Name: Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Öğrenin, yetim G proteinine birleştirilmiş alıcılar için floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyi yöntemini. HEK293T hücrelerinde geçici transfeksiyon kullanarak ligand aktivasyonunu hızlıca tarayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Araştırma Vakfı Flanders (FWO-Vlaanderen, Belçika, G.0601.11) ve KU Leuven Araştırma Vakfı GOA/11/002 kabul. FWO-Vlaanderen bir burs IB, TJ ve LT yarar.

Not: hücreler de dahil olduğu tüm işlemler, bir laminar akış içinde çalışarak, steril bir ortamda yapılmalıdır. HEK293T Hücre Hattı 1. Bakım <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de bir T-75 balonuna HEK293T hücreleri büyütün. </li><li> Geçiş% 80 bir birleşme elde edilir hücreler. Not: Bu, normal olarak 3-4 gün sürer. Sürekli kültür içinde hücreler, tarama için 20-25 kullanılabilir pasajlar sağlar. <ol><li> Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür, PBS-tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) olmaksızın Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) koyun ve büyüme ortamında (500 ml (500 ml PBS, 10 ml tripsin-EDTA çözeltisi ve 4.5 ml% 4 EDTA ile takviye edilmiş) Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta - yüksek glukoz [DMEM] önceden oda sıcaklığında,% 10 cenin sığır serumu [FBS] ve 1 mM penisilin-streptomisin [PS]) yarım saat ile takviye edilmiştir. </li><li> Kaldırmakhücrelerden eski büyüme ortamı. 3 ml PBS ile ölü hücreleri durulayın ve tekrar PBS kaldırmak. </li><li> , 3 ml PBS-tripsin-EDTA ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edilir ve çözelti Not çıkarın: Hücrelerin morfolojisi değişecektir yıldız şeklinde küre-şekilli. </li><li> Hafifçe vurmak suretiyle şişenin tabanından hücreleri gevşetin ve taze büyüme ortamına 10 ml alt birkaç kez durulama ile hücreleri toplamak. </li><li> 14 ml yeni büyüme ortamı içeren, ve bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe yeni bir T-75 balon içine Aktarım hücre kültürünün 1 mi. </li></ol></li></ol> HEK293T Hücreler 2. Geçici transfeksiyonu <ol><li> 3 gün gerçek kalsiyum mobilizasyon analizden önce bir T-75 balonuna HEK293T hücreler büyümek gerçekleşir. Emin, üç T-75 balonları, reseptör yapısı, boş bir ifade vektörü, negatif kontrol ve o ile transfeksiyonu için bir ile transfeksiyonu için kullanmak için emin oluntransfeksiyon kontrolü için ne. Not: Aşama 1.2 &#39;de tarif edildiği gibi hücre pasajı gerçekleştirilir. Birden 96-kuyu plakalar elenecek varsa, T-150 matara (adımlarla 1.2.5, 2.3, 3.1.3 ve 3.1.4 bunu yapmak, çift listelenen tüm miktarlarda) hücrelerin daha yüksek bir verim elde etmek için kullanılabilir . </li><li> Hücre kültürleri 50-70% izdiham varana kadar 20-24 saat boyunca bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de şişeler inkübe edin. </li><li> Ilgi ve Gα 16 yapının GPCR, boş vektör ile Gα 16 yapısı ile ikinci balon ve transfeksiyon kontrol ve Gα 16 yapısı ile üçüncü kodlayan ekspresyon vektörü ile hücrelerinin Co-transfect bir popülasyon. Not: Bu protokol, Drosophila SNPF reseptörünün bir pcDNA3.1 memeli sentezleme vektöründe 13 klonlandı. Jetprime transfeksiyon gerçekleştirmek için kullanıldı, ancak diğer transfeksiyon reaktifler de kullanılabilir. <ol><li> At ekle7.8 ug DNA (3.9 ug reseptör yapısı, ya da boş bir vektör, ve 3.9 ug Gα ekspresyon yapısı, 16), bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve Jetprime tampon 500 ul ekleyin oplam. Tüp vorteks ile iyice karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün. </li><li> Jetprime reaktif, girdap 37.5 ul ekleyin ve 14,000 x g&#39;de 1 dakika aşağı doğru döndürün. Oda sıcaklığında, transfeksiyon karışımı 10 dakika inkübe edin. </li><li> Hücre kültür ortamına transfeksiyon karışımı damla damla ilave edin ve kültür şişenin duvarları ile temas kaçınarak ortam haline doğrudan pipetle emin olun. 20-24 saat boyunca bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de şişeler inkübe edin. </li></ol></li></ol> 3.. Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi <ol><li> Transfekte edilmiş hücreleri toplamak ve 96 oyuklu siyah duvarlı, şeffaf dipli plakalar içerisinde bunları tohum. <ol><li> PBS, PBS-tripsin-EDTA ile DMEM transfer sıvısının,% 10 diyaliz edilmiş FBS ile takviye edilmiş (500 ml DMEM yerleştirinve önceden% 1 PS), oda sıcaklığında yarım saat. </li><li> Coat 96 oyuklu (plaka başına 5.85 ml PBS ve 150 ul fibronektin [% 0.1]) oyuk başına fibronektin (0.0025%) içeren PBS içinde 60 ul, siyah duvarlı, şeffaf tabanlı plakalar. Üzerinde kapak ile 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kuyulardan çözüm çıkarın ve oda sıcaklığında kapağındaki olmadan, 1 saat boyunca tekrar inkübe edin. Alternatif olarak, bu daha iyi bir hücre eklenmesi için önceden kaplanmış plakalar kullanmak mümkündür. </li><li> Hücrelerden eski büyüme ortamı çıkarmak ve 3 ml PBS ile ölü hücreleri durulayın ve PBS kaldırmak. </li><li> , 3 ml PBS-Tripsin-EDTA ekleyin, 1 dakika boyunca inkübe edilir, daha sonra solüsyon çıkarın. Not: Bu küre şeklindeki ikinci yıldız şeklinde hücreler değişikliklerin morfolojisi. </li><li> Hafifçe vurmak suretiyle şişenin tabanından hücreleri gevşetip DMEM transfer ortamının 10 ml ile bir kaç kez durulanarak toplarlar. Bir 50 ml Falcon tüpü içine hücreleri aktarın. </li><li> Sayısıml başına hücre sayısı (burada NucleoCounter ile yapılan, ancak bir Bürker en odası kabul edilebilir). Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, hücre kültürünün 100 ul ekleyin. 100 ul lizis tamponu ekleyin ve tüp dokunarak karıştırın. 100 ul stabilize tamponunu ekleyin ve dokunarak karıştırın. </li><li> Hücre süspansiyonu ile bir NucleoCassette doldurun ve sayaç ile hücreleri sayın. Liziz ekleme ve aşama 3.1.6 tamponu stabilize zaman hücreler, üç faktör ile seyreltilmiş olarak üçe hücre sayısını çarpın. </li><li> 600.000 hücre / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar hücrelere seyreltin ve / oyuk başına 90,000 hücre, bir hücre yoğunluğu elde etmek üzere kaplanmış levhaları üzerinde göz başına 150 ul hücre tohum. Hava kabarcıklarını önlemek ve bir bitişik hücre katmanı elde etmek için eşit hücreleri yaymak için plaka dokunun. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Floresan boya ile hücreleri yükleyin ve co hazırlamakmpound plakası. <ol><li> Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) Hazırlama / HEPES / Ca 2 + / sığır serum albümini (BSA) tampon maddesi (damıtılmış su içinde 1 M CaCI2 [dH 2 O] - oda sıcaklığında saklayın) 165 ul CaCl2 stok solüsyonu ekleyin 500 ul HEPES stok çözeltisi (1 M HEPES dH 2 O, pH 7.4 &#39;de - oda sıcaklığında saklayın) ve 50 ml HBSS 0.05 g BSA. Yağ asitleri, ilgi konusu reseptörün kalsiyum sinyal bozucu, reseptörleri aktive gibi bu yağ asitsiz BSA, kalsiyum tahlilleri için kullanılır edin. </li><li> Probenesid çözeltisi (100 x, 250 mM) hazırlanması: 5 ml NaOH (1 M) içerisinde 0.71 g probenesit çözülür ve 50 ul HEPES stok çözeltisi ve HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA tampon içinde 5 ml - her zaman taze solüsyon hazırlanır. Not: Probenesid dolayısıyla floresan sinyalini azaltır sitoplazmadan Fluo-4 bağdaki inorganik anyon taşıyıcılarını inhibe eder. Bu boya yükleme gerçekleştirmek için tavsiye edilirprobenesid varlığı ve yokluğu probenesid da agonist aracılı sinyal azaltabilir gibi inorganik anyon taşıyıcıları, inceleme altındaki belirli hücre hatlarında potansiyel bir sorun mevcut olup olmadığını belirlemek için. </li><li> Yıkama tamponu hazırlayın: 50 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA tampon 500 ul probenesid çözeltisi eklemek pH&#39;ı 7.4 &#39;e ayarlayın ve tampon çözeltisi süzün. Her zaman taze tamponu hazırlamak ve plaka gereklidir başına 50 ml tampon. </li><li> % 10 pluronik asit çözeltisi hazırlayın: 50 ul DMSO ile 50 ul karıştırın pluronik asit (dimetil-sülfoksit içinde 20% w / v [DMSO]) - kristalizasyon oluşursa, ısı 37 ° C&#39;ye kadar ve her zaman taze solüsyon hazırlanır. </li><li> Fluo-04:00 çözeltisi (1 mM) hazırlayın: tamamen eriyene kadar 50 ug Fluo-4:00 ve vorteks içeren bir şişeye, 44 ul% 10 pluronik asit solüsyonu ekleyin. Floroforun beyazlatma önlemek için ışığa maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Yükleme tamponu hazırlayın: add 8.8 ml DMEM katkılanan10 mM HEPES ve Fluo-04:00 çözeltisi (44 ul) ve vorteks 2.5 mM probenesid (pH 7.4) ile d. Her zaman taze tampon kullanın. </li><li> Hücrelerden ortam atılır, oyuk başına 200 ul PBS ile hücrelerin yıkayın ve PBS çıkarın. </li><li> Oyuk başına 55 ul yükleme tamponu ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Işığa plakanın maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile plaka sarın. </li><li> Bu hücre sentezleme sistemi için zararlı (örn., asetonitril) çözücü maddeler içinde çözülür ise, ekranın önce bileşiklerin kuru olduğundan emin olun. </li><li> Silikon 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, yıkama tamponu içinde peptidleri çözünürleştirilir. Bir konsantrasyon-tepki analizi gerçekleştirmek için bir ligandın EC50 değerini belirlemek için bir seyreltme serisi hazırlanır. Bileşik levhanın (V-şekilli 96 oyuklu plakalar) çok iyi karşılık gelen ligandın 70 ul eklenir ve her plaka üzerine pozitif (endojen agonisti) ve negatif kontroller (yıkama tamponu) içerir. Değil<html> e: bir bileşik, yıkama tamponu içinde çözünebilir değilse, bu tür bir su veya yağ ve diğer suda çözülmeyen maddelerin (örneğin, Kolliphor EL) emülsiyon ve çözeltiler gibi çözündürülmesi, araştırma altındaki hücreler için zararlı olmayan diğer çözücüler, deneyin . </li><li> Bütün numuneler üç kopya halinde ölçün. Bileşik plakasından bir ligandın 50 ul deney süresince, hücre levhasının 100 ul yıkama tamponu ile bir kuyuya aktarılır göz önünde bulundurun, yani arzu edilen nihai konsantrasyon 3 kat da bileşikleri hazırlamak. </li><li> Hücre plakasından yükleme tamponu atılır ve her bir oyuğa 100 ul yıkama tamponu ilave edin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkalayın plaka ve ışığa maruz kalmasını engeller. </li><li> Hücre plakasından yıkama tamponu atılır ve her bir oyuğa 100 ul yeni yıkama tamponu ilave edin. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca hücre plakası, bileşik plaka ve bir uç raf (96-çukurlu, istasyon cihazı pipet uçları) inkübe </li></ol></li></ol>İstasyon Cihaz üzerinde başlığı &quot;&gt; 4. Deneyi <ol><li> Oluşturun ve yazılım ile istenilen protokol dosyasını yüklemek ve okuma odası için sıcaklık kontrol ünitesi etkinleştirin. Burada, 525 nm&#39;de (tam bir 96 oyuklu plaka yaklaşık olarak 25 dakika sürer ölçüm) ardı ardına arasında 1.52 saniyelik bir aralık ile her seferinde bir satır 2 dakika boyunca 37 ° C&#39;de kalsiyum tepkileri ölçer. 488 nm Fluo-4 uyarılmasını ayarlamak ve 26 ul / sn belirlenen dağıtım hızı ve 135 ul bir pipet yüksekliği ile, hücre plakası, okuma başladıktan sonra 18 saniye için bileşik 50 ul bir toplam hacim aktarın. </li><li> Istasyon cihazın uygun çekmeceleri olan bir bileşiğin ve hücre plakası ve uç raf yerleştirin. </li><li> FLEX modunda gerçek ekran başlamadan önce, son nokta modunda aynı eksitasyon ve emisyon dalga boyunda, hücre levhasının tek bir okuma gerçekleştirin. Not: Bu ölçüm nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri verir ve biz arasındaki değişkenliği tespit edilmesine olanakLevhanın LLS. 20,000 ile 40,000 arasında değerler olarak kabul edilebilir olarak kabul edilmektedir. </li><li> Tahlil başlatın ve yazılımı ile verileri analiz. </li></ol>

