Name: Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Öğrenin elektrospinning ve mikrokürelerle sinir onarımı için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmeyi. Bu yöntem, büyüme faktörlerinin kontrollü salınımıyla nöronal büyümeyi destekler ve Dorsal Root Ganglia hücreleriyle test edilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Richard Barber Vakfı ve Thomas Rumble Bursu (TJW) aracılığıyla finanse edildi.

1. Su / Yağ / Su Çift Emülsiyon Mikroküre Üretimi <ol><li> Üretim ve% 2 iyonu giderilmiş suda bir polivinil alkol (PVA) v çözeltileri% 0.5 a / hazırlar. Berrak olana kadar 50 ° C de karıştırdıktan çözüm, bu birkaç saat alabilir. Deiyonize su içinde% 2 h / h İzopropil Alkol içinde bir çözeltisi hazırlandı. </li><li> Arzu edilen hidrofilik, proteinin bir sulu çözelti hazırlayın. Aşağıdaki tablo, örnek formülasyonları sağlar. </li></ol><img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> Tablo 1:. Örnek Protein Çözümleri aşağıdaki protein çözümleri başarıyla kapsüllü ve electrospun bu protokolü kullanarak edilmiştir. Gerektiğinde diğer hidrofilik, protein çözeltileri kullanılabilir. <ol start="3"><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine% 0.5 PVA çözeltisi 40 ml yerleştirin ve bir kenara. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde 65:35 300 mg &#39;poli 3 ml diklorometan (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). , Bir girdaplı karıştırıcı PLGA çözünmesini hızlandırmak için kullanılabilir. </li><li> Protein çözeltisi ve 200 ul% 2 PVA-çözeltisinden 4 ul birleştirin. PLGA solüsyonu içine dökün protein (1.4 adım). Çözümler çoğunlukla ayrı kalacaktır. </li><li> Buzlu su içeren bir deney kabı içine tüp yerleştirin. ~ 10 Watt (RMS) bir değnek sonikator kullanarak, bir üniforma kremsi beyaz emülsiyon oluşturulur kadar bir kaç saniye (5-10) için çözüm çalkalayın. </li><li> % 0.5 PVA (adım 1.3) ihtiva eden 50 ml&#39;lik bir tüp içine emülsiyonu dökün. ~ 20 saniye boyunca bir vorteks mikserde yüksek hızda çözüm karıştırın. Çözelti bulanık bir görünüm geliştirecektir. </li><li> 2 dakika boyunca 350 rpm&#39;de bir karıştırma plakası üzerinde 200 ml&#39;lik bir cam ve yere emülsiyonu aktarın. Karıştırma plakası üzerinde beher% 2 izopropil alkol 50 ml ilave edilir. Karışım sertleştirmek üzere DCM buharlaşmaya izin vermek için 1 saat içinde ve en az bir PLGA için karıştırma devam etmesini sağlar. </li><li> Transferi to santrifüj tüpleri içine mikro-küre çözeltisi. </li><li> 3 dakika boyunca 425 x g&#39;de santrifüj. Mikro küreler, bu tüpün altında toplanır ve beyaz görünür. Dikkatlice mikrosferler üzerinde tüpten çıkarın ve 500 ml&#39;lik bir şişe içinde depolar. </li><li> Tam tüpü üç çeyreği doldurulması ve sıvı içindeki mikro küreleri dağıtmak için sallama ile, iyonu giderilmiş su ile mikro küreleri durulayın. </li><li> Tekrar 1.10 ve 1.11 dört kez yineleyin. </li><li> Son durulama sonra, diğer örnekleri ile 500ml şişe içinde tekrar yer supernatant çıkarın. Daha sonra en az 24 saat boyunca liyofilize, santrifüj tüpü içinde toplanmıştır küreleri dondurun. </li><li> Bir ışık mikroskobu altında veya bir Taramalı Elektron Mikroskobu ile mikroküreler gözünüzde canlandırın. 60 um&#39;den daha büyük olmayan bir mikro-etkili üretebilmektedir içindir. Mikro-küreler çok büyük olursa, uzun sonikasyon veya girdaplama kere adım 1.6, 1.7 ya da gerekli olabilir. </li> &lt;li&gt; -20 ° C derin dondurucuda kurutulmuş mikroküreler saklayın. </li><li> Opsiyonel: Aşama 1.10 30&#39;dan 500ml şişe içinde protein miktarı test etmek için, üreticinin talimatlarına göre, bir protein deneyi kullanın. Bu mikro-kapsüllenmiş protein üretim sürecinde kullanılan ne çözeltide miktarının çıkarılması ile yüzde hesaplamak için kullanılır. </li></ol> . Mikrosferde protein yer PLGA solüsyonu 31 ml x 2 Rhodamine ug / ekleyin ve bir FITC konjüge protein kapsüllemek görselleştirmek için 1 bir örneğini göstermektedir: Not. Mikrokürelerin 2. Elektrospinning <ol><li> Önceki elektro çözeltisinin