Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

Bu protokol, nöronları yönlendirmek için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmek için elektrospinning ve mikroküreleri birleştirir. Sinir büyüme faktörü PLGA mikroküreleri içinde kapsüllendi ve Hyaluronik Asit (HA) fibröz iskelelere elektrospre edildi. Protein biyoaktivitesi, iskelelerin birincil civciv Dorsal Kök Gangliyonları ile tohumlanması ve 4-6 gün boyunca kültürlenmesi ile test edildi.

Bu prosedürün genel amacı, sinir büyümesini ve onarımını desteklemek için çok yönlü bir ortam yaratmaktır. Bu, ilk olarak parçalanabilir mikro küreler içinde büyüme faktörlerinin kapsüllenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, destek malzemesini ortamın büyük bir kısmı için hazırlamaktır.

Daha sonra, mikro küreler ve destek malzemesi birleştirilir ve elektro eğrilerek hizalanmış lifli bir iskeleye dönüştürülür. Son adım, iskeleyi civciv dorsal kök gangliyon nöronları ile test etmektir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu, nörit büyümesinin ve yönünün kontrollere kıyasla daha hızlı olduğunu göstermek için kullanılır.

Bu sistem, kullanılan proteinlerde ve malzemelerde küçük değişiklikler olan sinir dokusu için tasarlanmış olsa da, kalpler, akciğerler ve kemik dahil olmak üzere çeşitli doku tiplerine de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamadan önce, gerekli reaktifleri, deiyonize suda hacim başına %2 ve %0.5 ağırlıkça polivinil alkol veya PVA çözeltilerini, hacim başına %2'lik bir çözeltiyi, izopropil alkol ve deiyonize suyu ve istenen hidrofilik proteinin sulu bir çözeltisini hazırlayın. Yer. % 0.5'lik PVA çözeltisinin 40 mililitresi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirilir ve 300 miligram 65 ila 35 polilaktik koglikolik asit veya PLGA ve üç mililitre di kloro metan çözülmüş küçük bir şişede bir kenara koyun.

PLGA çözünmesini hızlandırmak için 200 mikrolitre protein çözeltisi ve dört mikrolitre %2 PVA çözeltisi içeren bir vorteks karıştırıcı kullanılabilir. Protein PVA karışımını PLGA çözeltisine dökün. Çözümler çoğunlukla ayrı kalacaktır.

Şişeyi yaklaşık 10 watt'lık bir soğutucu kullanarak bir buzlu su kabına yerleştirin, homojen kremsi beyaz bir emülsiyon oluşana kadar çözeltiyi beş ila 10 saniye çalkalayın. Emülsiyonu% 0.5 PVA içeren önceden hazırlanmış 50 mililitrelik tüpe dökün. Çözeltiyi bir girdap karıştırıcı üzerinde yaklaşık 20 saniye boyunca yüksek hızda karıştırın.

Çözüm bulutlu bir görünüm geliştirecektir. Emülsiyonu 200 mililitrelik bir behere aktarın ve iki dakika boyunca 350 RPM'de bir karıştırma plakasına yerleştirin. Karıştırma plakasındaki behere 50 mililitre% 2 izopropil alkol ekleyin.

Kloro metanın buharlaşmasına ve PLGA'nın sertleşmesine izin vermek için karışımın en az bir saat karıştırmaya devam etmesine izin verin. Daha sonra, mikroküre çözeltisini santrifüj tüplerine aktarın, üç dakika boyunca 425 kez G'de santrifüjleyin. Mikro küreler tüpün dibinde toplanacak ve beyaz görünecektir Süpernatanı mikrokürelerin üzerindeki tüpten dikkatlice çıkarın ve 500 mililitrelik bir şişede saklayın.

Mikroküreleri deiyonize su ile durulayın, her bir tüpü dörtte üçünü doldurarak ve sıvıdaki mikro küreleri yeniden dağıtmak için sallayarak. Son durulamayı takiben santrifüjlemeyi, süpernatantın çıkarılmasını ve mikrokürelerin deiyonize su ile dört kez durulanmasını tekrarlayın. Süpernatanı çıkarın ve diğer numunelerle birlikte 500 mililitrelik şişeye yerleştirin.

Santrifüj tüplerinde toplanan mikroküreleri gece boyunca eksi 20 santigrat derecede dondurun ve ardından en az 24 saat liyofilize edin. Aşağıdaki elektro eğirme çözeltisi, deiyonize suda, hacim başına %2 ağırlıkta, metamfetamin ile ilgili hyaluronik asit veya miha, hacim başına %3 ağırlık, 900 kilodalton polietilen oksit veya PEO ve hacim başına %0.05 ağırlıkla önceden hazırlanmalıdır. Fotoğraf başlatıcı çözümü.

İstenilen hacimde elektro eğirme çözeltisi yaptıktan sonra, mililitre başına 400 miligrama kadar istenen konsantrasyonda mikro küreler ekleyin. Mikroküreler çözelti içinde eşit olarak dağılana kadar çözeltiyi bir girdap karıştırıcı üzerinde karıştırın. Solüsyonu bir şırıngaya aktarın ve altı inç 18 gauge künt uçlu bir iğne takın.

Şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin ve saatte 1,2 mililitre olarak dağıtacak şekilde ayarlayın. Mandrel üzerine bir alüminyum folyo tabakası bantlayın. Bu, bitmiş iskelenin kolay temizlenmesini ve depolanmasını sağlar.

Hizalanmış lifler oluşturmak için dönen bir mandrel kullanılır. Yüksek voltajlı bir güç kaynağından gelen topraklama kablosunu toplama aparatına bağlayın. Başarılı elektro eğirme sağlamak için pozitif ucu iğneye bağlayın.

Tüm bağlantıların ve ayarların doğru olduğunu doğrulamak çok önemlidir. Polimer pompalamaya başlayın ve şırınganın sonunda çözelti göründüğünde, voltaj kaynağını açın ve voltajı 24 kilovolta ayarlayın. İstenilen iskele kalınlığı elde edilene kadar çözeltiyi çalıştırın.

Tamamlandığında, voltaj kaynağını ve şırınga pompasını kapatın. Bu prosedüre başlamak için, elektro eğirme işleminden önce ilgili lamele fişlerini çıkarılabilir çift taraflı bantla elektro döndürücünün toplama alanına yapıştırın. Kapak kızakları üzerine eğirme, istenen kalınlığa kadar elektro eğirme işleminden sonra kullanımı ve görüntülemeyi kolaylaştırır.

Önceki video bölümünde gösterildiği gibi, kapak fişlerini mandrelden dikkatlice çıkarın. İskele kaplı kapak kızaklarını şeffaf bir nitrojen odasına yerleştirin ve tüm oksijenin dışarı atıldığından emin olun. Odayı ve iskeleyi 15 dakika boyunca 10 miliwatt santimetre kare 365 nanometre ışığın altına yerleştirin.

Çapraz bağlama yerinden sonra, kapak uygun boyutta bir kuyu plakasına kayar. İskele tarafının yukarı baktığından emin olun. Kuyu plakasındaki her iskeleye 100 ila 200 mikrolitre ortam yerleştirin. Dikkatlice.

Medya damlacıkındaki her iskeleye bir dorsal kök gangliyonu veya DRG yerleştirin. Kalın bir iskele için daha fazla ortama ihtiyaç duyulabilir. DRG'nin tamamen suya batırılması ve yüzmemesi gerekir.

Hücrenin iskeleye yapışmasını sağlamak için iskeleyi ve DRG'yi 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, ortamı kuyu için uygun seviyeye kadar doldurun. Plakayı inkübatöre geri koyun ve inkübasyon süresinden sonra dört ila altı gün boyunca inkübe edin.

Ortamı her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve PBS ile bir kez nazikçe yıkayın. Hacim başına %4 ağırlık kullanarak hücreleri 30 dakika sabitleyin. Para formaldehit daha sonra yerleşik bir protokolü izleyerek hücreleri nöro filamentler ve çekirdekler için boyar.

Hücreleri bir floresan mikroskobu kullanarak görselleştirmek için, kuyu plakasını mikroskobun tablasına yerleştirin ve dpi için filtre ve uyarma ayarlarını kullanarak hücre kütlesini bulun. Hücre tanımlandıktan sonra filtreyi zi konumuna getirin. Uzatılmış nöritleri görselleştirmek için, tüm yapıyı görmek için gerektiği kadar çok görüntü toplamak ve birleştirmek için mikroskoptaki dikiş işlevini kullanın.

Dpi, fite ve parlak alan mikro küreleri için tekrarlayın. %85'in üzerinde protein kapsülleme ile 50 artı veya eksi 14 mikrometre çapında tutarlı bir şekilde üretilmiş ve elektrolar bu protokol ile iskelelere dönüştürülmüştür. Bu floresan görüntü, PLGA kabuğunda Rod Domine ve içinde kapsüllenmiş BSA oturan temsili mikro küreleri göstermektedir.

Kapsüllemeyi değerlendirmek için, mikroküreler BSA ile dolduruldu ve bir Bradford protein tahlili ile 60 günden fazla bir süre boyunca protein salınımı için test edildi. Serbest bırakma bir ilk patlama ile başlar ve daha sonra elektro eğirmeden sonra mikro küreler parçalandıkça devam eder. Mikro küreler, 3D lifli yapı boyunca görülebilir.

Komple iskelenin bu SEM görüntüsünde. Küreler, oklarla gösterilen birden çok katmanda görülebilir. Bu yüksek büyütme oranlı görüntü, üzerindeki iskeleden gelen nano liflerle birlikte bir mikro küreye aittir.

Dorsal kök gangliyonları veya DRG, iskele içindeki mikrokürelerde sinir büyüme faktörünün veya NGF'nin canlılığını test etmek için kullanıldı. İşte DRG, mikro küreler içeren bir iskele üzerinde oturuyor. NGF ile yüklü, daha uzun nörit içinde protein içermeyen bir mikro kürenin yanında gösterilir NGF iskelesi üzerindeki DRG'den uzanan uzantılar, NGF'nin yaşayabilir olduğunu ve büyümeyi teşvik edebileceğini gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, proteini mikro küreciklere nasıl kapsülleyeceğinizi ve bunları lifli iskelelere nasıl dahil edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.