Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Bu prosedürün genel amacı, hayatta kalımı en üst düzeye çıkarırken nispeten yüksek verim ve tekrarlanabilir bir yöntemle larva zebra balığında tam omurilik transeksiyonunu sağlamaktır. Bu, önce uygun genotipteki yetişkinlerin çiftleşmesi ve gerektiği gibi taranmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, embriyoları döllenmeden beş gün sonrasına kadar büyütmektir.

Ardından, eğimli bir mikroenjeksiyon pipeti ile transeksiyonu gerçekleştirin. Son olarak, yaralı balıkların deneyin sonuna kadar antibiyotik muameleli ortamlarda iyileşmesine izin verilir. Sonuç olarak, yaralanmaya nöral progenitör yanıtı göstermek için immünofloresan mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin, Becker ve getirici laboratuvarlarının öncülük ettiği yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre başlıca avantajları, daha kısa bir iyileşme süresi ve yetişkin zebra balıklarında başka türlü bulunmayan genetik araçların kullanımını incelemek için daha fazla sayıda hayvanı içerir. Bu yöntem, nöral progenitörün yaralanmaya verdiği yanıt gibi rejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hazırlıklara 60 milimetre Petri kapları ve hücre koruması 180 4 silikon elastomer kiti kullanarak ameliyat plakaları yaparak başlayın.

Üreticinin talimatlarına uyarak. Bulaşıkları yarısından fazla olmayacak şekilde doldurun ve polimerize olmalarına izin verin. Daha sonra bulaşıkları kapalı olarak oda sıcaklığında saklayın.

Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında mikroenjeksiyon iğneleri yapmak için kullanılan ayarların aynısını kullanarak, ince duvarlı bo silikat kılcal boruyu bir mikro pipet polarında ısıtıp çekerek mikro pipetler üretin. Mikro pipetin ucunu yaklaşık 200 mikron çapında koparmak için forseps kullanın. Ardından, kırık kenarı bir mikro öğütücü ile başlangıçta 35 dereceye kadar eğimlendirin, ardından taşlama gürültüsü durduğunda 25 derecede ikinci bir eğim verin.

Ucun keskin ve pürüzsüz olduğundan emin olmak için bir diseksiyon dürbünü altında kontrol edin. Çok geniş bir uç kullanmak, dorsal aortun çentiklenme olasılığının artması nedeniyle daha yüksek ölümlerle sonuçlanma eğilimindedir. Çok dar bir uç, dokuyu kesmek yerine cilde bakma eğilimindeyken, doğru eğimli mikro pipetleri ameliyattan yedi gün önce az miktarda kil üzerinde bir Petri kabında saklayın.

Balıklar ertesi sabah, ışıklar yandıktan üç saat sonra döllenmiş embriyoları toplarlar. Maksimum verimi sağlamak için.

Karışık genotiplere sahip bir transgenik raportör hattı kullanıyorsanız, plaka başına 100 embriyo yerleştirin, plakaları 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Bir raportör hattı kullanıyorsanız, embriyoları 48 saatte floresan ekspresyonu için tarayın. Döllenme sonrası.

Floresan embriyoların larvalar veya döllenmeden beş gün sonra 28.5 santigrat derecede olgunlaşmasına izin verin. Hücre koruyucusunu litre başına iki ve 10 miligram E, gentamisin sülfat ve trika ile kaplayarak ameliyat plakasını hazırlayın. Ek olarak, 100 milimetrelik bir Petri kabına 25 mililitre E 2 ve Gentamisin sülfat ekleyerek bir kurtarma kabı hazırlayın.

Bir sonraki adım, üç çubuğu birbirine bantlayarak bir neşter sapı hazırlamaktır. Bu, üç oluklu üçgen bir alet oluşturur. Ardından, hazırlanan mikro pipeti, neşteri tamamlamak için oluklardan birine bantlayarak çubukların üzerine monte edin, mikro pipeti ihtiyaç duyulana kadar bir kenara koyun.

Ameliyata bir seferde 25 larvadan oluşan bir plakayı uyuşturarak başlayın. Trica ile, balıklar artık dokunma tepkisi göstermediklerinde yeterince uyuşturulur. Larvaları bir ameliyat plağına aktarın ve plakayı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.

Maksimum büyütme altında, bir larvayı, neşteri tutan ele en yakın sırtı gelecek şekilde yan yatacak şekilde döndürün. Forsepsleri, hücre koruyucusunun üzerinde duracak şekilde konumlandırın. Larvaların genişliği boyunca açılı, cam neşteri forsepsin kollarından birine doğru destekleyerek.

Larvaların dorsal lateral yüzüne anal gözenek seviyesinde kesin. Kordon yokluğunun ventral kenarının ötesini kesmediğinizden emin olun. Sonra omuriliği kesmek için neşteri bükün.

Gerekli büküm genellikle 90 dereceden çok daha azdır. Omurilik transeksiyonunu kalan larvalarla tekrarlayın. Larva grubu üzerindeki ameliyat tamamlandıktan sonra, yaralı hayvanları kurtarma plakasına aktarmak için bir arka pipet ve pipet pompası kullanın.

Anesteziyi temizlemek için, transfer sırasında önce larva başını veya kuyruğunu topladığınızdan emin olun. Anestezi etkisini yitirdikten sonra larvaları bükerek yaralanma bölgesini zorlamayın. Yaralı larvaları kurtarma plakasından 25 mililitre E iki ve plaka başına 25 larva yoğunluğunda gentamisin sülfat ile doldurulmuş 100 milimetrelik plakalara aktarın.

Daha sonra yara iyileşirken onları 28,5 santigrat derecelik bir kuvöze yerleştirin. Plakaları günlük olarak kontrol edin. Hasta veya ölü hayvanları çıkarmak.

Tatlı su protozoa kümesleri medyada görünene kadar ortamı değiştirmeyin. Ortamı değiştirirken, balığı yeni bir tabağa aktarmayın. Bunun yerine, mümkün olduğu kadar çok ortamı çıkarın ve aynı plakayı yeni ortamla doldurun.

Kümes popülasyonunu azaltmak için medya değişikliğini gerektiği kadar tekrarlayın. Larvaları günlük olarak az miktarda toz yavru yemi ile besleyin. Burada bir günde omuriliği tamamen kesilmiş bir zebra balığı gösterilmektedir.

Yaralanma sonrası, GFP tüm nöronlarda eksprese edilir ve sarı ok yaralanma bölgesini tanımlar. Omuriliği tamamen kesilmiş bir zebra balığı burada yaralanmadan üç gün sonra, yaralanmadan üç gün sonra gösterilmiştir. Bu sabit UCD etiketli zebra balığı, tamamen kesilmiş bir omuriliği gösterir.

Sarı ok yine yaralanma bölgesini tanımlar. Buna karşılık, omuriliğin ventral kenarı boyunca bitişik nöron etiketleme bölgesi. Yaralanma sonrası bu üç günde, sabit zebra balığı eksik bir transeksiyonu gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra bu teknik kullanılarak saatte 300 larva işlenebilir.