hazırlanması için, 37 ° C sıcaklıkta eritilmesi ile, iyonu giderilmiş su içinde foto-başlatıcı bir% 0.5 w / v solüsyonu oluşturmak. Bu işlem birkaç saat sürebilir. </li><li> Hyaluronik asit (Meha) metaakrilat karşı 29,% 3 (Burdick ve ark. Sentez için bakınız) w / 2% oluşturma/ hac 900 kD poli (etilen oksid) (PEO) ve% 0.05 w / v, deiyonize su içinde foto başlatıcı ağırlık solüsyonu. <ol><li> İstenen hacme için Meha ve PEO doğru miktarını hesaplayın. Örneğin, çözelti, 10 ml electrospinning Meha, 200 mg ve 300 mg PEO gerektirir. </li><li> Istenen son hacminin (9 Bu örnek için mi)% 90 deiyonize su içinde çözülür PEO. Bu işlem birkaç saat sürebilir, 37 ° C&#39;de ısıtılmış bir karıştırma plakası veya su banyosu işlemi hızlandırmak için kullanılabilir. </li><li> Sonraki Meha ekleyin ve berraklaşana kadar karıştırın çözelti üzere, bir girdaplı karıştırıcı kullanılır. Bu sadece bir kaç dakika sürer. </li><li> Son olarak geriye kalan% 10 hacim (bu, örneğin, 1 mi) doldurmak üzere% 0.5 foto başlatıcı çözeltisi ekleyin. </li></ol></li><li> 400 mg / ml kadar, istenen yoğunlukta mikro küreleri ekleyin. Bu mikrosferler, eşit çözelti içinde dağıtılır kadar vorteksli bir mikserde çözüm karıştırın. </li><li> Bir şırıngaya çözüm aktarın ve 6 inç ve 18 kalibrelik bl iliştirmekulastırınız ucu iğne. </li><li> Bir şırınga pompası şırınga ve 1.2 ml / saat olarak dağıtmak için ayarlanmış. </li><li> Toplama plakası ya da bir mandrel üzerine bir alüminyum folyo tabakası bantlayın. Bu bitmiş skafoldun kolay temizlemek ve saklanmasına olanak vermektedir. Bir dönen mandrel uyumlu lifleri oluşturmak için kullanılır. Düz bir plaka ya da hareketsiz mandrel rasgele düzenlenmiş fiberlerin sonuçlanacaktır. </li><li> Toplama aparatı ile yüksek gerilim güç kaynağından topraklama kablosu bağlayın. Iğne pozitif kablosunu bağlayın. </li><li> Iğne ucu ve toplama yüzeyi arasında 15 cm olacak şekilde şırınga pompası ve bir toplama yüzeyi ayarlayın. </li><li> Çözüm şırınganın ucunda görünür olduğunda, polimer pompalama başlatın, gerilim kaynağı açmak ve 24 kV DİKKAT gerilimini ayarlamak:. Sisteminin herhangi bir metal parçası dokunmayın üzerindeki gerilim açıldıktan sonra. Şarj ayrıca cilde elektrikli parçalardan kısa mesafelerde atlayabilir. </li><li> D kadar çözüm çalıştırınesired iskele kalınlığı elde edilir. Tam bir gerilim kaynağı ve şırınga pompası kapattığınızda. </li><li> Iskele ekli ile folyoyu çıkartın. Tamamlanan proteini içeren iskeleler -20 ° C dondurucu içinde saklanır. </li></ol> 3. Protein biyoaktivitenin test edilmesi <ol><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın. Ekleme,% 10 h / h Fetal Sığır Serumu Dulbecco Modified Eagle Medium,% 1 h / h, L-glutamin, ve% 1 hacim / hacim Penisilin-Streptomisin. </li><li> Bir plaka tamamen içine sığacak seçiniz cam lamelleri. </li><li> Üretici tarafından tarif edildiği gibi tedavi etmek için lamelleri 3-(trimetoksisilil) propil metakrilat kullanın. Methacrylation lamelleri iskele bağlılığı artırır. </li><li> Electrospinning önce çıkarılabilir çift taraflı bant ile electrospinner toplanma alanına metakrile lamelleri takın. Lamelleri üzerine İplik işleme ve görüntüleme kolaylaştırır. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi arzu edilen kalınlığına Electrospin. </li><li> Biryıkıldıktan sonra dikkatlice mandrelinden lamelleri çıkarın elektrospinning. Net azot odasına İSKELE kaplı lamelleri yerleştirin ve tüm oksijen temizlendi olduğundan emin olun. </li><li> 15 dakika boyunca, 10 mW / cm 2, 365 nm ışık altında haznesi ve iskele yerleştirin. Uygun büyüklükte plaka içine bir yer çapraz bağlama sonrası. Iskele tarafı yukarı dönük olduğundan emin olun. </li><li> 30 dakika boyunca bir antiseptik lamba altında Yer iskelelerinin sterilize etmek. İstenen fibronektin ya da diğer protein hücre yapışmasını geliştirmek için bir kaplama olarak kullanılırsa. Kat iskelelerinin için üreticinin talimatlarına uyun. </li><li> Hasat Dorsal Kök Ganglia (DRG) gibi daha önce Hollenbeck 32 tarafından tarif. Bir DRG test edilen her iskele kaplı lamel için gerekli olacaktır. </li><li> Oyuklu bir plaka içerisinde her bir platform üzerinde ortam 100-200 ul koyun. Dikkatlice ortam damlacık her bir platform üzerinde bir DRG yerleştirin. Kalın İskele için daha fazla medya gerekli olabilir; DRG tamamen batık ve FLOA değil gerekirting. </li><li> Hücre iskeleti iskelesine yapışmasının sağlanması için 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de iskele ve DRG inkübe edin. </li><li> Kuyunun için uygun seviyeye medyayı doldurun ve geri kuvöz içine yerleştirin. 