Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi
February 21st, 2014
Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.
Bu prosedürün genel amacı, membran, unla, molarite, mono dispersite ve iç içerikler üzerinde daha fazla kontrole sahip fosfolipid çift katmanlı veziküller oluşturmaktır. Cad kullanılarak, akrilik levhalardan ve doğal kauçuktan bir oda imal edilir. Askıya alınmış bir lipit çift tabakası, haznenin lipitler ve çözelti ile yüklenmesiyle üretilir.
Daha sonra, kapsüllenecek çözeltiyi içeren bir mürekkep püskürtmeli, püskürtme aparatı ile kurulur. Uygun ayarlar yapıldıktan sonra, püskürtülen sıvı darbeleri lipid çift katmanlı veziküller üretecektir. Sonuç olarak, mikroakışkan püskürtme, tekrarlanabilir mono dağılmış iki katmanlı veziküller verir.
Bu tekniğin elektro oluşumu, emülsiyon veya damlacık oluşumu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, membranı yöneten kontrol seviyesi, tek taraflı molarite, mono dağılım ve iç içeriklerdir. Prosedürü gösteren, bir laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olan Johanna Harrow olacak ve bir lisans öğrencisi olan Kara Patel yardımcı olacak CAD yazılımı kullanarak, bir lazer kesici ilk matkap kullanılarak akrilikten yapılabilecek oda için bir şekil çizin, monte edilmiş akrilik haznenin her iki tarafındaki deliklerden bir 16. inç. Bu sonsuzluk şeklindeki kuyuya akacaktır.
İkinci olarak, sonsuzluğun alt kısmı şeklinde hizmet etmek için 0,2 milimetrelik bir akrilik levhadan makasla küçük bir dikdörtgen kesin. Bunu hızlı kuruyan yapıştırıcı ile yerine sabitleyin ve görüntüleme alanlarına yapıştırıcı bulaşmamasına dikkat edin. Akrilik levha, hazne duvarına yıkanmalı ve haznenin dibine sabitlenmelidir.
Üçüncüsü, delinmiş deliklerin üzerine ince bir parça doğal kauçuk levha yapıştırmak için çabuk kuruyan yapıştırıcı kullanın. Cımbızla yerlerine bastırın. Yapıştırılmış dikişlerin tümünde sızıntı olup olmadığını test edin.
Hiç olmamalı. Son olarak, 23 gauge bir iğne kullanarak, açılan deliklerden kauçuğa delikler açın, piezoelektrik mürekkep püskürtmeli uç bu deliklerden sokulacaktır. Stok fosfolipitler kloroformda çözülmeli ve eksi 20 santigrat derecede saklanmalıdır.
D-P-H-P-C veya DOPC. Bu gösteride lipitler kullanılmıştır. Kloroformda çözünen lipitler, flakon belirli bir açıda tutulurken bir cam şişeye aktarılır, lipitler argon veya nitrojen gazı altında nazikçe kurutulur.
Ardından, kalan çözücüyü çıkarmak için şişeyi kapağı hafifçe gevşek olacak şekilde bir ila iki saat vakum altında yerleştirin. Bu adım için bir kurutucu da kullanılabilir. Şimdi, mililitre başına 25 miligramlık bir nihai lipit konsantrasyonu için lipitleri uç döşemede çözündürün.
Çözümü girdap. Kapağı kısaca param ile kapatın ve ardından 15 dakika boyunca sonikasyon yapın. Bu çözeltiyi eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Daha sonra, ozmolarite gibi fizyolojik bir stok sükroz çözeltisi hazırlayın. Bu püskürtme çözümüdür. Daha fazla kontrast veya floresan için çözeltiye bir damla koyu gıda boyası veya floresan boncuk eklemeyi düşünün.
Sıkışan havayı çıkarmak için sükroz çözeltisini bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Şırıngayı, herhangi bir kabarcık yem açıklığına yükselecek ve dışarı atılabilecek şekilde hafifçe vurun. Ardından, şırıngaya 33 milimetre 0.22 mikronluk bir filtre takın ve filtreden bir damlacık dışarı itin.