<ol><li>Bockaert, J., Pin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tinkering+of+G+protein-coupled+receptors+an+evolutionary+success%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success.</a> EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).</li>
<li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).</li>
<li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug discovery a historical perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).</li>
<li>Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors+and+signaling+networks+emerging+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).</li>
<li>Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+physiology+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide physiology in insects.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).</li>
<li>Van Hiel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+receptors+as+possible+targets+for+development+of+insect+pest+control+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).</li>
<li>Tang, X. L., Wang, Y., Li, D. L., Luo, J., Liu, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+biological+functions+and+potential+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).</li>
<li>Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schiöth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+deorphanizations%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor deorphanizations.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).</li>
<li>Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postgenomic+characterization+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors.</a> Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).</li>
<li>Brough, S. J., Shah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aequorin+for+G+protein-coupled+receptor+hit+identification+and+compound+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling.</a> Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).</li>
<li>Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2%2B-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deorphanizing+G+protein-coupled+receptors+by+a+calcium+mobilization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay.</a> Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).</li>
<li>Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+short+neuropeptide+F+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster.</a> Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).</li>
<li>Lu, H. -L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+%28Aedes+aegypti%29+and+tick+%28Rhipicephalus+microplus%29+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> J. Vis. Exp. (50), e2732(2011).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+neuropeptide+F-like+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster.</a> Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).</li>
<li>Nässel, D. R., Wegener, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+short+and+long+neuropeptide+F+signaling+in+invertebrates+any+similarities+to+vertebrate+neuropeptide+Y+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling.</a> Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).</li>
<li>Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review+The+evolution+of+neuropeptide+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Pept%22%5BJournal%5D)">Mini-review The evolution of neuropeptide signaling.</a> Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).</li>
<li>Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%22%5BJournal%5D)">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview.</a> Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%E2%80%99-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs).</a> Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li>
<li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B115+and+G%CE%B116+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22CJ+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase.</a> CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li>
<li>Ral Conklin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyl-terminal+mutations+of+Gq%CE%B1+and+Gs%CE%B1+that+alter+the+fidelity+of+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Carboxyl-terminal mutations of Gqα and Gsα that alter the fidelity of receptor activation.</a> Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).</li>
<li>Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+G%CE%B116+the+optimal+tool+for+fishing+ligands+of+orphan+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Is Gα16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).</li>
<li>Robas, N. M., Fidock, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+orphan+G+protein-coupled+receptor+ligands+using+FLIPR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays.</a> Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).</li>
<li>Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., Gäde, G., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+studies+of+Drosophila+adipokinetic+hormone+%28AKH%29+by+a+cellular+expression+system+of+dipteran+AKH+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors.</a> Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).</li>
<li>Peeters, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+study+of+NLP-12+neuropeptide+signaling+in+free-living+and+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes.</a> Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil daha önce başarılı bir şekilde Mertens ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir Drosophila SNPF peptiderjik sinyalizasyon sistemi, fonksiyonel karakterizasyonu teyit etmek için uygulanmıştır. bir biyoışıldama tahlili ve Feng et al. Elektrofizyolojik deney 13,15 ile. Drome-SNPF-; fluo = 2.04 nM, Lumi = 51 nM: HEK293T hücrelerinde floresan deneyi ile elde edilen EC50 değerleri, yaklaşık CHO hücreleri (Drome-SNPF-1 içerisinde gerçekleştirilen biyoışıldama tahlili ile elde edilenden daha az bir 10-kat 2: fluo = 5.89 nM, Lumi = 42 nM; Drome-SNPF-3: fluo = 5.55 nM, Lumi = 31 nM; Drome-SNPF-4: fluo = 0.50 nM, Lumi = 75 nM). Bu varyasyonlar, kullanılan sentezleme sistemlerinden biri, belirli bir reseptörünün fonksiyonel ifadesi için daha uygun olabilir, ya da reseptörlerinin katlama c daha az verimli olduğu gerçeği de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere açıklanabilirertain hücre türleri. Genel olarak in vivo peptid-reseptör etkileşimi fizyolojik önemi destek, floresans ve biyoışıldama tahlili ile her iki reseptörü üzerinde test edildiği zaman, dört Drome-SNPF peptidlerin EC50 değerleri, nanomolar aralıkta bulunmaktadır. Drosophila SNPF sinyalizasyon sistemi normal deney düzeneğinde en transfeksiyon kontrolü için aktive ligand bilindiği için bir reseptör ile bir transfeksiyon kontrol olarak, burada sunulan ekranına dahil dikkat etmek gerekir. HEK293T hücreleri (PAR 1) ve negatif kontrol (yıkama tamponu) içinde bir endojen ligandı olan pozitif kontrol ekranında dahil edilmiştir. PAR 1&#39;in sonuçları hücreler, iyi durumda olduğunu göstermiştir. Negatif kontrol (yıkama tamponu) olan peptidler çözündürülür hangi orta inf olabilecek herhangi bir yabancı maddelerden arındırılmış olduğunu gösterir, bir flüoresan sinyal neden olmamıştırsonuçlarını luence. Karakterize edici özelliği, daha önce Drosophila SNPF sinyalizasyon sistemi, flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlilini açıklamak için kullanılmıştır. Bu amaç için, aktive edici ligandların konsantrasyonu hemen dizi test edilmiştir. Yetim reseptör bileşiklerinin yüzlerce içeren bir kütüphane test etmek için bir tarama tahlilinde aşırı ekspresyonuna getirilir, ancak, bu ligandlar (örn.., 10 ya da 1 uM) nispeten yüksek nihai konsantrasyonları ile, birinci ekranına karşılık tavsiye edilir. Bir aktive bileşiğin tespiti sonra, bu bileşiğin bir seyreltme serisi bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak için ve EC50 değerini belirlemek için taranabilir. Bir reseptörün aktive ligand belirlendikten sonra, hücre içi sinyal yolu ayrıca protokol uyarlanması ile araştırılabilir. Deney, yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirildi, ancak G eş zamanlı olarak transfekte olmayan ^ alınabilir5, 16 alt-birimi. Bir kalsiyum tepki ölçülür, bu demektir ki, alıcı hücre sentezleme sistemi bir endojen Gα q alt-birimi ile çiftler. Herhangi bir flüoresan sinyal bakıldığında, diğer ikinci haberciler (örn.., CAMP) konsantrasyonlarda değişiklikleri ölçmek için protokoller uygulanabilir. Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmaları da reseptör aktivasyonu için gerekli olan peptidin çekirdek dizisini tanımlamak için gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kesik sekanslar, yine de reseptörünü de aktive edebilmektedir peptidin en az bir amino asit dizisini belirlemek için değerlendirilir. Daha sonra, peptidler, sistematik olarak, her bir amino asit bir alanin kalıntısı ile ikame edilmiş olan test edilebilir. Reseptörü üzerinde sentetik alanin-ikame dizi test reseptör aktivasyonu 24,25 için amino asitlerin her birinin önemini belirlemek için izin verir. Sık kullanımının ve kanıtlanmış zorunlu kılmakta rağmenCacy, burada açıklanan tahlil ilgi belirli reseptörleri için en iyi sonuçları elde etmek için bazı uyarlamalar gerekebilir vurgulanmalıdır. Gα 16 alt-birimi çoğu GPCRs bağlanan bir avantajı vardır, ama aynı zamanda reseptörleri üzerinde dominant-negatif bir etkiye sahip olabileceğini endojen Gα q 22 ile bir çift. Bu durumda, bu yeni kalsiyum tahlilinde en iyi duruma getirilmesi sırasında G proteinlerinin farklı kombinasyonları test etmek ve Gα 16 yokluğunda veya varlığında, Gα q-bağlanmış reseptörler için sonuçları karşılaştırmak için yararlı olabilir. Reseptör aktivasyonunu tespit etmek için etkileşim G protein bağımsız alternatif tahliller, aynı zamanda, GFP-etiketli arrestin olan translokasyon, veya zar potansiyeli (örneğin,., FLIPR zar potansiyeli Assay Kit) değişimlerin tespiti gibi, gerçekleştirilebilir. Fluo-4:00, burada diğer kalsiyum duyarlı fluorophores geniş bir dizi, kendi spektral ve Chemic her yanında;al özellikleri mevcuttur. En uygun florofor GPCR, hücre tipine ve mevcut plaka okuyucusu göre seçilebilir, ancak deneysel doğrulama gereklidir. Transfekte edilmiş DNA ve her reseptör-transfeksiyon reaktifi-hücre hattı kombinasyonu için belirlenecek DNA / transfeksiyon ayıracı oranı ihtiyacı miktarları. Son olarak, sürekli bir kültür içinde hücreleri sadece 20-25 kullanılabilir geçitleri tarama tahlilleri yapmak için izin akılda tutulmalıdır.