4-6 gün inkübe devam edin. </li><li> İnkübasyon süresinden sonra, dikkatli bir şekilde, her bir oyuktan ortamını çıkarın ve hafifçe bir kez PBS ile yıkayın. / Hac% 4 paraformaldehid ağırlık ile 30 dakika boyunca hücreleri saptamak. </li><li> Nörofilament bir antikor leke kullanılarak Leke hücreleri. Bu ölçümü için nörit büyümesinin görselleştirme sağlayacaktır. DAPI ayrıca hücrelerin çekirdekleri görüntülemek için kullanılabilir. Bir örnek boyama protokolü Sundararaghavan ve arkadaşları 14 tarafından tarif edilmiştir. </li><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görselleştirmek. <ol><li> Mikroskop sahnede plaka yerleştirin. </li><li> DAPI&#39;nin için filtre ve uyarma ayarları kullanarak hücre kitlesini bulun. </li><li> Hücrenin kez genişletilmiş nevritlerle görselleştirmek için FITC&#39;ye için filtreyi geçiş olduğunu. Utoplamak ve tüm yapıyı görmek için gerekli olduğunca çok fotoğraf birleştirmek mikroskop dikiş fonksiyonu şarkı. DAPI&#39;nin, FITC&#39;ye ve parlak bir alan için tekrarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li>
<li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li>
<li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li>
<li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li>
<li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronzino%2C+JD+%22The+Biomedical+Engineering+Handbook%2C+Third+Edition+-+3+Volume+Set%3A+Tissue+Engineering+and+Artificial+Organs%22">The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs</a>. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).</li>
<li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+nerve+guides%3A+materials%2C+fabrication%2C+growth+factors%2C+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li>
<li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+focus%22%5BJournal%5D)">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li>
<li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li>
<li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications%3A+perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li>
<li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li>
<li>Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li>
<li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li>
<li>Han, D., Gouma, P. -I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li>
<li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li>
<li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li>
<li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery%3A+current+technologies+and+selected+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Péan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).</li>
<li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li>
<li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li>
<li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li>
<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Birçok çalışma, sinir hücreleri, topografik ipuçlarının (fiber hizalama) ve kimyasal uyaranlara (büyüme faktörleri) 1,2,10,11,35 yönettiği edilebileceğini göstermiştir. Elektro uyumlu lifleri oluşturmak için, basit bir yöntemdir. Büyüme faktörleri, sinir büyüme ancak sinir boruları (NC) içine dahil etmek için, uzun süreli salınımı için bir yöntem gereklidir ediyoruz. Her iki ipuçları ile daha sağlam bir sistem oluşturmak için, bu iki sinyal kombine edilmelidir. Çeşitli yöntemler, daha önce sinir rejenerasyonu...