Şimdi mürekkep püskürtmenin dişi yem adaptörünü sökün ve filtrenin ucuna bastırın. Sıkışan havayı çıkarmak için biraz sıvı dışarı itin. Son olarak, şırıngayı mürekkep püskürtmeli sıvının üstüne takın.
Şırınga doğru şekilde takılmışsa mürekkep püskürtmeli uca gitmelidir. İlk olarak, şırınga tertibatını mikroskop aşamasına monte edin ve bu deney için mürekkep püskürtmeli denetleyiciyi bağlayın. Sahne ve şırınga, görselleştirme için her ikisi de üç boyutta hareket eden sahne ve şırınga ile bağımsız kontrole ihtiyaç duyar.
Saniyede en az 1000 kare yapabilen yüksek hızlı bir kamera kurun. Kayıtları başlatmak için görüntü tabanlı otomatik tetiklemeyi kullanacak şekilde ayarlayın. Şimdi, hazneyi sahneye bantla sabitleyin ve mürekkep püskürtmeli ucu, haznenin yan tarafındaki kauçuk levhada açılan delikle dikkatlice hizalayın.
Önce gözle ayarlayın ve ardından mikroskobu kullanarak ince ayarlamalar yapın. Hizalandıktan sonra, sonsuzluk şeklindeki yüklemeyi yapmak için şırıngayı bir boyut boyunca geri çıkarın. Daha sonra pistona hafif bir basınç uygulayın, böylece nozul üzerinde bir damlacık oluşur.
Bu, başlangıçta bir miktar geri basınç sağlar. Püskürtme parametrelerinin ayarlanması gerekir. Daha sonra, trapez bipolar dalga için spesifik değerler, ekranda uygulanan voltaj ve tetik kontrol vezikülü boyutu başına jet darbelerinin sayısı üzerinde sunulur.
Şimdi odaya, son on yılda 25 ila 30 mikrolitre lipit çözeltisi yükleyin ve sonsuzluk şeklindeki tüm yüzeyi kaplayın. Daha sonra her birine, yavaş ve düzgün bir şekilde pipetleyerek en dış kenara 25 mikrolitre glikoz çözeltisi ekleyin, glikoz lipit çözeltisine karışmamalıdır. 10 dakika içinde, odanın merkezinde bir lipit çift tabakası oluşacaktır.
Çift katmanın kurulması en kritik adımdır, çünkü çift katman kararsızdır ve hazırlığa bağlı olarak kırılabilir. Sabırlı olun. Hazneyi birkaç kez doldurma alıştırması yaptığınızda işe yarayacaktır.
Şimdi, uç damlacık arayüzünün 200 mikron yakınındayken mürekkep püskürtmeli ucu dikkatlice hazneye geri yerleştirin. İki katmanlı, püskürtme işlemini başlatın ve vezikül oluşturma süreci hakkında bilgi sağlayan mürekkep püskürtmeli kullanarak verileri kaydedin. Örneğin, mürekkep püskürtmeli nozul ile lipid çift tabakası arasındaki mesafenin değiştirilmesi, zarı deforme eden kuvveti etkiledi. Kapatmak.
Çift tabakaya yakınlık, jet akımına odaklandı ve zarın enerjiyi vezikül oluşum noktasından uzağa dağıtmasını engelledi. Ayrıca, pizo elektrikli aktüatöre uygulanan voltaj ile girdap hareketi artmıştır. Vezikül oluşumu, oluşumlarını takip eden bir dizi olay olarak görselleştirildi.
Vezikül stabilitesi, vezikül çapına göre değişme eğilimindeydi ve daha küçük veziküller daha stabildi. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan püskürtme kullanarak lipid ihlal eden veziküllerin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, bir damla arayüzü lipid çift tabakasına karşı mikroakışkan jetleme kullanarak fosfolipid çift tabakalı veziküller üretme yöntemini ele almaktadır. Teknik, membran asimetrisi, transmembran protein dahil edilmesi ve malzemelerin kapsüllenmesi üzerinde hassas kontrol sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- Fosfolipid çift tabakalı veziküller, bölmelendirilmiş biyomoleküllerin incelenmesi için esastır.