G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) bütün hücre yüzeyi proteinleri arasında en büyük ve en çeşitli ailelerin birini oluşturmaktadır. Omurgalılarda Bunların varlığı, omurgasızlar, bitkiler, mayalar, ve balçık kalıp yanı sıra, Protozoa ve erken diploblastic in Hayvanların GPCR&#39;ler sinyal transdüksiyonu 1 ile bağlantılı en eski moleküller arasında olduğunu gösterir. Onların doğal aktifleştiren ligandlar peptidler, biyojenik aminler, koku maddeleri, glikoproteinler ve fotonlar 2 dahil olmak üzere dış uyaranların geniş bir çeşitlilik içermektedir. Bu nedenle, bu reseptör-ligand sinyalleşme sistemlerinin fizyolojik süreçlerin bir çok çeşitli katılmaktadırlar. Geniş spektrumlu fonksiyonel insan hastalıklarının geniş bir kapak terapötik ilaçların geliştirilmesi için onları ideal uygun hale getirir. Mevcut ilaç hedefleri yaklaşık% 50-60 GPCRs 3,4 ile temsil edilmektedir. Farmasötik endüstrisinde büyük önem taşımaktadır Bunun yanı sıra, bir GPCR&#39;ler geliştirilmesi için spot da vardırGenel olarak türe özgü insektisit 5,6 ve pestisitlerin yeni nesil. Birçok GPCRs doğal ligandları hala belirsiz olduğu için, yetim GPCRs olarak sınıflandırılır. Bu reseptörlerin deorphanization organizmalar kendi fizyolojik rollerinin anlaşılmasını sağlayacak ve yeni ilaç uygulamaları 7 için varsayılan hedefler ortaya çıkarmak olabilir. Genomik döneminden itibaren, ters farmakoloji strateji geniş GPCRs 8&#39;in deorphanization için uygulanır. Bu yaklaşım, bir yetim reseptör &quot;balık out &#39;için bir&#39; kanca &#39;, bir biyolojik ekstrakt ya da sentetik bileşikler bir kütüphane ile aktive ligand olarak kullanıldığı anlamına gelir. İlgilenilen GPCR nedenle klonlandı ve daha sonra, bir hücre sentezleme sistemi içinde transfekte edilir. En yaygın olarak kullanılan yöntemlerde, reseptör aktivasyonu ikinci haberci moleküllerin konsantrasyonunda değişiklikler ölçülerek belirlenir 9 </sup&gt;. Ana reseptör tarama tahlilleri (örneğin, aequorin) 10 ya da floresan kalsiyum göstergeler (örneğin, Fluo-4) 11 kalsiyum duyarlı biyolojik olarak ışık veren proteinler dayanır. Reseptör-eksprese eden hücreler önce ligand tarama için bir fluoresan kalsiyum göstergesi ile yüklenmiş olduğu floresan bazlı deneyler, bunlar nedeniyle kullanım, kısa zaman okuma kolaylığı için, yüksek ölçüde nüfus ayırımına imkan olanaklar ve tarama esnekliğe sahip tek bir plaka üzerinde birden fazla 12 olan öksüz reseptörlerdir. Burada, flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil iyice açıklanmıştır ve Drosophila melanogaster kısa nöropeptid F (SNPF) reseptörünün deorphanization işlemi ile görüntülenmiştir. Bu neuropeptidergic sinyalizasyon sistemi, ilk Mertens ve arkadaşları tarafından karakterize edildi. 2002 Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri içinde gerçekleştirilen bir kalsiyum biyoışıldama tahlili ile 1314 ve Feng et al. 2003 kullanarak bir elektrofizyolojik deneyde ile Xenopus oositlerde 15. SNPF sinyalizasyon sisteminin varlığı, besleme, büyüme, stres reaksiyonları, hareket ve sirkadyan ritim 16 düzenlenmesi işlemleri de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede karıştığı böcek olarak, bir filum ile sınırlı görünmektedir. Böceklerde neuropeptidergic sinyalizasyon sistemleri üzerinde araştırma, ancak insektisit gelişimi için yeni hedeflere yol olmayabilir, ama bunların işleyişi bilgisi aynı zamanda birçok sinyal sistemleri genellikle iyi evrim 17 boyunca muhafaza edilmiştir diğer organizmalar karşı çıkarım olabilir. Son on yılda büyük ilerleme böcek nöropeptid GPCRs deorphanization sürecinde yapılmıştır. Bu çabalara rağmen, reseptörlerin sadece küçük sayıda komşu bir ligand eşleştirilir ve sekans bilgileri yükler için olanYeni öksüz GPCR&#39;ler nedeniyle genomik 18 patlama için kullanılabilir hale gelmiştir. Yaygın olarak uygulanan bir tekniktir 9,18 olduğu kanıtlanmıştır floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahliliyle gibi orta / yüksek verimli tarama yaklaşımların kullanılabilirliği, bu nedenle ölçülemez. Burada tarif edildiği gibi floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil, insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücre hattı içinde yapılır ve reseptör aktivasyonu üzerine hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri belirlemek için bir flüoresan probun kullanır. Yüksek ifade ve reseptörün için düzeyde olmasını sağlamak için bir Kozak konsensüs sekansı, 19, daha sonra bir sentezleme vektörüne (memeli hücre çizgileri için, örneğin, pcDNA vektör serileri) klonlanır reseptör-kodlama dizisinin, 5 &#39;ucuna eklenir. Bu sekans bilgileri göre yetim GPCR endojen G-protein bağlanmasını tahmin etmek zor olduğutek başına, reseptör aktivasyonundan sonra modüle edilir, ikinci haberci molekülleri (örn., kalsiyum veya cAMP) genellikle önce ligand tanımlama bilinmemektedir. Bu sorunu aşmak için, çoğu GPCRs ile etkileşim ve G q ailesi (örneğin, kemirgen Gα 15 veya [Burada kullanılan] insan Gα 16) veya flimerik G proteinleri (örneğin, Gα qi5) arasında gelenle G proteinleri kalsiyum salgılanmasını can 20,21,22 birlikte ifade edilebilir. Kendi reseptörüne ligand bağlanması üzerine, GPCR özel hücre içi yolların aktivasyonuna yol açan yapısal bir değişiklik olur. Gα 16 alt ünitesine istirahat durumunda bağlı guanosin difosfat (GDP) molekül, bir guanosin trifosfat (GTP) molekülü ile değiştirilecektir. Bu, 16 ve Gα Gβγ alt birim içinde heterotrimeric G proteinin ayrışma kışkırtır. Gα 16 alt-birimi, fosfolipaz C ve aktive# 946; Da zara bağlı diaçilgliserol sonuçlanan fosfatidilinositol bifosfat (PIP 2) (DAG) ile inositol trifosfat (IP 3) hidroliz (PLCβ). IP 3 sitoplazma boyunca yayılmış ve sitoplazma içine kalsiyum salınmasını uyarmaktadır endoplazmik retikulum zarında mevcut IP 3 bağımlı kalsiyum kanallarını aktive edecektir. Reseptör aktivasyonu üzerine kalsiyum salma saniye içinde oluşur ve Fluo-4 asetoksimetil (AM) 11 gibi, kalsiyuma duyarlı boya ile tarama deneyinde önce hücrelerin yüklenmesi ile tespit edilebilir. AM ester grubu, hücre zarı geçmeye flüorofor sağlayan ve bir kez hücre içi sitoplazmik esterazlar tarafından kesilir. Sonuç olarak, floresan boya eden eksi yükler tarafından hücre dışında difüzyon ve kalsiyum iyonları ile etkileşime izin engelleyen, maskesiz edilir. Flüoresan sinyal of Fluo-4 sadece nanomolar aralığında kalsiyum konsantrasyonlarını ihtiva eden bir dinlenme koşulları altında hücrelerde ihmal edilebilir düzeydedir. Kalsiyum reseptörü aktivasyon üzerine bırakıldığında, ancak, sinyal burada geniş bir sinyal-gürültü oranı sağlanması, daha bir 100-kat konsantrasyon-bağımlı artırabilir. Fluo-4, aynı zamanda geniş bir hücre aralığı içinde fizyolojik olarak ilgili kalsiyum değişiklikleri ölçmek için uygundur, 345 nM&#39;lik bir Kd (kalsiyum) yaklaşık [kalsiyum] raporlama için geniş bir dinamik aralığı sergiler. Fluo-4 uyarılma 488 nm&#39;de meydana gelmektedir ve floresan emisyon 525 nm, 11 ölçülür. Flüoresan görüntüleme plaka okuyucu (FLIPR) 23, NovoStar veya FlexStation (istasyon cihazı) 12 gibi Fluorimeters her iyi eş zamanlı bileşik ilave edilmesini ve reseptör aktivasyonu üzerine Fluo-4 sinyalin algılanmasına izin orta / yüksek verimli sistemlerdir bir deney plakasında. Burada anlatılan kalsiyum mobilizasyon deney istasyonunda dayanırCihaz, 96 oyuklu mikro-plaka sistemi. SoftMax Pro yazılımı (software) veri analizi için hem de istasyon cihazı çalıştırmak için kullanılır. Program hemen 96 kuyulu formatta grafik olarak sonuçları görüntüler. Çoklu kuyular aynı grafik üzerinde bu kuyuların sonucunu karşılaştırmak için aynı anda seçilebilir. Her sütunda kuyu nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri aynı anda kuyulara bileşiklerinin ilave edilmesinden önce başlayan ve reseptör aktivasyonu sonra flüoresan sinyal ölçümü sonra devam eden, iki dakikalık bir süre boyunca ölçülür. Bir aktive bileşik floresan sinyalinin hızlı bir artış ile sonuçlanan, hücrelere ilave kadar Tipik olarak bir agonist eğrinin eğilim taban aynı hizadadır. Tepe yükseklik çukurdaki nihai agonist konsantrasyonu ile ilişkilidir. Tepe sonra flüoresan sinyal yavaşça taban seviyesine doğru düşer. BFÜ ölçümler can ligandın EC50 değeri (yarı maksimal etkin konsantrasyonu) belirlemek için konsantrasyon-yanıt eğrileri dönüştürülebilir. Genel olarak, en az üç bağımsız ekranlar, bir dizi konsantrasyon üç kopyaları da dahil olmak üzere her biri, güvenilir bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak için gerçekleştirilmelidir. Bu deney tasarımında çok sayıda pozitif ve negatif kontroller için tavsiye edilir. Her şeyden önce, bir transfeksiyon kontrolü, bilinen bir ligand ile bir reseptör uygulanmasında, yani test edilmelidir. Bu transfeksiyon ajanı işlevsel olup olmadığını doğrulamak sağlar. Hücre hattı ve bir negatif kontrol (örn., yıkama tamponu) içinde bir reseptör için endojen bir agonisti ile bir kontrol deneyi de dahil edilmesi, hücrelerin sağlık ve yaşamı sürdürme kabiliyetini izlemek için ve yıkama tamponu ile kirlenmiş ihtimalini dışlamak için tavsiye edilir Bir oto-fluore ortaya bir faktörkoku yanıt. Sık kullanılan agonistler asetilkolin reseptörünü aktive eden bir PAR 1 selektif agonisti ya da karbakol gibi davranır, proteaz tarafından aktive edilen reseptör-1 (PAR 1) &#39;den elde edilen bir peptid bulunmaktadır. Boş bir sentezleme vektörü ile transfekte edilmiş hücreler, aktif bileşikler, hücrenin endojen reseptörleri ile etkileştikleri dışlamak için test edilmelidir. Aşağıdaki protokolde tarif edilen çeşitli parametrelerin optimizasyonu, farklı sinyal verme sistemleri için gerekli olabilir. Tam flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyinin şematik bir şekil Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahliliyle Şekil 1.. Genel şeması. Otomatik sıvı taşıma ve eşzamanlı floresan ölçümler istasyonu ile yapılıryazılım tarafından yönlendirilen cihaz mikroplaka okuyucu. Hücre plaka için bir, levha bileşik ve ucu raf: istasyon cihaz üç çekmece içerir. Yap-pipet transfer bileşik plakanın bir sütundan, hücre levhasının (aşama 1) karşılık gelen sütun bileşikler yer alır. , Hücre levhasının her biri de, ilgi konusu GPCR ve karışık Gα 16 alt-birimi ile birlikte-transfekte edilmiş hücrelerde HEK293T bir tek tabaka içerir. Bir bileşik reseptörünü aktive olduğunda, Gα 16 GDP-bağlı GTP ile değiştirilir. Gα 16 alt-birimi, daha sonra Gβγ karmaşık ayrışmaktadır ve sırayla fosfatidilinositol bifosfat (PIP 2) diaçilgliserol (DAG) ile inositol trifosfat (IP 3) sonuçlanan hidrolize fosfolipaz Cö (PLCβ) aktive eder. IP 3 kalsiyum int salınımını başlatma, endoplazmik retikulum zarında mevcut IP 3 bağımlı kalsiyum kanallarını aktive edersitoplazma o. Fluo-4 (hücreler ek bileşik önce yüklenir hangi) ile kalsiyum etkileşimi bir flüoresan sinyal (aşama 2) ile sonuçlanır. Yazılım nispi floresan ünitesi, zamanın bir fonksiyonu olarak (RFU) değerleri olarak sonuçlarını göstermektedir, ve pik yükseklikleri konsantrasyona bağlı bir şekilde ligand konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bu veriler daha sonra, bir ligand-reseptör çifti (aşama 3) ve EC50 değerini belirlemek için bir konsantrasyon-tepki eğrisi dönüştürülebilir.