Sinir doku mühendisliği devam eden zorluklardan biri sinirleri doğal olarak yetişen hücre dışı matris, taklit eden bir sinir kanalı (NC) yaratıyor. Araştırma hücreler, mekanik, topografik, yapışkan ve kimyasal sinyaller dahil olmak üzere 1-3 ortamında birçok faktöre yanıt göstermiştir. Bu alandaki başlıca sorunlardan biri, sinyallerin uygun kombinasyonunu belirlemek ve hücre büyümesini desteklemek için 4 uzun bir süre boyunca muhafaza ipuçlarını bir sistem imal edilir. Çevresel nöronlar yumuşak alt-tabakanın tercih ettikleri bilinmektedir hizalanır lifler tarafından yönlendirilebilir ve sinir büyüme faktörü (NGF) 5-7 yanıt. Hafta boyunca kimyasal ipuçları sağlayabilir NC&#39;ler yakın allogreftlere, sinir onarımı 8,9 güncel altın standardın için geliştirilmiş fonksiyonel iyileşmeyi sağlamak için gösterilmiştir. Malzemeler ve üretim yöntemleri, çeşitli mekanik ve topografik üretmek için kullanılabilirdiğerleri 10-13 işaret eder. Mekanik ipuçları 1,13 kritik uygulama için uygun malzeme seçimi yaparak, seçilen malzeme doğasında vardır. Üretim yöntemleri topografik ipuçları faz ayrılması, öz-montaj ve 1,13 electrospinning dahil kontrol etmek. Mikro uygulamalar, mikroflüidik, photopatterning, dağlama, tuz halindeki salamuralar, köpükler ya da gaz için, aynı zamanda 14-17 kullanılabilir. ELEKTROSPİNNİNG nedeniyle esneklik ve üretim 13,18-23 kolaylığı doku kültürü için elyaflı alt mühendisi en popüler yolu olarak ortaya çıkmıştır. Electrospun nanolifler kendini püskürtmek ve boşaltmak için 24, kısa bir aralık üzerinden germek için neden olan polimer solüsyonuna, bir yüksek voltaj uygulanarak imal edilmektedir. Bir hizalanmış iskele topraklanmış döner mandrel üzerine elyafların toplanması ile oluşturulabilir ve bağlantısız iskeleler ve durağan bir plaka 25 üzerinde toplanır. Yapışma sinyal elyaflı skafold wit kaplanması ile elde edilebilirs fibronektin veya 26 electrospinning önce HA gibi RGD gibi bir yapışma peptidi, konjuge. Onlar kontrollü salım için bir kaynak gerekiyor çünkü bu tür büyüme faktörleri gibi kimyasal sinyalleri, uzun dönemler boyunca korumak için en zor. Birçok sistem başarı çeşitli düzeylerde ile electrospun lifli ağlara kontrollü salımını eklemek için denenmiştir. Bu yöntemler harman elektrospinning, emülsiyon elektrospinning, çekirdek-kabuk elektrospinning ve protein konjugasyon 27 içerir. Buna ek olarak, elektro geleneksel olarak bu nedenle proteinin biyo kabul edilmelidir muhafaza, proteinin 28 canlılığını etkileyebilen uçucu bir çözücü içinde yapılır. Bu yaklaşım, özellikle periferik sinir büyüme için ayarlanabilir bir iskele oluşturmak için mekanik, topografik, kimyasal ve yapıştırıcı sinyalleri birleştirerek giderir. İskele mekanik tam sentetize edilmesi ile kontrol edilirMetakrilatlanmış Hyaluronik Asit (HA). Methacrylation siteleri fotoğraf reaktif crosslinkers bağlamak için kullanılır. Çapraz malzeme artık suda çözünür ve münhasıran enzimler 29 tarafından bozuldu. Çapraz bağlama miktarı degradasyon oranı, mekanik ve malzemenin diğer fiziksel özelliklerini değiştirir. ~ 500 Pa arasında bir gerilme modülüne sahiptir methacrylation% 30 ile HA kullanılarak, sinir dokusunun doğal mekanik yakındır ve tipik olarak nöronlar 26,29 tercih edilen yumuşak bir alt-tabakayı oluşturur. Dönen mandrel üzerinde Elektrospinning topografik bir işaret sağlayacak şekilde ayarlanır lifleri oluşturmak için kullanılır. Ile birlikte mikro-elektrospinning kullanma süreleri zarfında iskele içinde kimyasal sinyaller sağlar. Kimyasal sinyali oluşturmak için kullanılan NGF içeren nörit büyüme mikroküreler desteklemek için. NGF üretimi sırasında zorlu çözücüler karşılaşmasa bu yüzden çoğu electrospun malzemelerin aksine HA su içinde çözünür. SCA, yapışkan bir sinyali eklemek içinffold fibronektin ile kaplanır. NGF fibronektin (yapıştırıcı) ile kaplanmış mikroküreler (kimyasal) bırakmadan yumuşak (mekanik) hizalanmış (topografik) lifler: tamamlandı sisteminin yukarıda açıklanan sinyalleri dört türlerini içerir. Üretim ve bu sistemin test bu protokolü tarif edilmiştir. Proses, bir su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyonu ile çift mikrosferlerin üretimi ile başlar. Emülsiyon, bir yüzey aktif madde, polivinil alkol (PVA) ile stabilize edilir. İç su fazı protein içerir. Bu diklorometan (DCM) içinde çözüldü PLGA kabuk malzeme içeren, yağ fazına ilave edilir olarak, yüzey aktif madde DCM proteini koruyan fazlar arasında bir bariyer oluşturur. Bu emülsiyon, mikro kürelerin dış yüzeyini oluşturmak için polivinil alkol içeren bir su fazı içinde dağılmış daha uzundur. Kararlı bir emülsiyon, DCM buharlaşmasını sağlamak için karıştırılır. Durulama ve liyofılleme sonra kuru mikroküreler cont ile bırakılır, geri kalan proteini. Mikroküreler tamamlandıktan sonra onlar iskelelerinin içine electrospun hazırdır. Öncelikle elektro solüsyon hazırlanır. Solüsyonun viskozitesi uygun elyaf formasyonu için çok önemlidir. Saf HA Çözümleri Bu zorunluluğa uymayan; PEO üretebilmektedir izin vermek için bir taşıyıcı polimer olarak ilave edilir. Bu mikrosferler, mikro-dağılmış olan elyaflı yapı iskeleti sonuçlanan çözeltisi ve electrospun eklenir. Üretim işlemi tamamlandıktan sonra, protein, varlığını doğrulamak için test edilmelidir. Bunu yapmak için, NGF&#39;ye tepki veren bir birincil hücre kullanılabilir. Bu protokol, 8-10 günlük tavuk embriyolarından sırt kök gangliyon (DRG) kullanır. Hücre demetleri NGF veya boş olanlar ile dolu küreleri içeren iskelelerinin üzerine ekilir. NGF hala canlı olup olmadığını NGF içeren iskelelerde gelişmiş akson büyümesini görmelisiniz. NGF artık geçerli değilse o olacakdeğil genişletmek için nevritlerle teşvik ve denetime benzer görünmelidir. Burada tarif edilen prosedür, kesin malzeme basit değişiklikler, electrospinning yöntemi ve sistemi, çeşitli doku ve hücre tipleri için optimize edilebilir proteinleri ile, ancak, sinir destek üzerinde odaklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Metakriloksetil tiyokarbamoil rodamin B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Şırınga Pompasında</td> stok çözeltisini hazırlayın <td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Güç Kaynağı</td><td>Gama Yüksek Gerilim</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>Motor</td><td>Triem Elektrik Motorları, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Özel yapım bir mandrele takılmalıdır</td></tr><tr><td>Takometre</td><td>Ağ Aracı Deposu</td><td>ESI-330</td><td>Mandrel hızını</td></tr> <tr><td>izlemek için kullanınKolimasyon adaptörlü Omnicure UV Nokta Kürleme Sistemi</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>İğneler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Polivinil Alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>İzoporopol Alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA</td><td>)Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Sinir Büyüme Faktörü (NGF)</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Poli-Laktik-Glikolik-Asit (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Protein Tahlili</td><td>Termo Bilimsel</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3- (Trimetoksisilil) propil metakrilat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biyoloji</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Klon</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