- Mikroakışkan teknikler, vezikül oluşumunun tekrarlanabilirliğini ve kontrolünü artırır.
- Membranla ilgili özellikleri anlamak, çeşitli biyolojik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Jetleme teknolojisi, vezikül üretim sürecini hızlandırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kontrollü membran özelliklerine sahip veziküller üretmek.
- Spesifik proteinlerin çift tabakaya dahil edilmesini kolaylaştırmak.
- Araştırma amaçlı çeşitli malzemelerin kapsüllenmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Akrilik levhalar ve doğal kauçuktan bir haznenin üretilmesi.
- Haznenin lipidler ve çözelti ile yüklenmesiyle askıya alınmış bir lipid çift tabakasının üretilmesi.
- Çözeltileri kapsüllemek için bir inkjet aparatının kurulması.
- Veziküller oluşturmak için jetlenen sıvı darbeleri için uygun ayarların belirlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Mikroakışkan jetleme, tekrarlanabilir, tek dağılımlı çift tabakalı veziküller üretir.
- Yöntem, vezikül özellikleri üzerinde hassas kontrol sağlar.
- Malzemelerin kapsüllenmesi etkili bir şekilde gerçekleştirilir.
- Veziküller çeşitli biyolojik çalışmalar için uyarlanabilir.
Sonuçlar
- Mikroakışkan jetleme, vezikül üretimi için güvenilir bir tekniktir.
- Membranla ilgili asimetri ve protein dahil edilmesi üzerindeki kontrol artırılmıştır.
- Bu yöntemin, bölmelendirilmiş biyomoleküllerin incelenmesi için önemli etkileri vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Microfluidic jetting enables precise control over lipid bilayer vesicle generation, supporting reproducible production of giant unilamellar vesicles (GUVs) with defined membrane composition and encapsulation capacity. This capability addresses a key challenge in synthetic biology and drug delivery research by providing a tunable platform for modeling cellular systems and testing bioactive compounds. The method enhances predictive confidence in early-stage target validation by allowing systematic interrogation of membrane-dependent processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled membrane asymmetry and transmembrane protein incorporation.
- Operational Value: Supports functional target validation by generating reproducible vesicle systems for pathway clarification.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative readouts on lipid-protein interactions and encapsulation efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by producing mono-dispersed vesicles with tunable size and internal content.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise jetting parameters that control vesicle formation.
- Screening Readiness: Highlights platform scalability and reuse for reliable compound evaluation across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through the use of physiological-like osmolarity solutions and fluorescent tracking for vesicle monitoring.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling encapsulation of therapeutic candidates for stability and release studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing measurable outputs on vesicle stability and diameter-dependent performance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, particularly in assays requiring controlled membrane environments and encapsulated compound delivery.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by enabling systematic variation of lipid composition and transmembrane protein incorporation to clarify pathway dependencies.
- Screening: Describes assay readiness through the generation of mono-dispersed vesicles that ensure consistent compound exposure and reproducible readouts.
- Analytics: Highlights quantitative measurements such as vesicle size, formation rate, and encapsulation efficiency that help teams compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling encapsulation of drugs or biomolecules for stability testing and release profiling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple projects requiring synthetic vesicle platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in membrane-related mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vesicle production for high-throughput applications.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking of delivery mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on vesicle performance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, lipid handling, and microscopy for chamber assembly and bilayer formation.
- Depends on instrumentation including piezo-actuated inkjet devices, high-speed cameras, and vacuum drying systems.
- Necessitates cross-team standardization of lipid solutions, jetting parameters, and chamber alignment procedures.
- Involves adaptation considerations for different lipid types, transmembrane proteins, and encapsulation agents across model systems.
- Includes practical limitations such as bilayer instability during setup and sensitivity to environmental vibrations during jetting.
