oluklar ile üçgen bir araç oluşturacak. </li><li> Oluklardan birine içine bantla tarafından bezlerden hazırlanmış bir mikropipet monte edin. </li></ol></li><li> E2 + GS ile net bir 1ml şırınga ve önceki bezlerden montaj için bir 27 G iğne kullanılarak kadar sifon mikropipetler, yeniden eğer. </li></ol> 4. Cerrahi <ol><li> Tricaine ile bir süre (25 balık) de larva 1 tabak anestezisi. Artık dokunmatik tepki gösterirler zaman Fish yeterince uyuşturulur. Bu neşter onları dokunduğu zaman aksi takdirde seğirme, balık tamamen ameliyat öncesi anestezi olması önemlidir. Cerrahi bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir. </li><li> Cerrahi plakasına larva aktarın. <ol><li> O neşter tutan elin sırtını en yakın olan yan yatıyor böylece maksimum büyütme altında, bir seferde bir larva döndürün. </li><li> Onlar Sylgard dayanacak şekilde pozisyon, forsepslarva eni boyunca açılı. </li><li> Forseps kollarına birine karşı cam neşter Brace emin Notokordun ventral kenarının ötesine kesmek için olan, anal gözenek düzeyinde larva dorsal yan yüzüne halinde kesilir. Omurilik sever neşter bükün. </li><li> Kalan larvaları ile tekrarlayın. Not: Bir larva kanarsa, bu ameliyatın olmaz. Hemen ameliyat plakadan larva kaldırmak ve Tricaine doz aşımı yoluyla euthanize. </li></ol></li><li> Larvaların toplu üzerinde ameliyat tamamlandıktan sonra, transfer kurtarma plakasına hayvanları yaralandı. Bu anestezi takas desteklemektir. <ol><li> Dikkat: transferi için yaralı larvaları toplarken, onlar ilk baş veya kuyruk toplanır emin olun: larvaları bükerek yaralanma siteyi stres yok. Not: cerrahi için kullanılan tüm cihazlar mikropipetler dahil, yeniden kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 5. Kurtarma <ol><li> Transfer kurtarma plakasından 25/plate bir yoğunlukta 25 ml E2 + GS ile doldurulmuş 100 mm levhalarına larva yaralandı. 28,5 ° C inkübatör kurtarmak için izin verin. </li><li> Hasta ve ölü hayvanlar kaldırarak, günlük plakaları kontrol edin. Coleps (tatlı su protozoa) medyada görünür olana kadar ortamı değiştirmek etmeyin. Ortamı değiştirirken, yeni bir plaka balık transferi yok; Bunun yerine, mümkün olduğunca medyayı çıkartın ve yeni medya ile aynı plaka sel. Coleps nüfusu azaltmak için gerektiği kadar tekrarlayın. </li><li> Toz yavru yiyecek küçük bir miktar ile günlük besleyin. Not: Canlı yem (örneğin, Paramecia ya rotifer) da lokomosyonu kurtarıldı sonra kadar yaralı larvalarına karşı beslenen olamaz. Aksi takdirde, canlı gıda yaralanma siteyi kolonize ve larvaları öldürür. </li></ol>

<ol><li>Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+bridging+the+lesion+and+the+role+of+neurotrophic+factors+in+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair.</a> Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+dendritic+cells+in+injured+adult+spinal+cord+results+in+activation+of+endogenous+neural+stem%2Fprogenitor+cells+leading+to+de+novo+neurogenesis+and+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery.</a> Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).</li>
<li>Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+intrinsic+properties+and+emerging+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).</li>
<li>Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+tyrosine+hydroxylase+and+serotonergic+systems+in+the+regenerating+spinal+cord+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).</li>
<li>Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1.1+is+involved+in+spinal+cord+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).</li>
<li>Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+after+crush+injury+in+adult+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).</li>
<li>Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-dependent+glial+cell+bridges+facilitate+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).</li>
<li>Reimer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor neuron regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).</li>
<li>Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+study+of+spinal+interneurons+in+living+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fin-tail+coordination+during+escape+and+predatory+behavior+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish.</a> PloS one. 7 (2), (2012).</li>
<li>Kim, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressor+activity+of+Headless%2FTcf3+is+essential+for+vertebrate+head+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation.</a> Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Başlangıçta bu tekniği öğrenirken, biz tek bir seansta en fazla 50-100 den kesilirken teşebbüs öneririz. Bu tekniği mastering sonra, saat başına 300 embriyo kadar transect edebiliyoruz; Ancak, üretilen bu düzeyde haftalık uygulama birkaç ay gerektirir. Ayrıca, bir raportör çizgi ile uygulama ve eksik omurilik kesisi sıklığı% 1&#39;den daha az azalır kadar tamamen kesilmesini doğrulanması önerilir. Yetişkin zebrafish omurilik hasarı sonrası transseksiyon akson büyümesini ve nöron okuyan için ...