lifli iskelelerinin içine microspheres ibra elektroeğirme büyüme faktörü

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Bu prosedür, sinir hücresi büyümesini yönlendirmek için çok yönlü bir substrat üretme yöntemini açıklar. Bu sistem mekanik, topografik, yapışkan ve kimyasal sinyalleri içerir. Mekanik özellikler, elektroeğrilmiş lifleri imal etmek için kullanılan malzeme türü tarafından kontrol edilir. Bu protokolde yumuşak lifli bir iskele oluşturmak için ~500 Pa'lık bir gerilme modülüne sahip %30 metakrilatlanmış Hyaluronik Asit (HA) kullanıyoruz. Dönen bir mandrel üzerine elektrospinning yapmak, topografik bir işaret oluşturmak için hizalanmış lifler üretir. Yapışma, iskelenin fibronektin ile kaplanmasıyla sağlanır. Burada ele alınan birincil zorluk, iskelenin derinliği boyunca uzun süreler boyunca kimyasal bir sinyal sağlamaktır. Bu prosedür, Sinir Büyüme Faktörü (NGF) içeren poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikro küreciklerinin üretilmesini ve elektrospinning işlemi sırasında iskelenin bu mikro kürelerle doğrudan emprenye edilmesini açıklar. Yüksek saf kuvvetler ve elektrik yükleri de dahil olmak üzere zorlu üretim ortamı nedeniyle, protein canlılığı üretimden sonra ölçülür. Sistem, 60 günden fazla bir süre boyunca protein salınımı sağlar ve birincil sinir hücresi büyümesini desteklediği gösterilmiştir.

85 üzerinde% protein kapsülleme çapında mikroküreler ± 14 mikron 50 sürekli üretilen ve iskeleler içine electrospun edilmiştir. Ebat üç ayrı üretim serisi ikinci mikro-örnekleri görüntüleme ile saptanmıştır. Ticari laboratuar yazılımı kullanılarak ölçülür bir optik mikroskop ve uzunlukları üzerinde tutulmuş ve görüntüler. Şekil 1 boyut dağılımının bir histogramı gösterir. Encapsulation oranı da üretim sürecinde kaçan protein miktarının tarafından, üç ayrı Microsphere partilerden test edildi. <p clas...

