Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü Yerinde Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

Lamprey tam omurilik hasarı sonrası lokomosyonu kurtarmak. Ancak, bazı spinal çıkıntı nöronlar iyi rejeneratörler ve diğerleri değildir. Bu kağıt tam omurilik kesilerde üreten ve in situ hibridizasyon için Wholemount beyinleri ve omurilik hazırlama, konut deniz taşemen larvaları (ve son zamanlarda dönüştürülmüş yetişkinler) için teknikleri göstermektedir.

Bu prosedürün genel amacı, yaralanma sonrası Axon rehberliğinin incelenmesi için tam bir omurilik, transeksiyon ve beyin diseksiyonu yapmaktır. Bu, beşinci solungaç seviyesinde bir lampre omurilik olan ilk kesit ile gerçekleştirilir. Daha sonra beyin parçalara ayrılır ve syl korumasına sabitlenir.

Beyni sabitledikten sonra, metanol içinde saklanabilir veya hemen in situ hibridizasyon için kullanılabilir, sonuçta aksonal ekspresyondaki değişiklikler olur. Rehberlik reseptörleri, omurilik yaralanmasından sonra yenilenen bir omurda görülebilir. Bugün göstereceğimiz tekniğin daha geleneksel parafin kesit alma veya kriyostat kesit alma üzerindeki avantajı, büyük ve tanımlanmış omuriliğe çıkıntı yapan nöronlar da dahil olmak üzere tüm beyni görmenize izin vermesidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımızda bir araştırma bilimcisi olan Dr.Kathy Zang'dır Michigan Gölü kollarını besleyen akarsulardan Pennsylvania'daki Delaware Nehri'ne veya Maine'deki akarsulara. Yabani tip larva deniz lambası türünün. Marus'ta evcil hayvan elde edildi.

Dört ila 7 yaşındaki larvalar 10 ila 14 santimetre uzunluğundadır ve yaralanma ve diseksiyon için yeterince büyüktür. Onları yüz kişilik 52 kişilik gruplar halinde tutun. 16 santigrat derecede 50 galonluk tatlı su tanklarında.

Tank, bir inçlik bir çakıl alt tabaka gerektirir, böylece lamprey ödünç alabilir: Tanka eklenen tüm su, tanka eklenmeden önce en az 48 saat boyunca kömür filtreleme ve havalandırma ile şartlandırılmalıdır. Hayvanların bir yıl içinde kullanılması şartıyla, bu işlem için onları beslemeye gerek yoktur. Taze hazırlanmış zil çözeltisini hazır bulundurun.

İlk olarak, bir lambayı doymuş sulu benzokain çözeltisine aktarın. Anestezi uygulandıktan sonra, yarısı sil koruyucu ile doldurulmuş bir kaba aktarın. Çanağı buzun üzerine koyun ve tabağın üzerine buzla doldurun.

Soğuk zil sesleri. Hayvanı, biri burnunda ve ikisi beşinci solungaçta olmak üzere üç adet 0.15 çapında böcek iğnesi ile sabitleyin. Daha sonra ameliyat için stereo mikroskop altına yerleştirin.

Beşinci solungaç seviyesinde dorsal orta hat boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak için 11 numaralı bir neşter kullanarak başlayın. Bu kesi yapılırken omurilik ortaya çıkacaktır. Castro reveal sekiz numaralı makası kullanarak vücut duvarlarını sabitlemek için böcek iğnelerinden yapılmış iki kanca kullanın.

Açıkta kalan omurilik boyunca dik bir kesim yapın. Transeksiyonun tamamlandığından emin olmak için omuriliğin kesik uçlarını inceleyin. Daha sonra forseps kullanarak kesilen uçları yeniden hizalayın ve yarayı kapatın.

Lampre lava'yı zil çözeltisine batırılmış bir filtre kağıdına aktarın. Preparasyonu bir saat boyunca bir buz yatağına taşıyın, böylece yara bir saat sonra kuruyabilir. Lavları kendi küçük buz gibi soğuk su tankına aktarın.

Orada 24 saat iyileşmesine izin verin. 24 saat sonra, transeksiyona kordali hareket olup olmadığını kontrol edin. Herhangi bir hareket varsa, transeksiyon eksikti.

Eğer yoksa, o zaman transekt iyiydi ve hayvan iyileşirken hayvan geri kazanım için oda sıcaklığındaki bir tanka taşınabilir. Suyu her iki ila üç günde bir değiştirin. Kesilen hayvan yeterince iyileştikten sonra, uyuşturun ve daha önce tarif edildiği gibi diseksiyon için hazırlayın.

Beyni incelemek için, burun deliği ile epifiz organı arasında enine bir kesi ile başlayın. Daha sonra Castro dana eti ile makas, hayvanı sabitlerken beyni çevreleyen dokuyu kesti. Forseps ile.

Beyin sapının her iki yanındaki beyaz oval yapılar otik kapsüllerdir. Beyin açığa çıktığında, koroid pleksusu çıkarmak için forseps kullanın. Ardından, hayvanın kafasını yaymak ve kraniyal sinirleri ortaya çıkarmak için modifiye edilmiş pim kancalarını kullanın.

Daha sonra omuriliği forseps ile sabitlerken omuriliği makasla enine kesin. Beyni incelemek için kraniyal sinirleri kesin. Sonra beyni küçük bir silikon parçasına aktarın ve oraya sabitleyin.

Omurilikte bir böcek pimi ve koku alma ampullerinden birinden bir iğne kullanarak. Daha sonra makası kullanarak, koku alma ampulü komissürünü, serebral koruyucu komissürü ve beyin sapının oex'ini dorsal orta hat boyunca kesin. Komissürler ve oex kesildikten sonra, A LR plakalarını yanal olarak saptırın ve ikisi koku ampullerinde, ikisi kesiğin kenarlarında, serebral koruyucu komissür, ikisi uzatılmış oex'te ve biri omuriliğin orta hattında olmak üzere toplam yedi böcek pimi ile silikona düz bir şekilde sabitleyin.

Şimdi RNA içermeyen reaktifleri kullanarak, preparatı oda sıcaklığında% 4 para formaldehit içinde hafif çalkalama ile üç saat boyunca sabitleyin. Beyinler daha sonra tarif edilen yöntem kullanılarak in situ iki hibridizasyon ile analiz edilebilir, transkriptlerde neojen ekspresyonu omurilikte, kontrol nöronlarını yansıtarak, hayvanlarda ve hayvanlarda tanımlanmıştır. Burada görülen lezyondan iki hafta sonra, temsili bir yaralanmamış kontroldür.

Tam omurilik transeksiyonundan sonra, neojen reseptörünün ekspresyonunda değişiklikler oldu. İki hafta sonra, kontrol edilemeyen neojen reseptörü tercihen M1 I, bir, I, iki I, dört veya MTH nöronları gibi kötü rejeneratörlerde eksprese edildi. Bu tekniğin geliştirilmesi, aynı beyinde rehberlik reseptörlerinin, kondroitin sülfat reseptörlerinin, protio'nun, glikanların ve döküm bazlarının aktivasyonunun ekspresyonunu keşfetme yeteneğimizin yolunu açtı.