Insan omurilik büyük travma nedeniyle sık sık aksonlar regrow veya nörogenezi 1,2 yeniden başlatmak için yetersizlik, kalıcı felç ve yaralanma seviyesinin altında duyu kaybı ile sonuçlanır. Memelilerde aksine, ancak, semenderler ve Zebra balığı (Br.rerio) dahil anamniotes bile tam omurilik kesisi 3,4 sonra sağlam iyileşme göstermektedir. Yetişkin zebrabalıkları omurilik yaralanması 5-7 aşağıdaki kurtarma işlemini incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Tam omurilik kesisi sonrası, duyusal ve lokomotif işlevi yeniden kurulması 6 hafta sonrası yaralanma 8 ile yetişkin zebrabalıkları görülmektedir. In vivo olarak rejeneratif proses incelemek amacıyla, şeffaf larva zebrabalıkları 9 döndü. Burada bir 5 gün sonrası fertilizasyon (DPF) larva Zebra balığı USI ve omurilik transect için bir yöntem mevcutBhatt değiştirilmiş bir neşter gibi bir eğimli mikroenjeksiyon pipet, ng vd. 10. Bu yöntem, yüksek verim, düşük mortalite ve tekrarlanabilirlik destekler. Uygulama ile, 300 larva / saat nakledilmiş olabilir, ve 98.75% 0.72% ± 3.600 üzerinde hayvanlar dahil kesilerde 6 aydan fazla, 7 gün sonrası yaralanma (dpi) kadar yaşadı. Bizim veri de duyusal ve hareket hızlı iyileşme gösterir: 1 dpi, yaralı balıklar tarafından tüm hareketleri sadece göğüs yüzgeci lokomosyon tarafından tahrik edilmektedir. Ancak, larva 2 dpi tarafından transection iğne dokunmatik caudal tungsten yanıt başlar, 3 dpi tarafından C-bend hareketini yeniden ve 5 dpi 11 ile yırtıcı yüzme gösterilecek. Asetilenmiş tübülinin karşı antikor boyama kullanarak, aksonlar 1 dpi yaralanma sitesinden bulunmadığına olduğunu doğruladı, ancak 5 dpi tarafından yaralanma siteyi geçti. Biz bu protokol aşağıdaki yaralanma omurilik aksonal yeniden büyüme ve nöron çalışma için değerli bir teknik sağlayacağına inanıyorum. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>60 mm Petri kabı</td><td>VWR</td><td>82050-544</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kabı</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>PDMS, Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>borosilikat kılcal boru: OD 1,00 mm, İç çap 0,78 mm</td><td>Warner Instruments Inc.</td><td>64-0778</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>İnce Bilimsel Araçlar A.Ş.</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ6454</td><td></td></tr><tr><td>Mikroöğütücü</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>Amresco Inc.</td><td>0304-5G</td><td>10 mg / ml suda çözünür, -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Acros Organics</td><td>118000100</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk uçlu aplikatör, ahşap, 6 inç</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>27 G iğne</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Fry food</td><td>Argent Labs</td><td>F-ARGE-PTL-CN</td><td>-20 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>Kutu Filamenti FB330B</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>20x E2 (1 L); </güçlü> RT</td></tr><tr><td>17,5 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>0,75 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>2,90 g CaCl2&middot; 2H < alt > 2 < / alt >O</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>4.90 g MgSO<alt > 4< / alt > ve orta nokta; 7H2O</td><td>Merck</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>0,41 g KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>0,12 g Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">500x NaCO3 (10 ml); </güçlü> taze yapın, fazladan</td></tr><tr><td>0,35 g NaCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>1x E2 (1 L); atın (1 L); </güçlü> RT</td></tr><tr><td>50 ml 20x E2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml taze 500x NaCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

