Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi
21 Şubat 2014
Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.
Bu prosedürün genel amacı; membran, lümen, molarite, monodispersite ve iç içerik üzerinde artırılmış kontrolle fosfolipid çift katmanlı veziküller oluşturmaktır. CAD kullanılarak, akrilik levhalar ve doğal kauçuktan bir hazne imal edilir. Haznenin lipidler ve solüsyonla doldurulmasıyla askıda bir lipid çift katmanı üretilir.
Ardından, enkapsüle edilecek çözeltiyi içeren bir inkjet, püskürtme düzeneği ile birlikte kurulur. Uygun ayarlar belirlendikten sonra, püskürtülen sıvı darbeleri lipid çift katmanlı veziküller oluşturacaktır. Sonuç olarak, mikroakışkan püskürtme yöntemi, tekrarlanabilir monodispers çift katmanlı veziküller sağlar.
Bu tekniğin elektro formasyon, emülsiyon veya damlacık üretimi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; membran, tek taraflı molarite, monodispersite ve iç içeriklerin kontrol düzeyinin artırılmış olmasıdır. Prosedürü, bir laboratuvarda lisansüstü öğrencisi olan Johanna Harrow gerçekleştirecek ve lisans öğrencisi Kara Patel ona yardımcı olacaktır. CAD yazılımı kullanarak, lazer kesici ile akrilikten üretilebilecek bir hazne şekli çizin; ardından, monte edilmiş akrilik haznenin her iki yanına 1/16 inç çapında delikler açın. Bu delikler sonsuzluk şeklinde olan kuyuya tahliye sağlayacaktır.
İkinci olarak, sonsuzluk şeklinin tabanı olarak kullanılmak üzere 0,2 milimetrelik bir akrilik levhadan makasla küçük bir dikdörtgen kesin. Gözlem alanlarına yapıştırıcı bulaşmamasına dikkat ederek, bunu hızlı kuruyan bir yapıştırıcı ile yerine sabitleyin. Akrilik levha, hazne duvarıyla aynı hizada olmalı ve haznenin tabanına sıkıca sabitlenmelidir.
Üçüncü olarak, delinen deliklerin üzerine ince bir doğal kauçuk levha parçası yapıştırmak için hızlı kuruyan yapıştırıcı kullanın. Bunları cımbızla bastırarak yerleştirin. Yapıştırılan tüm ek yerlerini sızıntı olup olmadığına karşı test edin.
Hiç olmamalıdır. Son olarak, 23 gauge bir iğne kullanarak, delinmiş deliklerden geçecek şekilde kauçuk üzerine delikler açın; piezoelektrik inkjet ucu bu deliklerden içeri yerleştirilecektir. Stok fosfolipidler kloroform içinde çözülmeli ve -20 °C'de saklanmalıdır.
Bu gösterimde D-P-H-P-C veya DOPC lipidleri kullanılır. Kloroform içinde çözünmüş lipidler, cam vial eğik tutulurken vial içerisine aktarılır; lipidler argon veya nitrojen gazı altında nazikçe kurutulur.
Ardından, kalıntı çözücüyü uzaklaştırmak için kapağı hafifçe gevşetilmiş olan flakonu bir ila iki saat boyunca vakum altında bekletin. Bu adım için bir desikatör de kullanılabilir. Şimdi, lipidleri nihai lipid konsantrasyonu 25 mg/mL olacak şekilde end decking içerisinde çözünürleştirin.
Çözeltiyi vorteksleyin. Kapağı parafilm ile kısa süreliğine kapatın ve ardından 15 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Bu çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
Ardından, fizyolojik osmolariteye benzer bir stok sakroz çözeltisi hazırlayın. Bu, püskürtme çözeltisidir. Kontrastı veya floresansı artırmak için çözeltiye bir damla koyu renkli gıda boyası veya floresan boncuklar eklemeyi değerlendirin.
Hapsolmuş havayı çıkarmak için sakkaroz çözeltisini bir mililitrelik bir şırıngaya çekin. Kabarcıkların yem açıklığına yükselip dışarı atılabilmesi için şırıngaya hafifçe vurun. Ardından, şırıngaya 33 milimetrelik 0,22 mikronluk bir filtre takın ve filtreden bir damla dışarı itin.
Şimdi inkjetin dişi Luer adaptörünü sökün ve filtrenin ucuna bastırarak yerleştirin. Hapsolmuş havayı çıkarmak için bir miktar sıvı dışarı itin. Son olarak, şırıngayı inkjet sıvısının üst kısmına takın.