<table><tbody><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi (%0.25)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA)</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>195173</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Orta - yüksek glikozu&nbsp; (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Polyplus transfeksiyon</td><td>114-01</td><td>FuGENE HD Transfeksiyon Reaktifi (Promega); Liporektamin LTX & Artı Reaktif (Yaşam teknolojileri)</td></tr><tr><td>Diyaliz Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plazmasından fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif A100, Lizis tamponu</td><td>Chemometec</td><td>910-0003</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif B, Stabilize edici tampon</td><td>Chemometec</td><td>910-0002</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>HBSS tamponu: Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td> <td>Vel</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Pluronik asit</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Kalsiyum Yeşili-1, ... (Canlandırıcı)</td></tr><tr><td>TPP doku kültürü şişeleri (T-75 ve T-150)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503 ve Z707554</td><td></td></tr><tr><td>FlexStation cihazı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Florometrik Görüntüleme Plakası Okuyucu) (Moleküler Cihazlar)</td></tr><tr><td>Şeffaf tabanlı siyah duvarlı polistiren plakalar (96 kuyu)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Corning 96 kuyulu düz şeffaf tabanlı siyah polistiren poli-D-lizin kaplı mikroplakalar</td></tr><tr><td>NucleoCassette</td><td>Chemometec</td><td>941-0001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-100</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri, silikonlu</td><td>BioCision</td><td>BCS-2470</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren V-şekilli 96 oyuklu plakalar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu, FlexStation pipet uçları</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>9000-0912</td><td></td></tr><tr><td>Soft Max Pro yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyi g proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