larva zebra balığı omurilik kesisi

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Memeliler nedeniyle yaralanma seviyesinin altında aksonal yeniden büyüme eksikliği yanı sıra spinal nöron yeniden başlatmak için bir yetersizlik omurilik yaralanması aşağıdaki duyusal ve motor kurtarma başarısız. Ancak, hatta omurilik tam kesilerinden sonra duyusal ve fonksiyonel iyileşme hem Zebrafish Br.rerio sergi olmak üzere bazı anamniotes. Yetişkin zebrabalıkları 6 hafta sonrası yaralanma ile duyusal ve motor iyileşme ile, omurilik yaralanmasının ardından rejenerasyon eğitim için kurulmuş bir model organizmadır. Saydam larva zebrabalıkları mevcut rejeneratif işleminin in vivo analiz avantajı hem de yetişkin genetik araçlar erişilemiyor almak için, omurilik transeksiyonu sonra rejenerasyon çalışma larva zebrafish kullanın. Burada yeniden üretilebilir ve verifiably larva omurilik bölücü için bir yöntem ortaya koymaktadır. Transeksiyon sonra, veri 2 gün sonrası yaralanma (dpi) duyusal kurtarma başlangıcını gösterir, zekâh 3 dpi ve 5 dpi tarafından ücretsiz yüzme sürdürme saptanabilen C-bend hareketi. Böylece omurilik yaralanması sonrası kurtarma çalışmaları için yetişkin Zebra balığı bir arkadaşı aracı olarak larva Zebra balığı öneriyoruz.

Hasarı bölgesini çevreleyen doku hasarının ciddiyetini azaltmak için, mikropipet doğru eğim verme kritiktir. Şekil 1A, bir doğru eğimli uç gösterir. Çok dar olan bir uç (Şekil 1C) yerine doku kesici daha derisini bakışta eğiliminde iken çok geniş olan bir ucu (Şekil 1 B) kullanarak, bağlı olarak dorsal aort nicklemek artan olasılığı daha yüksek ölüm neden olma eğilimindedir. , 1 dpi zebrabalıkları.: Şekil 2A, canlı ...

Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Bu prosedürün genel amacı, hayatta kalma oranını maksimize ederken, nispeten yüksek kapasiteli ve tekrarlanabilir bir yöntem aracılığıyla larva zebra balıklarında tam omurilik transeksiyonunu sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle uygun genotipe sahip yetişkinlerin çiftleştirilmesi ve gerektiğinde tarama yapılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise embriyoların döllenmeden sonraki beşinci güne kadar büyütülmesidir.Ardından, eğimli bir mikroenjeksiyon pipeti ile transversiyon işlemini gerçekleştirin. Son olarak, yaralanan balıkların deney sonuna kadar antibiyotikli besiyerinde iyileşmelerine izin verilir. Nihayetinde, sinirsel progenitörlerin yaralanmaya verdiği yanıtı göstermek için immunofloresan mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin, Becker ve fetcher laboratuvarları tarafından öncülük edilen yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları arasında, incelenebilecek daha fazla hayvan sayısı, daha kısa bir iyileşme süresi ve yetişkin zebrafish'lerde aksi takdirde mevcut olmayan genetik araçların kullanımı yer almaktadır. Bu yöntem, rejenerasyon alanındaki yaralanmaya karşı nöral progenitör yanıtı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hazırlıklara, 60 millimeter Petri kapları ve to cell guard 180 4 silikon elastomer kiti kullanarak cerrahi plakalar hazırlayarak başlayın.Üreticinin talimatlarını takip edin. Kapları yarıdan fazla olmayacak şekilde doldurun ve polimerleşmelerini bekleyin. Ardından kapları ağzı kapalı olarak oda sıcaklığında saklayın.Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında mikroenjeksiyon iğneleri hazırlamak için kullanılan ayarların aynısını kullanarak, ince duvarlı borosilikat kapiler tüpleri bir mikro pipet çekicide ısıtıp çekerek mikro pipetler üretin. Mikro pipetin ucunu yaklaşık 200 mikron çapta kalacak şekilde kırmak için pens kullanın. Daha sonra, kırılan kenarı bir mikro taşlama cihazıyla önce 35 dereceye, taşlama sesi kesildiğinde ise ikinci bir aşama olarak 25 dereceye eğimli hale getirin.Ucun keskin ve pürüzsüz olduğundan emin olmak için bir disseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Çok geniş bir uç kullanmak, dorsal aortanın zedelenme olasılığının artması nedeniyle daha yüksek ölüm oranlarına yol açma eğilimindedir. Çok dar bir uç ise dokuyu kesmek yerine deriden kayma eğilimindeyken, doğru açıyla eğimlendirilmiş mikro pipetleri cerrahiden yedi gün önce küçük bir miktar kil üzerinde bir Petri kabında saklayın.Erkek ve dişi spr. balıklar için çiftleştirme tanklarını hazırlayın. Maksimum verim sağlamak amacıyla, ışıklar açıldıktan üç saat sonra, ertesi sabah döllenmiş embriyoları toplayın.Karma genotiplere sahip transgenik bir reporter hattı kullanılıyorsa, plaka başına 100 embriyo yerleştirin ve plakaları 28.5 °C'de inkübe edin. Bir reporter hattı kullanılıyorsa, döllenmeden sonra 48. saatte embriyoları floresan ekspresyon açısından tarayın.Floresan embriyoların, larval dönemde veya fertilizasyondan beş gün sonra 28.5 °C'de olgunlaşmasını sağlayın. Hücre koruyucuyu E2 ve 10 mg/L gentamisin sülfat ile trica ile kaplayarak cerrahi plakayı hazırlayın. Ek olarak, 100 mm'lik bir Petri kabına 25 mL E2 ve gentamisin sülfat ekleyerek bir iyileşme kabı hazırlayın.Bir sonraki adım, üç adet pamuklu çubuğu birbirine bantlayarak bir skalpel sapı hazırlamaktır. Bu işlem, üç kanallı üçgen bir araç oluşturur. Ardından, hazırlanan mikro pipeti kanallardan birine bantlayarak skalpeli tamamlayın ve mikro pipeti ihtiyaç duyulana kadar kenara koyun.Her seferinde 25 larva içeren bir plakayı anestezi yaparak cerrahi işleme başlayın. Trica ile balıklar, dokunma tepkisi vermedikleri zaman yeterince anestezi olmuş sayılırlar. Larvaları bir cerrahi plakaya aktarın ve plakayı bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.Maksimum büyütme altında, bir larvayı, sırtı bistüriyi tutan ele en yakın olacak şekilde yan yatana kadar döndürün. Penseti, hücre koruyucusunun üzerine yaslanacak şekilde konumlandırın. Larvanın genişliğine açılı bir şekilde, cam bistürüyü pensetin kollarından birine yaslayın.Larvaların anal por seviyesinden dorsal lateral yüzeyine kesi yapın. Notokordun ventral kenarının ötesine geçmediğinizden emin olun. Ardından, omuriliği koparmak için skalpeli döndürün.Gerekli döndürme işlemi genellikle 90 dereceden çok daha azdır. Kalan larvalarla omurilik kesisi işlemini tekrarlayın. Larva grubundaki cerrahi işlem tamamlandığında, yaralanan hayvanları iyileşme plakasına aktarmak için bir posterior pipet ve pipet pompası kullanın.Anesteziyi gidermek için, taşıma sırasında önce larva başını veya kuyruğunu tuttuğunuzdan emin olun. Anestezi etkisi geçtikten sonra larvaları bükerek yaralanma bölgesini zorlamayın. Yaralı larvaları, geri kazanım plağından, 25 mL E2 ve gentamisin sülfat içeren 100 milimetrelik plakalara, plaka başına 25 larva olacak şekilde aktarın.Ardından, yara iyileşirken bunları 28.5 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Plakaları günlük olarak kontrol edin. Hasta veya ölü hayvanları uzaklaştırın.Tatlı su protozoa kümeleri medyada görünene kadar medyayı değiştirmeyin. Medyayı değiştirirken balıkları yeni bir plakaya aktarmayın. Bunun yerine, mümkün olduğunca fazla medyayı uzaklaştırın ve aynı plakayı yeni medyayla doldurun.Kops popülasyonunu azaltmak için gerektiği kadar ortam değişimi işlemini tekrarlayın. Larvaları her gün az miktarda toz yavru yemiyle besleyin. Burada, spinal kordu tamamen kesilmiş bir zebra balığı birinci günde gösterilmektedir.Yaralanma sonrası, GFP tüm nöronlarda eksprese edilmiştir ve sarı ok yaralanma bölgesini belirtmektedir. Tam olarakle kesilmiş bir omuriliğe sahip zebra balığı, burada yaralanmadan üç gün sonra gösterilmiştir. Fikse edilmiş UCD işaretli bu zebra balığı, tamamen kesilmiş bir omurilik sergilemektedir.Sarı ok tekrar yaralanma bölgesini belirtmektedir. Buna karşılık, omuriliğin ventral kenarı boyunca devam eden nöron boyaması, yaralanmadan sonraki üçüncü gündeki sabitlenmiş zebra balığında eksik bir transversiyonu (kesiyi) göstermektedir.Bu teknik uzmanlaşıldığında, saatte 300 larva işlenebilir.

