Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Bu prosedürün genel amacı, hayatta kalma oranını maksimize ederken, nispeten yüksek kapasiteli ve tekrarlanabilir bir yöntem aracılığıyla larva zebra balıklarında tam omurilik transeksiyonunu sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle uygun genotipe sahip yetişkinlerin çiftleştirilmesi ve gerektiğinde tarama yapılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise embriyoların döllenmeden sonraki beşinci güne kadar büyütülmesidir.

Ardından, eğimli bir mikroenjeksiyon pipeti ile transversiyon işlemini gerçekleştirin. Son olarak, yaralanan balıkların deney sonuna kadar antibiyotikli besiyerinde iyileşmelerine izin verilir. Nihayetinde, sinirsel progenitörlerin yaralanmaya verdiği yanıtı göstermek için immunofloresan mikroskopi kullanılır.

Bu tekniğin, Becker ve fetcher laboratuvarları tarafından öncülük edilen yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları arasında, incelenebilecek daha fazla hayvan sayısı, daha kısa bir iyileşme süresi ve yetişkin zebrafish'lerde aksi takdirde mevcut olmayan genetik araçların kullanımı yer almaktadır. Bu yöntem, rejenerasyon alanındaki yaralanmaya karşı nöral progenitör yanıtı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hazırlıklara, 60 millimeter Petri kapları ve to cell guard 180 4 silikon elastomer kiti kullanarak cerrahi plakalar hazırlayarak başlayın.

Üreticinin talimatlarını takip edin. Kapları yarıdan fazla olmayacak şekilde doldurun ve polimerleşmelerini bekleyin. Ardından kapları ağzı kapalı olarak oda sıcaklığında saklayın.

Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında mikroenjeksiyon iğneleri hazırlamak için kullanılan ayarların aynısını kullanarak, ince duvarlı borosilikat kapiler tüpleri bir mikro pipet çekicide ısıtıp çekerek mikro pipetler üretin. Mikro pipetin ucunu yaklaşık 200 mikron çapta kalacak şekilde kırmak için pens kullanın. Daha sonra, kırılan kenarı bir mikro taşlama cihazıyla önce 35 dereceye, taşlama sesi kesildiğinde ise ikinci bir aşama olarak 25 dereceye eğimli hale getirin.

Ucun keskin ve pürüzsüz olduğundan emin olmak için bir disseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Çok geniş bir uç kullanmak, dorsal aortanın zedelenme olasılığının artması nedeniyle daha yüksek ölüm oranlarına yol açma eğilimindedir. Çok dar bir uç ise dokuyu kesmek yerine deriden kayma eğilimindeyken, doğru açıyla eğimlendirilmiş mikro pipetleri cerrahiden yedi gün önce küçük bir miktar kil üzerinde bir Petri kabında saklayın.

Erkek ve dişi spr. balıklar için çiftleştirme tanklarını hazırlayın. Maksimum verim sağlamak amacıyla, ışıklar açıldıktan üç saat sonra, ertesi sabah döllenmiş embriyoları toplayın.

Karma genotiplere sahip transgenik bir reporter hattı kullanılıyorsa, plaka başına 100 embriyo yerleştirin ve plakaları 28.5 °C'de inkübe edin. Bir reporter hattı kullanılıyorsa, döllenmeden sonra 48. saatte embriyoları floresan ekspresyon açısından tarayın.

Floresan embriyoların, larval dönemde veya fertilizasyondan beş gün sonra 28.5 °C'de olgunlaşmasını sağlayın. Hücre koruyucuyu E2 ve 10 mg/L gentamisin sülfat ile trica ile kaplayarak cerrahi plakayı hazırlayın. Ek olarak, 100 mm'lik bir Petri kabına 25 mL E2 ve gentamisin sülfat ekleyerek bir iyileşme kabı hazırlayın.

Bir sonraki adım, üç adet pamuklu çubuğu birbirine bantlayarak bir skalpel sapı hazırlamaktır. Bu işlem, üç kanallı üçgen bir araç oluşturur. Ardından, hazırlanan mikro pipeti kanallardan birine bantlayarak skalpeli tamamlayın ve mikro pipeti ihtiyaç duyulana kadar kenara koyun.

Her seferinde 25 larva içeren bir plakayı anestezi yaparak cerrahi işleme başlayın. Trica ile balıklar, dokunma tepkisi vermedikleri zaman yeterince anestezi olmuş sayılırlar. Larvaları bir cerrahi plakaya aktarın ve plakayı bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Maksimum büyütme altında, bir larvayı, sırtı bistüriyi tutan ele en yakın olacak şekilde yan yatana kadar döndürün. Penseti, hücre koruyucusunun üzerine yaslanacak şekilde konumlandırın. Larvanın genişliğine açılı bir şekilde, cam bistürüyü pensetin kollarından birine yaslayın.

Larvaların anal por seviyesinden dorsal lateral yüzeyine kesi yapın. Notokordun ventral kenarının ötesine geçmediğinizden emin olun. Ardından, omuriliği koparmak için skalpeli döndürün.

Gerekli döndürme işlemi genellikle 90 dereceden çok daha azdır. Kalan larvalarla omurilik kesisi işlemini tekrarlayın. Larva grubundaki cerrahi işlem tamamlandığında, yaralanan hayvanları iyileşme plakasına aktarmak için bir posterior pipet ve pipet pompası kullanın.

Anesteziyi gidermek için, taşıma sırasında önce larva başını veya kuyruğunu tuttuğunuzdan emin olun. Anestezi etkisi geçtikten sonra larvaları bükerek yaralanma bölgesini zorlamayın. Yaralı larvaları, geri kazanım plağından, 25 mL E2 ve gentamisin sülfat içeren 100 milimetrelik plakalara, plaka başına 25 larva olacak şekilde aktarın.

Ardından, yara iyileşirken bunları 28.5 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Plakaları günlük olarak kontrol edin. Hasta veya ölü hayvanları uzaklaştırın.

Tatlı su protozoa kümeleri medyada görünene kadar medyayı değiştirmeyin. Medyayı değiştirirken balıkları yeni bir plakaya aktarmayın. Bunun yerine, mümkün olduğunca fazla medyayı uzaklaştırın ve aynı plakayı yeni medyayla doldurun.

Kops popülasyonunu azaltmak için gerektiği kadar ortam değişimi işlemini tekrarlayın. Larvaları her gün az miktarda toz yavru yemiyle besleyin. Burada, spinal kordu tamamen kesilmiş bir zebra balığı birinci günde gösterilmektedir.

Yaralanma sonrası, GFP tüm nöronlarda eksprese edilmiştir ve sarı ok yaralanma bölgesini belirtmektedir. Tam olarakle kesilmiş bir omuriliğe sahip zebra balığı, burada yaralanmadan üç gün sonra gösterilmiştir. Fikse edilmiş UCD işaretli bu zebra balığı, tamamen kesilmiş bir omurilik sergilemektedir.

Sarı ok tekrar yaralanma bölgesini belirtmektedir. Buna karşılık, omuriliğin ventral kenarı boyunca devam eden nöron boyaması, yaralanmadan sonraki üçüncü gündeki sabitlenmiş zebra balığında eksik bir transversiyonu (kesiyi) göstermektedir.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, saatte 300 larva işlenebilir.