Bu protokol, nöronları yönlendirmek için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmek için elektrospinning ve mikroküreleri birleştirir. Sinir büyüme faktörü PLGA mikroküreleri içinde kapsüllendi ve Hyaluronik Asit (HA) fibröz iskelelere elektrospre edildi. Protein biyoaktivitesi, iskelelerin birincil civciv Dorsal Kök Gangliyonları ile tohumlanması ve 4-6 gün boyunca kültürlenmesi ile test edildi.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Bu prosedürün genel amacı, sinir büyümesini ve onarımını destekleyecek çok yönlü bir ortam oluşturmaktır. Bu, öncelikle büyüme faktörlerinin parçalanabilir mikroküreler içine kapsüllenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, ortamın ana gövdesi için destek malzemesinin hazırlanmasıdır.Ardından, mikroküreler ve destek malzemesi birleştirilir ve hizalı lifli bir iskele oluşturacak şekilde elektro eğirme işlemine tabi tutulur. Son adım, iskelenin piliç dorsal kök gangliyon nöronları ile test edilmesidir. Nihayetinde, nörit büyümesinin ve yönünün kontrollere kıyasla hızlandığını göstermek için immünofloresan mikroskopi kullanılır.Bu sistem, kullanılan proteinler ve materyallerde küçük değişiklikler yapılarak nöral dokular için tasarlanmış olsa da kalp, akciğer ve kemik dahil olmak üzere çeşitli doku türlerine de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamadan önce; gerekli reaktifleri, deiyonize su içerisinde %2 ve %0,5 (ağırlık/hacim) polivinil alkol veya PVA çözeltilerini, %2 (hacim/hacim) izopropil alkol ve deiyonize su çözeltisini ve istenen hidrofilik proteinin sulu çözeltisini hazırlayın. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne 40 ml %0,5'lik PVA çözeltisi koyun ve küçük bir şişede 300 mg %65-35 polilaktik ko-glikolik asit veya PLGA ile 3 ml diklorometanı çözerek kenara ayırın.200 µL protein çözeltisi ile %2 PVA çözeltisinin 4 µL'sini birleştirdiğinizde, PLGA çözünmesini hızlandırmak için bir vorteks karıştırıcı kullanılabilir. Protein PVA karışımını PLGA çözeltisinin içine dökün. Çözeltiler çoğunlukla ayrı kalacaktır.Viyali, yaklaşık 10 watt gücündeki bir W ator kullanarak buzlu su dolu bir behere yerleştirin ve homojen, kremsi beyaz bir emülsiyon oluşana kadar çözeltiyi beş ila 10 saniye boyunca çalkalayın. Emülsiyonu, daha önce hazırlanmış ve %0,5 PVA içeren 50 mililitrelik tüpe dökün. Çözeltiyi bir vorteks karıştırıcıda yüksek hızda yaklaşık 20 saniye boyunca karıştırın.Çözelti bulanık bir görünüm alacaktır. Emülsiyonu 200 mililitrelik bir behere aktarın ve iki dakika boyunca 350 RPM'de bir karıştırıcı plaka üzerine yerleştirin. Karıştırıcı plaka üzerindeki behere 50 mililitre %2 izopropil alkol ekleyin.Klorometanın buharlaşması ve PLGA'nın sertleşmesi için karışımı en az bir saat daha karıştırmaya devam edin. Ardından, mikroküre çözeltisini santrifüj tüplerine aktarın ve 425 ×g hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin. Mikroküreler tüpün dibinde toplanacak ve beyaz görünecektir. Mikrokürelerin üzerindeki süpernatantı tüpten dikkatlice uzaklaştırın ve 500 ml'lik bir şişede saklayın.Her tüpü dörtte üç oranında doldurup mikrosferleri sıvı içerisinde yeniden dağıtmak için çalkalayarak, mikrosferleri deiyonize su ile durulayın. Son durulamanın ardından, süpernatanın santrifüjle uzaklaştırılması ve mikrosferlerin deiyonize su ile durulanması işlemini dört kez tekrarlayın. Süpernatanı uzaklaştırın ve diğer örneklerle birlikte 500 mililitrelik şişeye yerleştirin.Santrifüj tüplerinde toplanan mikroküreleri -20 °C'de gece boyunca dondurun ve ardından en az 24 saat boyunca liyofilize edin. Aşağıdaki elektro eğirme çözeltisi, deiyonize su içerisinde; %2 ağırlık/hacim oranında metakrilatlı hiyalüronik asit (miha), %3 ağırlık/hacim oranında 900 kilodalton polietilen oksit (PEO) ve %0,05 ağırlık/hacim oranında foto başlatıcı çözeltisi kullanılarak önceden hazırlanmalıdır.İstenilen hacimdeki elektro eğirme çözeltisi hazırlandıktan sonra, 400 mg/mL konsantrasyona kadar istenen miktarda mikroküre ekleyin. Mikroküreler çözelti içinde homojen olarak dağılana kadar çözeltiyi bir vorteks karıştırıcıda karıştırın. Çözeltiyi bir şırıngaya aktarın ve altı inçlik 18 gauge küt uçlu iğne takın.Şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin ve saatte 1,2 mililitre verecek şekilde ayarlayın. Mandrel üzerine bir kat alüminyum folyo yapıştırın. Bu işlem, tamamlanmış iskelenin kolayca temizlenmesini ve saklanmasını sağlar.Hizalanmış lifler oluşturmak için döner bir mandrel kullanılır. Yüksek voltajlı güç kaynağından gelen toprak hattını toplama düzeneğine bağlayın. Başarılı bir elektro eğirme işlemi sağlamak için pozitif ucu iğneye bağlayın.Tüm bağlantıların ve ayarların doğru olduğundan emin olmak çok önemlidir. Polimer pompalama işlemini başlatın ve çözelti şırınganın ucunda görünür olduğunda, voltaj kaynağını açarak voltajı 24 kilovolt değerine ayarlayın. İstenen iskele kalınlığına ulaşılana kadar çözeltiyi akıtmaya devam edin.İşlem tamamlandığında, voltaj kaynağını ve şırınga pompasını kapatın. Bu prosedüre başlamak için, elektro eğirme işleminden önce ilgili lamel camları, çıkarılabilir çift taraflı bant yardımıyla elektro eğirme cihazının toplama alanına sabitleyin. Lameller üzerine eğirme yapmak, istenen kalınlığa ulaşıldıktan sonra işlemin kolayca taşınmasını ve incelenmesini sağlar.Önceki video segmentinde gösterildiği gibi, lamelleri mandrellerden dikkatlice çıkarın. İskele kaplı lamelleri şeffaf bir nitrojen haznesine yerleştirin ve tüm oksijenin tahliye edildiğinden emin olun. Hazneyi ve iskeleyi 15 dakika boyunca 10 milliwatt centimeter squared 365 nanometer ışık altında tutun.Çapraz bağlama işleminden sonra, lamel camları uygun boyutlu bir çoklu kuyucuk plakasına yerleştirin. İskele tarafının yukarı baktığından emin olun. Kuyucuk plakasındaki her bir iskelenin üzerine dikkatlice 100 ila 200 µL besiyeri ekleyin.Medya damlacığı içindeki her bir iskelenin üzerine bir dorsal kök ganglionu veya DRG yerleştirin. Kalın bir iskele için daha fazla medya gerekebilir. DRG'nin tamamen batmış olması ve yüzmemesi gerekir.Hücrelerin iskeleye yapışması için iskele ve DRG'yi 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, kuyucuğun uygun seviyesine kadar besiyeri ekleyin. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve inkübasyon süresini takiben dört ila altı gün boyunca inkübe edin.Besiyerini her bir kuyucuktan dikkatlice uzaklaştırın ve PBS ile nazikçe bir kez yıkayın. Hücreleri %4 ağırlık/hacim oranında paraformaldehit kullanarak 30 dakika boyunca fikse edin. Ardından, yerleşmiş bir protokolü izleyerek hücreleri nörofilamentler ve çekirdekler için boyayın.Hücreleri floresan mikroskobu altında görüntülemek için, kuyucuk plakasını mikroskobun tablasına yerleştirin ve dpi için filtre ve uyarılma ayarlarını kullanarak hücre kitlesini bulun. Hücre tanımlandıktan sonra, filtreyi zi olarak değiştirin. Uzamış nöritleri görüntülemek için, tüm yapıyı görebilmek adına gerekli miktarda görüntüyü toplamak ve birleştirmek için mikroskobun stitch (birleştirme) fonksiyonunu kullanın.dpi, fite ve brightfield mikroküreleri için işlemi tekrarlayın. Bu protokol ile çapı 50 ± 14 µm olan ve %85'in üzerinde protein enkapsülasyonuna sahip mikroküreler tutarlı bir şekilde üretilmiş ve elektro-eğirme yöntemiyle iskelelere dönüştürülmüştür. Bu floresan görüntü, PLGA kabuğunda Rod Domine ve içerisinde enkapsüle edilmiş BSA fits bulunan temsilci mikroküreleri göstermektedir.Kapsülleme düzeyini değerlendirmek için mikrosferler BSA ile doldurulmuş ve Bradford protein testi kullanılarak 60 günü aşan bir süre boyunca protein salınımı açısından test edilmiştir. Salınım, başlangıçta ani bir artışla başlar ve ardından elektroeğirme sonrası mikrosferlerin parçalanmasıyla devam eder. Mikrosferler, 3D lifli yapı boyunca görülebilmektedir.Tam iskeletin bu SEM görüntüsünde, küreler oklarla belirtilen birden fazla katman halinde görülebilir. Bu yüksek büyütmeli görüntü, üzerinde iskeletten gelen nanoliflerin bulunduğu bir mikroküreye aittir.İskele içindeki mikrosferlerde bulunan sinir büyüme faktörünün (NGF) canlılığını test etmek için dorsal kök ganglionları veya DRG kullanılmıştır. Burada, mikrosferler içeren bir iskele üzerine yerleştirilmiş DRG'ler görülmektedir. NGF ile yüklü olanlar, protein içermeyen bir mikrosferin yanında gösterilmiştir. NGF iskelesi üzerindeki DRG'lerden uzanan daha uzun nörit uzantıları, NGF'nin canlı olduğunu ve büyümeyi teşvik edebildiğini göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, proteinin mikrosferler içine nasıl kapsülleneceği ve bunların lifli iskelelere nasıl entegre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Polimerlerin doku mühendisliği ve hücre kültürü için elektrospinning süreci, bu makalede ele alınmaktadır. Özellikle multi-polimer elektrospinning photopatterning ve ek işleme yetenekleri ile photoreactive macromers elektrospinning açıklanmıştır.