spinal-cord-transection-in-the-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Lamprey tam omurilik hasarı sonrası lokomosyonu kurtarmak. Ancak, bazı spinal çıkıntı nöronlar iyi rejeneratörler ve diğerleri değildir. Bu kağıt tam omurilik kesilerde üreten ve in situ hibridizasyon için Wholemount beyinleri ve omurilik hazırlama, konut deniz taşemen larvaları (ve son zamanlarda dönüştürülmüş yetişkinler) için teknikleri göstermektedir.

Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü<em&gt; Yerinde</em&gt; Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

Zebra balığı yetişkin nörogenezi ve rejenerasyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarına ışık tutmak için, zebra balığı yetişkin telensefalonunda mekanik yaralanmalara neden olan invaziv cerrahi ve ardından bıçaklanmış hemisferdeki değişikliklerin immünohistokimya veya in situ hibridizasyon ile izlenmesi için bir protokol geliştirdik.

Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Neurons'un Aktivitesi

Omurilik yaralanmasından sonra fonksiyonel iyileşme yeteneğine sahip olan yetişkin zebra balığı, doğuştan gelen nöral rejenerasyon mekanizmalarını aydınlatmak için önde gelen bir model sistemidir. Burada, yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışı testlerini omurilik rejenerasyonunun fonksiyonel okumaları olarak tanımlıyoruz.

Yetişkin Zebra Balıklarında Yüzme Dayanıklılığı ve Yüzme Davranışının Değerlendirilmesi

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Xenopus laevis kurbağa yavrusu omurilik transeksiyonu, torasik seviyede omuriliği tamamen kesen enine bir kesim yaparak omurilik yaralanmasını ve rejenerasyonunu incelemek için ilgili bir yaralanma yöntemidir.

Xenopus laevis Kurbağa Yavruları'nda Omurilik Transeksiyonu

Bu protokol, yetişkin zebra balıklarında birkaç kaudal miyomerin derin hasarını indüklemek için bir kriyoyaralanma modelini tanımlamaktadır. Bu yöntem, memeli olmayan omurgalılarda ciddi doku kaybından sonra iskelet kası rejenerasyonunu incelemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

Yetişkin zebra balıklarında kaudal pedinkülün iskelet kası rejenerasyonunu incelemek için bir kriyoyaralanma modeli

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Öğrenin larval zebra balığında omurilik kesisi yöntemini, yüksek verimli ve tekrarlanabilir prosedürle. Bu teknik, sinir kök hücre yanıtını incelemek için immünofloresan mikroskobu kullanarak omurilik rejenerasyonunu araştırır.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Daha fazla video keşfet