Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yetim G proteinine bağlı reseptörlerin veya G PCR'lerin işlevsel olarak aktive edici ligandlarını tanımlamaktır. Bu, her iki proteinin geçici heterolog ekspresyonunu elde etmek için hücresel bir ekspresyon sisteminde rastgele bir G alfa 16 yapısını geçici olarak transekte ederek, ilgilenilen A-G-P-C-R ve manşon transektüsyonu ile elde edilir. İkinci bir adım olarak, transfekte edilmiş hücreler, kalsiyum etkileşimi üzerine floresan sinyalinde bir artış yoluyla hücre içi depolardan kalsiyum salınımını tespit eden kalsiyuma duyarlı boya grip oh four ile yüklenir.

Daha sonra, floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon testi, reseptörü aktive eden ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımı ile sonuçlanan hücre içi bir sinyal kaskadı ortaya çıkaran bileşikleri belirlemek için heterolog eksprese edilen reseptöre aday ligandlardan oluşan bir bileşik kütüphanesi ile meydan okuyarak gerçekleştirilir, bu da bir floresan sinyali olarak ölçülebilir. Hücresel ekspresyon sistemine uygulanan ligand konsantrasyonlarına bağlı olarak farklı floresan sinyallerinin saptanmasına dayanan, aktive edici bir ligandın yarı maksimal etkili konsantrasyonu ile bir konsantrasyon tepki eğrisi gösteren sonuçlar elde edilir. GPCR'nizin geçici ekspresyonunu elde etmek için stabil klonal hücre hatlarının kullanımına göre geçici transfect gerçekleştirmenin ana avantajı, bu tür stabil transfekte hücre hatlarının zaman alıcı bir şekilde kurulmasını gerektirmemesidir.

Rastgele G alfa 16 alt biriminin transfeksiyonu, çoğu GPCR'nin hücre içi sinyal yolunu, endojen ortamlarda doğal sinyal yolundan bağımsız olarak kalsiyum salınımına doğru yönlendirebilir. Bu nedenle, bu kurulum, kısa bir süre içinde ilgilenilen GPCR'ler üzerinde yüzlerce bileşiğin orta verimli taramasına izin vererek, prosedürün sarı gaz olacağını gösterir, bir doktora öğrencisi ve laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Nick Su, HEK 2 93 T hücrelerini, gerçek kalsiyum mobilizasyon testi gerçekleşmeden üç gün önce T 75 şişelerinde büyütün, % 80'lik bir birleşime ulaşıldığında hücreleri geçirin. Reseptör yapısı ile transfeksiyon için bir T 75 şişesi ve negatif kontrol olarak boş bir ekspresyon vektörü ile transfeksiyon için bir tane hazırlayın.

Şişeleri 37 santigrat derecede% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde 20 ila 24 saat boyunca hücre kültürleri burada gösterildiği gibi% 50 ila 70 birleşmeye yaklaşana kadar inkübe edin. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne 3.9 mikrogram reseptör yapısı veya boş vektör ve 3.9 mikrogram G alfa 16 ekspresyon Yapısı ekleyin. 500 mikrolitre jet prime tamponu ekleyin.

Tüpü girdaplayarak ve ardından kısa bir döndürme yaparak iyice karıştırın. Ardından 37,5 mikrolitre jet prime reaktif girdabı ekleyin ve maksimum hızda bir dakika aşağı döndürün. Transfeksiyon karışımını 10 dakika inkübe edin.

Oda sıcaklığında, ilgilenilen GPCR'yi ve G alfa 16 yapısını ve ikinci şişeyi boş vektör ve G alfa 16 yapısını kodlayan ifade vektörü ile transfekte edilmiş olarak bir hücre popülasyonunu etiketleyin. İnkübasyonun ardından, transfeksiyon karışımını hücre kültürü ortamına damla damla ekleyin, doğrudan ortama pipetlediğinizden ve kültür şişesinin duvarlarıyla temastan kaçındığınızdan emin olun. Kalsiyum mobilizasyon testi için şişeleri 37 santigrat derecede% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 20 ila 24 saat inkübe edin.

Transfekte edilen hücreler toplanır ve 96'ya tohumlanır. İyi siyah duvarlı şeffaf alt plakalar. İlk önce plakaları oda sıcaklığında bir kuyu başına 60 mikrolitre ile kaplayın.

Fibronektin ile fosfat tamponlu salin. Plakaları oda sıcaklığında, kapağı kapalı olarak bir saat inkübe edin. Çözeltiyi kuyucuklardan çıkarın ve plakaları oda sıcaklığında kapaksız bir saat boyunca tekrar inkübe edin.

Bu arada, eski büyüme ortamını hücrelerden çıkarın. Ölü hücreleri üç mililitre PBS ile durulayın ve PBS'yi çıkarın. Ardından, çözeltiyi çıkarmadan önce üç mililitre oda sıcaklığında PBS tryin EDTA'yı bir dakika inkübe edin.

Bu noktada, hücrelerin morfolojisi yıldız şeklinden küre şekline değişir. Şişenin altındaki hücreleri hafifçe vurarak gevşetin ve 10 mililitre oda sıcaklığında birkaç kez durulayarak toplayın. DM em transfer ortamı.

Hücreleri 50 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Mililitre başına hücre sayısını saymak için, 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 100 mikrolitre hücre kültürü ekleyin. Daha sonra 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve tüpe vurarak karıştırın.

Son olarak, 100 mikrolitre dengeleyici tampon ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın. Bir nükleo kasetini hücre süspansiyonu ile doldurun ve sayaç ile hücreleri sayın. Çekirdek görüntüleme yazılımı, hücreler üç kat seyreltildiği için hücre sayısını otomatik olarak üç ile çarpar.