20 yılı aşkın için, ters farmakoloji yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) &#39;in aktive ligandlarını bulmak için, önde gelen bir strateji olmuştur. Bir ters farmakoloji tahlilin başlangıcı bir hücre sentezleme sistemi içinde ilgi konusu bir GPCR klonlanması ve sonraki transfeksiyonudur. Heterolog ifade alıcısı daha sonra, reseptör-ligand aktive edici (ler) tanımlamak için aday ligand bileşiği kütüphanesi ile meydan. Reseptör aktivasyonu, cAMP gibi bir kalsiyum ya da ikinci haberci haberci moleküllerin konsantrasyonunda değişiklikler ölçülerek değerlendirilebilir. Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyonu tahlil sıklıkla kullanılan bir orta throughput farmakoloji tahlili tersidir. Yetim GPCR geçici olarak insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücreleri olarak ifade edilmiştir ve bir karışık Gα 16 konstrukt ile birlikte transfekte edilmiş olmasıdır. Ligand bağlama sonra, 16 alt-biriminin Gα aktivasyonu kalsiyum f salınmasını uyarmaktadırendoplazmik retikulum rom. Önceki ligand tarama için, reseptör-eksprese eden hücreler, bir fluoresan kalsiyum göstergesi, Fluo-4 asetoksimetil ile yüklenir. Fluo-4 ve flüoresan sinyal istirahat durumunda hücrelerinde ihmal edilebilir, ancak reseptör aktivasyonuna sonra serbest kalsiyum iyonları ile etkileşimi üzerine bir 100-kat daha güçlendirilmiş olabilir. Tarif edilen teknik, genetik malzeme ile transfekte konakçı hücre genomuna entegre edildiği stabil olarak transfekte edilmiş hücre çizgilerinin zaman alıcı kuruluş gerektirmez. Bunun yerine, geçici transfeksiyon, hedef genin ekspresyonunu geçici olarak üreten, tarama tahlili gerçekleştirmek için yeterlidir. Kurulum bileşiklerin yüzlerce orta veri akışı taramasını sağlar. En GPCRs çiftler ne olursa olsun, endojen Sett nativ sinyal yolunun, hücre içi sinyal yolu kalsiyumun serbest yönlendirildiği sağlar karışık Gα 16, ko-transfeksiyonrinde. HEK293T hücrelerin kullanımı kolay olan ve reseptör deorphanization deneylerde yıllar boyunca etkinliğini kanıtlamıştır. Bununla birlikte, özel reseptör tahlilinin optimizasyonu gerekli kalabilir.