Şırınga doğru şekilde takıldıysa, sıvı mürekkep püskürtme ucuna ulaşmalıdır. Öncelikle, şırınga düzeneğini mikroskop tablasına monte edin ve bu deney için mürekkep püskürtme kontrolcüsünün bağlantılarını yapın. Görselleştirme için hem tablanın hem de şırınganın üç boyutta hareket edebilmesi adına, tablanın ve şırınganın bağımsız olarak kontrol edilmesi gerekir.
Saniyede en az 1000 kare çekim yapabilen yüksek hızlı bir kamera kurun. Kayıtları başlatmak için görüntü tabanlı otomatik tetiklemeyi kullanacak şekilde ayarlayın. Şimdi, hazneyi bantla sahneye sabitleyin ve mürekkep püskürtme ucunu haznenin yanındaki kauçuk levhaya açılan delikle dikkatlice hizalayın.
Önce gözle ayarlama yapın ve ardından mikroskobu kullanarak hassas ayarları gerçekleştirin. Hizalama tamamlandığında, sonsuzluk şeklini yüklemek için şırıngayı tek bir boyut boyunca geri çekin. Ardından, nozul ucunda bir damla oluşması için pistonla hafifçe basınç uygulayın.
Bu, başlangıçta bir miktar geri basınç sağlar. Püskürtme parametrelerinin ayarlanması gerekir. Ardından, vezikül boyutunu kontrol eden, tetikleme başına püskürtme darbe sayısı ve uygulanan voltaj için trapezoidal bipolar dalgaya yönelik spesifik değerler ekranda sunulur.
Şimdi hazneyi, sonsuzluk şeklindeki yüzeyin tamamını kaplayacak şekilde 25 ila 30 µL lipid çözeltisi ile doldurun. Ardından her bir kuyucuğun en dış kenarına, yavaş ve pürüzsüz bir şekilde pipetleyerek 25 µL glukoz çözeltisi ekleyin; glukoz, lipid çözeltisi ile karışmamalıdır. 10 dakika içinde, haznenin merkezinde bir lipid çift tabakası oluşacaktır.
Çift katmanın kurulması en kritik adımdır; çünkü çift katman kararsızdır ve hazırlık aşamasına bağlı olarak bozulabilir. Sabırlı olun. Hazneyi doldurma işlemini birkaç kez pratik yaptıktan sonra başarılı olacaksınız.
Şimdi, uç damlacık ara yüzeyinden 200 mikron mesafe içerisindeyken inkjet ucunu dikkatlice tekrar hazneye yerleştirin. Bilayer, püskürtme işlemini başlatın ve verileri kaydedin; inkjet, vezikül oluşum süreci hakkında bilgi sağladı. Örneğin, inkjet nozulu ile lipid çift katmanı arasındaki mesafenin değiştirilmesi, membranı deforme eden kuvveti etkiledi.Kapat.
Çift katmana olan yakınlık, jet akımını odaklamış ve membranının, vezikül oluşum noktasından uzaklaşan enerjiyi dağıtmasını önlemiştir. Ayrıca, vorteks iletimi, piezoelektrik aktüatöre uygulanan voltaj ile birlikte artış göstermiştir. Vezikül oluşumu, oluşumlarını takip eden bir olaylar dizisi olarak görüntülenmiştir.
Vezikül stabilitesinin vezikül çapına göre değişme eğiliminde olduğu ve daha küçük veziküllerin daha stabil olduğu görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan jetleme yöntemiyle lipid veziküllerinin nasıl üretileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, bir damlacık ara yüzey lipid çift katmanına karşı mikroakışkan püskürtme kullanarak fosfolipid çift katmanlı veziküller oluşturma yöntemini tartışmaktadır. Bu teknik; membran asimetrisi, transmembran protein entegrasyonu ve materyallerin kapsüllenmesi üzerinde hassas kontrol sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- Fosfolipid çift katmanlı veziküller, bölmelere ayrılmış biyomoleküllerin incelenmesi için gereklidir.
- Mikroakışkan teknikler, vezikül oluşumunun tekrarlanabilirliğini ve kontrolünü artırır.
- Membran özelliklerini anlamak, çeşitli biyolojik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Püskürtme teknolojisi, vezikül üretimi sürecini optimize edebilir.
Çalışmanın Amacı
- Kontrollü membran özelliklerine sahip veziküller üretmek.
- Spesifik proteinlerin çift katmana entegrasyonunu kolaylaştırmak.
- Araştırma amaçlı çeşitli materyallerin enkapsülasyonuna olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Akrilik levhalar ve doğal kauçuktan bir hazne üretimi.
- Hazneyi lipidler ve çözelti ile doldurarak askıda lipid çift tabakası oluşturma.
- Çözeltileri kapsüllemek için bir inkjet düzeneğinin kurulması.
- Veziküller oluşturmak için püskürtülen sıvı darbelerine yönelik uygun ayarların belirlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Mikroakışkan püskürtme, tekrarlanabilir ve mono-dispers kılıflı çift katmanlı veziküller üretir.
