Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Bu prosedürün genel amacı, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare dört beynindeki intern nöronları hedeflemektir. Bu, önce enjeksiyon iğnelerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, anestezi uygulanmış hayvandan embriyonik zincirin çıkarılmasıdır.

Daha sonra beyinde DNA enjeksiyonu ve elektroporasyon yapılır. Son adım, hayvanın ameliyattan sonra iyileşmesine izin vermektir. Sonuç olarak, uteroda, nöronlar arası alt tiplerin seçici olarak hedeflenmesine izin vermek için elektroporasyon kullanılır.

Mevcut tekniklerimizin bu yöntemlerinin avantajı, utero elektro operasyonda spesifik olmayan gibi, kortikal inter nöronların bir alt kümesinin hücre otonom analizini gerçekleştirmek için araçlar sağlamasıdır. Yüksek GFP ekspresyon seviyeleri, tekli interlerin görselleştirilmesine ve analizine izin verir. Bu yöntem, olgunlaşma arasındaki entegrasyonu yöneten kuralların neler olduğu gibi nörogelişimsel alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu işleme başlamak için, bir pipet çektirme ile bir cam kılcal damarı çekerek mikroenjeksiyon pipetini hazırlayın. Daha sonra, kılcal damarı dikkatlice çıkarın ve mikroenjeksiyon için alt iğneyi toplayın. Şimdi, anestezi uygulanmış bir hamile fareyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.

Ameliyat boyunca flor sağlamaya devam edecek bir maske ile kaderini örtün. Ardından her iki göze de göz kayganlaştırıcı uygulayın. Daha sonra hipotermiyi önlemek için ısıtma yastığını 36 santigrat dereceye ayarlayın.

Arka pençeleri veya kuyruğu sıkıştırarak ayak ve kuyruk reflekslerinin olup olmadığını kontrol edin. Daha sonra, karın üzerindeki cildi% 70 etanol ile temizleyin. Cildi yukarı doğru çekmek için forseps kullanın.

Ardından, üçüncü ve dördüncü meme bezi çiftlerinin ortasından başlayarak orta hat boyunca iki santimetrelik küçük bir dikey kesi yapın. Yuvarlak forseps kullanarak karın duvarına zarar vermemeye dikkat edin. Embriyonik zinciri yavaşça boşluktan uzaklaştırın.

Zinciri ıslak mendillerin üzerinde dinlendirin. Uterusun yarısını açığa çıkararak başlayın. Daha sonra diğer yarısına geçmeden önce embriyoların elektroporasyonuna devam edin.

Bu prosedürde, standart bir maxi prep saflaştırma protokolünden elde edilen peleti damıtılmış suda çözerek DNA solüsyonu hazırlayın. Daha sonra, enjeksiyon sırasında görselleştirmeye izin vermek için DNA çözeltisine bir ila 20 oranında hızlı yeşil ekleyin. Ardından, önceden çekilmiş bir mikro pipetin ucunu, omzun başından ucun sonuna kadar altı milimetre bırakacak şekilde ince forseps ile kesin.

Daha sonra, mikro pipeti enjeksiyon için hızlı yeşil olan bir mikrolitre DNA çözeltisi ile yükleyin. Embriyonun başını yuvarlak cımbızla tutun. Pipeti beyne 45 derece açıyla, orta hattın yakınında bulunan lateral ventrikülü hedefleyerek yerleştirin.

İğne ventrikülden geçerse, pipeti yavaşça geri çekin. Çözelti doldurmaya başladığında ventrikül yeşile dönmelidir. Bu noktada, pipeti hareket ettirmeyi bırakın ve bir mikrolitre DNA enjekte edin.

Ardından pipeti yavaşça geri çekin. ECM eight 30 ator'ı, 950 milisaniyelik darbeler arası aralıklarla aralıklı 5 adet 45 voltluk darbeye ayarlayın. Verimli akım iletimi sağlamak için beş milimetrelik kürek elektrotlarını PBS'ye batırın.

Daha sonra elektrot kanatlarını, DNA solüsyonunu içeren ventrikül üzerine pozitif bir kürek ile embriyonun başının etrafına yerleştirin. Ganglionik çıkıntılar boyunca bir ventral akım oluşturmak için pozitif küreği negatif olandan biraz daha aşağıya yerleştirin. Bu, parametal hücrelerde ektopik ekspresyonu en aza indirecektir.

Şimdi ayak pedalına bir kez basarak bir darbe verin, ardından elektrotları çıkarın ve silerek temizleyin. Embriyoların her biri için adımları tekrarlayın. Tüm embriyoları elektro olarak inceledikten sonra.

Karın boşluğuna üç mililitre PBS dökün ve embriyoları karın boşluğuna geri koyun. Daha sonra, karın duvarını kavisli bir iğne ve beş oh ipek sütür ile ve ardından cildi dikin. Yara üzerine lidokain uygulayın ve analjezi için intital olarak kilogram aspirin başına 120 miligram uygulayın.

Hayvanı anestezi tüpünden çıkarın ve bir kağıt mendil üzerinde ısıtma yastığı üzerinde iyileşmeye izin verin. Bundan sonra, hayvanı kafese geri koyun. 37 santigrat derecede ısıtma yastığı üzerinde tutun ve sağlık durumunu izleyin.

Bu deneyde, elektroporasyonlu inter nöronlar, CGE E'den türetilmiş alt tip belirteçlerinin ekspresyonu ile tanımlanmıştır. Bu görüntü, CGE'den türetilen inter nöronların bir DLX beş altı EGFP plazmidi ile elektroporasyona uğradığını göstermektedir. Bu görüntü, P sekizde inter nöronu ifade eden bir VIP'yi göstermektedir.

EGFP ekspresyonu, tek nöronların tüm dendritik ağacını ve aksonal çardağını tanımlar ve burada P sekizde inter nöronu eksprese eden bir NPY vardır. NP y ekspresyonu, nöroglia form hücrelerini tanımlar. Son olarak, burada P 15'te inter nöronu eksprese eden bir NPY var.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 20 dakika içinde yapılabilir. Spesifik plazmit ve genetik olarak modifiye edilmiş fare çizgilerinin kullanımını birleştirerek, ilgilenilen genlerin ekspresyonunda zamansal ve özel kontrol elde etmek mümkündür. Bazı deneylerde, AU'ya bağımlı transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için A-D-L-X-T-T-A plazmidi kullanıyoruz.

Bu deneylerde, doksisiklin uygulayarak transgenin ekspresyonunu susturuyoruz.