50 uM 0.001 nM arasında değişen konsantrasyon serisi dört Drosophila SNPF peptidler (: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide Drome-SNPF-1) için test edilmiştir geçici Drosophila SNPF reseptörü ve karışık Gα 16 altünitesini ifade HEK293T hücreleri üzerinde. GPCR 0.1 nM kadar son konsantrasyonlarda dört peptidler tarafından etkin hale getirilemez ve reseptör aktivasyonu konsantrasyona bağlı oldu. Şekil 2, bu Drome-SNPF-1 konsantrasyon serisi üç kopyaları birine karşılık gelen grafikler tasvir etmektedir. (- 1 uM PAR 1) güçlü bir aktivasyonu ortaya endojen proteaz tarafından aktive edilen (± 30,000 RFU), yüksek floresan sinyaline yol açan, reseptörü-1, negatif kontrol (yıkama tamponu) pozitif kontrol ederken, bir flüoresan sinyal uyarmadı. Not edilmelidir ki bir sapmaTipik eğri anormallikler gösterebilir. Örneğin, taban çizgisine geri dönmeden eğri sürekli bir artış, örneğin kalsiyum ionofor varlığında, ya da kalsiyum sızıntı neden olan bir kesintiye lipid çift katmanı gibi reseptör olmayan aracılı sinyalleri ile ilişkili olabilir. Yazılım aktivasyon yüzdesi veya diğerleri arasında farklı konsantrasyonları standart hataları belirlemek için formüller giren sağlar. Şekil 3&#39;te dört Drome-SNPF peptidleri için gösterildiği gibi, elde edilen verileri, EC 50 değerlerini tahmin etmek için ön konsantrasyon-tepki eğrileri oluşturmak için kullanılır. Şekil 3&#39;ün Eğimler aynı zamanda, negatif kontrol konsantrasyon serisi için verileri içerir Drome-SNPF peptidler boş pcDNA3.1 vektörü ile transfekte edilmiş HEK293T hücreler üzerinde test edilmiştir. Sonuçlar, bu hücrelere peptitlerin ilavesinin endojen reseptör üzerinde bir etkiye sahip olduğuna, ancak gerçekten activSöz konusu alıcıyı yedi. Flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deney daha sonra üç kere, bağımsız bir şekilde tekrar edildi. Başlangıç ​​ekranının ön konsantrasyon-yanıt eğrileri göre, test edilen konsantrasyon eğrisinin dinamik aralık (Şekil 4) kapsayacak şekilde adapte edilmiştir. Drome-SNPF-1 (2.04 ± 1.48 nM [% 95 güven aralığı]), Drome-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 nM), Drome-SNPF-3 (5.55 ± 3.95 nM) ve Drome-SNPF-of EC50 değerleri, 4 (0.50 ± 1.01 nM) da reseptörünü aktive etmek için aynı derecede etkili olduğunu gösteren, benzer. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> Bir dizi konsantrasyon (50 uM 0.001 nM arasında). On iki son konsantrasyonları o bir reseptör aracılı floresan tepkisi için yazılım Şekil 2. Grafiksel çıktıf Drome-SNPF-1 peptit Drome-SNPF reseptörü üzerinde test edildi. Aktivasyon nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri olarak ifade edilir. Üst grafik altı yüksek konsantrasyonlarının sonuçları ve altı düşük konsantrasyonları alt grafiğini vermektedir. (-) Yıkama tamponu olan pozitif kontrol (+) PAR 1 (1 uM) ve negatif kontrolüdür. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> Şekil 3,. Tek flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon analizi ile belirlenen Drosophila SNPF peptidlerin ön konsantrasyon-tepki eğrileri. Geçici dört Drosophila SNPF peptidler için HEK293T hücrelerinde ifade Drosophila SNPF reseptörünün konsantrasyon-yanıt eğrileri mavi gösterilmiştir. (Kırmızı ile gösterilen) negatif kontroller için, peptidler HEK293T üzerinde test edilmiştirboş pcDNA3.1 vektörü ile transfekte edilen hücreler. Floresan yanıtları en yüksek değere (% 100 aktivasyon) için göreceli olarak (%) olarak gösterilmiştir. Eğriler, her konsantrasyon serisi üç kez ölçülmüş olup, ki içinde, bir deneyin sonucudur. Dikey çubuklar (bu durumda, sadece semboller gösterilmiştir) bazen kullanılan sembollerin daha küçük ortalama (SEM), standart hatayı temsil eder. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> Şekil 4,. Konsantrasyon-yanıt eğrileri ve üç bağımsız flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyleri ile tespit Drosophila SNPF peptidlerin EC 50 değerlerine tekabül etmektedir. Geçici dört Drosophila SNPF peptidler için HEK293T hücrelerinde ifade Drosopihla SNPF reseptörünün konsantrasyon-tepki eğrileri, bir sonucudur üç bağımsız bendenasurements her bir üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir (n ≥ 9). Floresan yanıtları en yüksek değere (% 100 aktivasyon) için göreceli olarak (%) olarak gösterilmiştir. Yıldız n ≤ 9. Hata çubukları, bazen de (bu durumda, sadece semboller gösterilmiştir) kullanılan sembollerin daha küçüktür SEM, işaret etmektedir için konsantrasyonlarını gösterir. EC 50 değerleri% 95 güven aralıkları ile gösterilir.