- Yöntem, vezikül özelliklerinin hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır.
- Materyallerin enkapsülasyonu etkili bir şekilde gerçekleştirilir.
- Veziküller, çeşitli biyolojik çalışmalar için özelleştirilebilir.
Sonuçlar
- Mikroakışkan püskürtme, vezikül üretimi için güvenilir bir tekniktir.
- Membran asimetrisi ve protein entegrasyonu üzerindeki kontrol artırılmıştır.
- Bu yöntemin, bölmelere ayrılmış biyomoleküllerin incelenmesi açısından önemli etkileri vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Mikroakışkan püskürtme, lipid çift katmanlı vezikül üretiminde hassas kontrol sağlayarak, belirli membran kompozisyonuna ve enkapsülasyon kapasitesine sahip dev tek katmanlı veziküllerin (GUV'lar)le tekrarlanabilir şekilde üretilmesini destekler. Bu yetenek, hücresel sistemleri modellemek ve biyoaktif bileşikleri test etmek için ayarlanabilir bir platform sunarak sentetik biyoloji ve ilaç iletimi araştırmalarındaki temel bir sorunu çözmektedir. Bu yöntem, membran bağımlı süreçlerin sistematik olarak incelenmesine olanak tanıyarak, erken aşama hedef doğrulamadaki öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kontrollü membran asimetrisi ve transmembran protein entegrasyonu yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yolak açıklığa kavuşturmak için tekrarlanabilir vezikül sistemleri oluşturarak fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Öngörücü Değer: Lipid-protein etkileşimleri ve enkapsülasyon verimliliği hakkında kantitatif veriler sağlayarak portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Ayarlanabilir boyutta ve iç içeriğe sahip mono-dispers veziküller üreterek, aşağı akış iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Vezikül oluşumunu kontrol eden hassas jetleme parametreleri aracılığıyla analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sorunlarını çözer.
- Tarama Hazırlığı: Birden fazla koşulda güvenilir bileşik değerlendirmesi için platformun ölçeklenebilirliğini ve yeniden kullanılabilirliğini vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Fizyolojik benzerlikteki osmolarite çözeltilerinin kullanımı ve vezikül izleme için floresan takibi aracılığıyla hastalıkla olan ilişkinin tartışılması.
- Preklinik Uyum: Stabilite ve salım çalışmaları için terapötik adayların enkapsülasyonuna imkan tanıyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliğin açıklanması.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Vezikül stabilitesi ve çapa bağlı performans hakkında ölçülebilir çıktılar sağlayarak karar verme süreçlerinin desteklenmesi.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle kontrollü membran ortamları ve enkapsüle bileşik iletimi gerektiren assay'lerde, erken hipotez testlerinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre edilir.
- Keşif Biyolojisi: Lipid bileşiminin ve transmembran protein entegrasyonunun sistematik varyasyonuna olanak tanıyarak yol bağımlılıklarını netleştirme yoluyla yöntemin hipotez testlerini nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Tutarlı bileşik maruziyeti ve tekrarlanabilir okumalar sağlayan mono-dispers veziküllerin oluşturulmasıyla analiz hazırlığını tanımlar.
- Analitik: Ekiplerin deneysel koşulları karşılaştırmasına yardımcı olan vezikül boyutu, oluşum hızı ve enkapsülasyon verimliliği gibi nicel ölçümleri vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Stabilite testleri ve salınım profilleme için ilaçların veya biyomoleküllerin enkapsülasyonuna olanak tanıyarak yöntemi preklinik süreklilikle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi, tek kullanımlık bir teknikten ziyade, sentetik vezikül platformları gerektiren birden fazla projeye uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçevelendirir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörücü güven, hedef doğrulaması, membranla ilgili mekanizmalardaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Yüksek kapasiteli uygulamalar için vezikül üretiminin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Teslimat mekanizmalarının erken aşamada riskten arındırılması yoluyla daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç aşama biyolojik riski.
- Portföy Etkisi: Vezikül performans verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Hazne montajı ve çift katman oluşumu için mikroakışkanlar, lipid işlemleri ve mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Piezo-tetiklemeli inkjet cihazları, yüksek hızlı kameralar ve vakumlu kurutma sistemleri dahil olmak üzere enstrümantasyona bağlıdır.
- Lipid çözeltilerinin, püskürtme parametrelerinin ve hazne hizalama prosedürlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Model sistemler genelinde farklı lipid türleri, transmembran proteinler ve enkapsülasyon ajanları için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Kurulum sırasında çift katman instabilitesi ve püskürtme sırasında çevresel titreşimlere karşı hassasiyet gibi pratik sınırlamaları kapsar.