Doku Mühendisliği ve Hücre Kültürü için Lifli Polimer Yapı iskeleleri elektrospinning

Bağlantısızlar electrospun lifler in vitro nöron büyüme doğrudan ve sinir rejenerasyonu iskeleleri potansiyel bir bileşenidir. Biz electrospun elyaf yüzeyleri ve birincil sıçan E15 duyusal (DRG) ve motor nöronların serum serbest kültür hazırlanması için bir prosedür açıklanmaktadır. Immünsitokimya tarafından nöronların Görselleştirme de dahildir.

Kültür İlköğretim Motor ve Electrospun Poli-L-lactide Nanofiber Yapı iskeleleri Tanımlı Medya Duyu Nöronlar

Elektrospinning iskelelerinin doku mühendisliği uygulamaları için post prodüksiyon işlenebilir. Burada kısırlık (aseptik üretim veya sterilizasyon post prodüksiyon) ulaşmak için ve uygun biyomekanik özellikleri elde etmek için, daha kalın iskeleleri (çoklu katman ısı kullanarak veya buhar tavlama ile) yapmak için, karmaşık iskeleleri (ardışık eğirme) eğirme yöntemleri açıklanmaktadır.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Biyo-uyumlu pH duyarlı sol-jel nanosensors poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskeleleri katılabilecektir. Üretilen kendi-rapor iskeleleri iskelesi üzerinde hücrelerin kültürlenmesi iken microenvironmental durumların in situ izlenmesi için de kullanılabilir. 3D hücresel yapı deneyi bozmadan gerçek zamanlı olarak izlenebilir edildiğinden bu durum yararlıdır.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Tek veya birden fazla hücre dışı matris proteinleri nanolifler ve karmaşık oluşturulan nano elde etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında çeşitli kullanım için ayarlanabilir kompozisyon ve mimarisi ile serbest duran protein bazlı malzemeleri oluşturmak için protein-yüzey etkileşimlerini kullanır.

ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi

Poli (gliserol-dodekanoat) adında yeni bir biyolojik polimerden bir yeni tasarlanmış toplayıcı aracılığıyla daha geniş bir alanı kapsayan mevduat electrospun uzun liflerin (PGD) Sentezi ve fabrikasyon bildirildi. Lifler fare pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücrelerin büyümesini desteklemek mümkün.

Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

Burada, biz liflerin Basamaklandırılmış organizasyonu ile electrospun nanolif iskeleleri imal ve hücre morfolojisi / yönünü düzenleyen kendi uygulamalarını keşfetmek için bir protokol mevcut. Nanolif iskelelerinin fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından Degrade'ler biyomedikal alanındaki uygulamalar geniş bir yelpazede sunuyoruz.

Fiber Teşkilatı geçişleri ile electrospun Nanolif iskeleleri

Biyomalzeme teknolojilerindeki gelişmeler, üç boyutlu çok hücreli tip yapıların geliştirilmesini sağlar. Hava yolu bronşiyol duvarının 3D in vitro modelini sağlamak için hava yolunun ana yapısal hücrelerini kültürlemek için üç ayrı iskele üretmek için elektrospinning protokolleri geliştirdik.

Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için<em&gt; In Vitro</em&gt; Havayolu Wall Modeli

İskele yolu ile electrospinning polimer ile imal için kapsamlı bir kılavuz doğrudan yazma modunda erir bu protokolü hizmet vermektedir. Sistematik olarak işlemi anahat ve hedeflenen iskele mimarileri ulaşmak için uygun parametre ayarlarını tanımlayın.

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

Bu makalede, bir üç-boyut (3D) iskele üzerinden depressurization süperkritiğe CO2 sıvı içine bir geleneksel, iki-boyut (2D) electrospun nanofiber mat genişletme tekniği gösterilir. Bu artar iskele 3D, yakından kopyalama hücresel nanotopographic yardımlar, vardır ve biyolojik moleküllerin nanofibers içinde kapsüllenmiş işlevlerini korumak.

İki boyut Electrospun Nanofiber paspaslar genişleme içine üç-boyut iskele

Öğrenin elektrospinning ve mikrokürelerle sinir onarımı için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmeyi. Bu yöntem, büyüme faktörlerinin kontrollü salınımıyla nöronal büyümeyi destekler ve Dorsal Root Ganglia hücreleriyle test edilmiştir.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

Daha fazla video keşfet