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yetim G proteini kenetli reseptörlerin veya G PCR'ların fonksiyonel olarak aktive edici ligandlarını belirlemektir. Bu, ilgi duyulan A-G-P-C-R'nin geçici olarak transfekte edilmesi ve her iki proteinin geçici heterolog ekspresyonunu sağlamak için hücresel bir ekspresyon sisteminde promiskües bir G alpha 16 konstrüktünün ko-transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, transfekte edilen hücreler, kalsiyum etkileşimi üzerine floresan sinyalinde meydana gelen artış yoluyla hücre içi depolardan kalsiyum salınımını tespit eden kalsiyuma duyarlı boya flu oh four ile yüklenir.Ardından, heterolog olarak eksprese edilen reseptörün bir aday ligand bileşik kütüphanesi ile test edildiği floresan tabanlı kalsiyum mobilizasyon analizi gerçekleştirilir; böylece reseptörü aktive eden ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımıyla sonuçlanan hücre içi sinyal iletim kaskadını tetikleyen bileşikler belirlenir ve bu salınım floresan sinyali olarak ölçülebilir. Hücresel ekspresyon sistemine uygulanan ligand konsantrasyonlarına bağlı olarak farklı floresan sinyallerinin tespit edilmesiyle, aktive edici bir ligandın yarı maksimal etkili konsantrasyonunu gösteren bir konsantrasyon-yanıt eğrisi elde edilir. GPCR'nizin geçici ekspresyonunu sağlamak için geçici transfeksiyon yapmanın, stabil klonal hücre hatlarının kullanımına göre temel avantajı, bu tür stabil olarak transfekte edilmiş hücre hatlarının oluşturulması için gereken zaman alıcı sürece ihtiyaç duymamasıdır.Promisküite G alpha 16 alt biriminin transfeksiyonu, endojen ortamlardaki doğal sinyal yolundan bağımsız olarak, çoğu GPCR'nin hücre içi sinyal yolunu kalsiyum salınımına yönlendirebilir. Bu düzenleme, ilgi duyulan GPCR'ler üzerinde yüzlerce bileşiğin kısa bir süre içinde orta ölçekli taramasının yapılmasına olanak tanır; prosedür laboratuvarımızdan doktora öğrencisi yellow gas ve teknisyen Nick Su tarafından gerçekleştirilecektir. HEK 2 93 T hücrelerini, kalsiyum mobilizasyon analizi gerçekleştirilmeden üç gün önce T 75 flasklarda büyütün ve hücreler %80 konfluansa ulaştığında pasajlayın. Bir T 75 flaskı reseptör konstrüktü ile transfeksiyon için, bir diğerini ise negatif kontrol olarak boş bir ekspresyon vektörü ile transfeksiyon için hazırlayın.Flaskları, hücre kültürleri burada gösterildiği gibi %50 ile %70 konfluense ulaşana kadar 37 °C'de, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 20 ila 24 saat inkübe edin. Ardından, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 3,9 µg reseptör konstrüktü veya boş vektör ile 3,9 µg G alpha 16 ekspresyon konstrüktü ekleyin. 500 µL jet prime tamponu ekleyin.Tüpü vorteksleyerek iyice karıştırın ve ardından kısa süreli santrifüjleyin. Sonrasında 37,5 µL jet prime reaktifi ekleyin, vorteksleyin ve maksimum hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Transfeksiyon karışımını 10 dakika inkübe edin.Oda sıcaklığında, hücre popülasyonlarından birini ilgilenilen GPCR'ı ve G alpha 16 konstrüktünü kodlayan ekspresyon vektörü ile transfekte edilmiş olarak, ikinci flaskı ise boş vektör ve G alpha 16 konstrüktü ile transfekte edilmiş olarak etiketleyin. İnkübasyonun ardından, transfeksiyon karışımını hücre kültür ortamına damla damla ekleyin; bu sırada pipetle doğrudan ortama ekleme yaptığınızdan ve kültür flaskının çeperlerine temas etmediğinizden emin olun. Kalsiyum mobilizasyon analizi için flaskları, %5CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de 20 ila 24 saat boyunca inkübe edin.Transfekte edilen hücreler toplanır ve siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 96 kuyucuklu plakalara ekilir. İlk olarak plakalar, kuyucuk başına 60 µL oda sıcaklığındaki çözelti ile kaplanır.Fibronektin içeren fosfat tamponlu salin. Plakları kapakları kapalı halde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Solüsyonu kuyucuklardan uzaklaştırın ve plakları bu kez kapaklar açık halde oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin.Bu sırada, hücrelerin üzerindeki eski büyüme ortamını uzaklaştırın. Ölü hücreleri üç mililitre PBS ile durulayın ve PBS'yi çekin. Ardından, oda sıcaklığında üç mililitre PBS trypsin EDTA ekleyin ve çözeltiyi uzaklaştırmadan önce bir dakika inkübe edin.Bu noktada, hücrelerin morfolojisi yıldız şeklinden küre şekline dönüşür. Flaskun tabanındaki hücreleri hafifçe vurarak serbest bırakın ve oda sıcaklığındaki 10 mililitre DM em transfer medyumu ile birkaç kez durulayarak toplayın.Hücreleri 50 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın. Mililitre başına düşen hücre sayısını saymak için, hücre kültüründen 100 mikrolitreyi 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Ardından 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve tüpe vurarak karıştırın.Son olarak, 100 µL stabilize edici tampon ekleyin ve vurarak karıştırın. Bir nucleo kaseti hücre süspansiyonu ile doldurun ve hücreleri sayıcı ile sayın. Hücreler üç kat seyreltildiği için nucleo view yazılımı hücre sayısını otomatik olarak üçle çarpar.Liz ve stabilize edici tampon eklendiğinde, hücreleri mililitre başına 600,000 hücrelik bir final konsantrasyona seyreltin ve kaplanmış plakaların her kuyucuğuna 150 µL hücre ekleyin. Kuyucuk başına yaklaşık 90,000 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hava kabarcıklarından kaçının ve hücrelerin eşit şekilde yayılması için plakaya hafifçe vurun. Kesintisiz bir hücre tabakası oluşturmak için plakaları %5CO2 nemlendirilmiş inkübatörde, 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin.Hücrelerdeki besiyerini boşaltın. Hücreleri kuyuk başına 200 µL PBS ile yıkayın ve PBS'yi uzaklaştırın. Bu noktadan itibaren hücrelere fluoro four yükleneceği için, hücrelerle yapılan tüm sonraki işlemlerin karanlıkta gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.Kuyu başına 55 µL yükleme tamponu ekleyin, plakanın ışığa maruz kalmasını önlemek için plakayı alüminyum folyo ile sarın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, silikonize 1,5 mL mikro santrifüj tüplerindeki kurutulmuş peptitleri çözmek için yıkama tamponu kullanın. Bir konsantrasyon yanıt analizi gerçekleştirmek ve bir ligandın EC 50 değerini belirlemek için bir dilüsyon serisi hazırlayın.Analiz sırasında, bileşik plakasındaki bir liganddan 50 µL'nin, hücre plakasında 100 µL yıkama tamponu bulunan bir kuyucuğa aktarılacağını unutmayın; bu nedenle bileşikleri, istenen son konsantrasyonlarının üç katı yoğunlukta hazırlayın. Ardından, ligandın 70 µL'sini bileşik plakasının karşılık gelen kuyucuklarına üç tekrarlı olarak ekleyin. Her plakaya pozitif ve negatif kontroller ekleyin.Hücre plakasındaki yükleme tamponunu boşaltın ve ışığa maruz kalmasını önleyerek her kuyucuğa 100 µL yıkama tamponu ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücre plakasındaki yıkama tamponunu boşaltın ve her birine 100 µL yeni yıkama tamponu ekleyin.Hücre plakası, bileşik plakası ve bir uç rafı 15 dakika boyunca inkübe edin. 37 °C'de, yazılımla istenen protokol dosyasını oluşturup yükleyin ve okuma odası için buradaki sıcaklık kontrol ünitesini etkinleştirin. Kalsiyum yanıtları, 37 °C'de iki dakika boyunca, her seferinde bir sıra olacak şekilde ve 525 nm'de ardışık okumalar arasında 1,52 saniyelik aralıklarla ölçülür.Fluo-4 uyarılmasını 488 nanometreye ayarlayın ve toplam 50 µL bileşiği hücre plakasına aktarın. Okumadan 18 saniye sonra işleme başlayın. Dağıtım hızını 26 µL/s ve pipet yüksekliğini 135 µL olarak ayarlayarak başlayın.Bileşik ve hücre plakasını ve uç rafını istasyon cihazının uygun çekmecelerine yerleştirin. Flex modunda asıl taramaya başlamadan önce, hücre plakasının uç nokta modunda aynı eksitasyon ve emisyon dalga boyunda tek bir okumasını gerçekleştirin. Deneyi başlatın ve gösterilen yazılımı kullanarak verileri analiz etmeye geçin.Burada, doofus short NPF bir konsantrasyon serisinin üç replikasından birine karşılık gelen grafikler yer almaktadır. Negatif kontrol floresan bir sinyal oluşturmamıştır. Pozitif kontrol ise endojen proteaz aktive reseptör bir'in güçlü aktivasyonunu tetikleyerek yüksek bir floresan sinyale yol açmıştır.Yazılım, diğerlerinin yanı sıra aktivasyon yüzdesini veya farklı konsantrasyonların standart hatalarını belirlemek için formüller girilmesine olanak tanır. Elde edilen veriler, dört özofagus kısa NPF peptidleri için gösterildiği gibi EC 50 değerlerini tahmin etmek amacıyla ön konsantrasyon yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılır. Eğriler ayrıca, drosophila kısa NPF peptidlerinin konsantrasyon serilerinin boş bir vektörle transfekte edilmiş hücreler üzerinde test edildiği negatif kontrol verilerini de içerir.Sonuçlar, peptitlerin bu hücrelere eklenmesinin endojen reseptörler üzerinde hiçbir etkisinin olmadığını, ancak hedeflenen reseptörü gerçekten aktive ettiğini göstermektedir. Floresan tabanlı kalsiyum mobilizasyon analizinin ön konsantrasyon yanıt eğrileri çıkarılmış ve test edilen konsantrasyonlar eğrinin dinamik aralığını kapsayacak şekilde uyarlanmıştır. Drosophila short npf 1, 2, 3 ve dört'ün EC 50 değerleri birbirine benzerdir; bu durum, bu prosedür takip edildiğinde reseptörü aktive etme konusunda eşit derecede güçlü olduklarını göstermektedir.Peptidin hangi amino asitlerinin reseptör aktivasyonu için kritik olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, G proteini kenetli reseptörlerin fonksiyonel olarak aktive eden ligandlarını tanımlamak için floresan temelli kalsiyum mobilizasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu süreç, stabil ekspresyon sistemlerinin sürdürülmesini ve ardından hücre sisteminin ilgili reseptör ile geçici transfeksiyonunu içerir.Sertleştirme işleminin ardından kalsiyum mobilizasyon analizi gerçekleştirilebilir.