Lizis ve stabilize edici tamponu eklerken, hücreleri mililitre başına 600.000 hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve kaplanmış plakalarda oyuk başına 150 mikrolitre hücre tohumlayın. Kuyu başına yaklaşık 90.000 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hava kabarcıklarından kaçının ve hücreleri eşit şekilde yaymak için plakaya hafifçe vurun. Bitişik bir hücre tabakası elde etmek için, plakaları 37 santigrat derecede% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde 16 ila 24 saat inkübe edin.

Ortamı hücrelerden atın. Hücreleri kuyucuk başına 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve PBS'yi çıkarın. Hücrelerle yapılan işlemleri içeren aşağıdaki tüm adımların karanlıkta gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın, çünkü bu noktadan itibaren hücrelere floro dörtlüsü yüklenecektir.

Kuyucuk başına 55 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin, plakanın ışığa maruz kalmasını önlemek için plakayı alüminyum folyoya sarın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, kurutulmuş peptitleri silikonize 1.5 mililitre mikro santrifüj tüplerinde çözündürmek için yıkama tamponu kullanın. Bir konsantrasyon tepkisi analizi yapmak ve bir ligandın EC 50 değerini belirlemek için bir seyreltme serisi hazırlayın.

Bileşik plakadan 50 mikrolitre ligandın, tahlil sırasında hücre plakası üzerinde 100 mikrolitre yıkama tamponu bulunan bir kuyuya aktarılacağını unutmayın, bu nedenle bileşikleri istenen nihai konsantrasyonlarının üç katında hazırlayın. Daha sonra, bileşik plakanın karşılık gelen kuyucuğuna üç kopya halinde 70 mikrolitre ligand ekleyin. Her plakaya pozitif ve negatif kontroller ekleyin.

Yükleme tamponunu hücre plakasından atın ve ışığa maruz kalmayı önleyerek her bir oyuğa 100 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Yıkama tamponunu hücre plakasından atın ve her birine 100 mikrolitre yeni yıkama tamponu ekleyin.

Hücre plakasını, bileşik plakayı ve bir uç rafını 15 dakika boyunca inkübe edin. 37 santigrat derecede, yazılımla birlikte istenen protokol dosyasını oluşturun ve yükleyin ve burada okuma odası için sıcaklık kontrol ünitesini etkinleştirin. Kalsiyum tepkileri, 525 nanometrede ardışık okumalar arasında 1.52 saniyelik bir aralıkla her seferinde bir sıra olmak üzere iki dakika boyunca 37 santigrat derecede ölçülür.

Grip oh dört ila 488 nanometre arasında bir uyarım ayarlayın ve toplam 50 mikrolitre bileşik hacmini hücre plakasına aktarın. Okumadan 18 saniye sonra. Dağıtım hızı saniyede 26 mikrolitreye ve pipet yüksekliği 135 mikrolitreye ayarlanmış olarak başlayın.

Bileşik ve hücre plakasını ve uç rafını istasyon cihazının uygun çekmecelerine yerleştirin. Gerçek ekranı esnek modda başlatmadan önce son nokta modunda aynı uyarma ve emisyon dalga boyunda hücre plakasının tek bir okumasını gerçekleştirin. Tahlili başlatın ve gösterilen yazılımı kullanarak verileri analiz etmeye devam edin.

İşte doofus kısa NPF bir konsantrasyon serisinin üç kopyasından birine karşılık gelen grafikler. Negatif kontrol bir floresan sinyali indüklemedi. Pozitif kontrol, endojen proteaz aktive edilmiş reseptörün güçlü aktivasyonunu ortaya çıkarırken, yüksek bir floresan sinyaline yol açar.

Yazılım, diğerlerinin yanı sıra farklı konsantrasyonların aktivasyon yüzdesini veya standart hatalarını belirlemek için formüllerin girilmesine izin verir. Elde edilen veriler, dört özofagus kısa NPF peptidi için gösterildiği gibi EC 50 değerlerini tahmin etmek için ön konsantrasyon yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılır. Eğriler ayrıca, drosophila kısa NPF peptitlerinin konsantrasyon serilerinin boş bir vektör ile transfekte edilmiş hücreler üzerinde test edildiği negatif kontrol verilerini de içerir.

Sonuçlar, peptitlerin bu hücrelere eklenmesinin endojen reseptörler üzerinde hiçbir etkisi olmadığını, ancak gerçekten de ilgilenilen reseptörü aktive ettiğini göstermektedir. Floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon testinin ön konsantrasyon tepki eğrileri gerçekleştirildi ve test edilen konsantrasyonlar, eğrinin dinamik aralığını kapsayacak şekilde uyarlandı. Drosophila short npf 1, 2, 3 ve dördün EC 50 değerleri benzerdir, bu da reseptörü aktive etmek için eşit derecede güçlü olduklarını gösterir Bu prosedürü takiben.

Yapı aktivitesi gibi diğer yöntemler, reseptör aktivasyonu için peptidin hangi amino asitlerinin çok önemli olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için ilişki çalışmaları yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, G proteinine bağlı reseptörlerin fonksiyonel olarak aktive edici ligandlarını tanımlamak için fluer duyu tabanlı bir kalsiyum mobilizasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu, güneş ekspresyon sistemlerinin bakımını ve ardından hücre sisteminin ilgilenilen reseptör tarafından transseksüel transfeksiyonunu içerir.

Sert kalsiyum mobilizasyonundan sonra test yapılabilir.