characterization-g-protein-coupled-receptors-fluorescence-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Bu video, CXCR4 kemokin reseptörlerini eksprese eden glioblastoma hücrelerini içeren bir hücresel testi göstermektedir. Tahlil, ajan etkileşimi üzerine floresan değişikliklerini ölçmek için kalsiyuma duyarlı bir boya kullanır ve hücresel sinyalleşme dinamikleri hakkında içgörüler sunar.

CXCR4 ile Etkileşime Giren Ajanların Tanımlanması için Hücresel Bir Test

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

G proteinlerinin G proteinine bağlı reseptörler tarafından seçici aktivasyonunu tespit etmek için basit yöntemler, hücre sinyalizasyonunda olağanüstü bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) biyosensörleri, canlı hücrelerde kontrollü konsantrasyonlarda konformasyonel değişiklikleri araştırmak için bir GPCR'nin G protein peptitlerine çift olarak bağlanmasıyla geliştirilmiştir.

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

MRGPRX2 reseptörü ile mast hücrelerini aktive edebilecek kısa peptitlerden oluşan bir kütüphane oluşturma teknikleri açıklanmıştır. İlişkili teknikler kolay, ucuzdur ve diğer hücre reseptörlerine genişletilebilir.

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Proteaz ile aktive edilmiş reseptörlerin (PAR'lar) ligandlarını tanımlamak için kullanılan endotel hücreleri ile bir kalsiyum mobilizasyon testi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiştir. Yeni protokol, toplam test süresini 90-120 dakika azaltır ve tekrarlanabilir konsantrasyon-yanıt eğrileri verir.

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Bu protokol, G proteinine bağlı reseptör ligand stimülasyonu üzerine canlı HEK293 hücrelerinde G proteini aktivasyonunun gerçek zamanlı ölçümü için BRET tabanlı biyosensörlerin kullanımını açıklar. Burada, β2-adrenerjik reseptör ve kannabinoid tip 1 reseptörü, çeşitli G proteini alt tipleri ve çeşitli GPCR'ler için sensörlerin etkinliğini göstermek için örnek olarak hizmet eder.

Canlı Hücrelerde G Proteinine Bağlı Reseptör Aktivitesini Ölçmek için BRET Tabanlı G Protein Biyosensörleri

Öğrenin, yetim G proteinine birleştirilmiş alıcılar için floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyi yöntemini. HEK293T hücrelerinde geçici transfeksiyon kullanarak ligand aktivasyonunu hızlıca tarayın.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet