Name: Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Öğrenin, gelişen fare ön beynindeki kortikal internöron alt tiplerini in utero elektroporasyon ile hedeflemeyi. Bu yöntem, seçici gen ekspresyonu sağlayarak nörogelişim araştırmalarında hücre özerk analizler yapılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz teknik yardım için Lihong Yin minnettarız. NVD bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü bir alıcı ve aynı zamanda NIH (5 K99 MH095825-02) hibe tarafından desteklenmektedir. Fishell laboratuarında Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ruh Sağlığı (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09) Ulusal Enstitüsü, Nörolojik Bozukluklar ve İnme (5 R01 NS081297-02 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen 1 P01 NS074972 -01A1) ve Simons Vakfı.

Tüm hayvanlar Tıp NYU Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu yönetmelik ve yönergelere uygun olarak tedavi edildi. Fare Suşlar Taconic tarafından sağlanan İsviçre Webster dişi farelerine, bu deneylerde kullanıldı. Özellikle yüzeysel katman hedef nöronları için, embriyolar E15.5 kullanılmıştır. Not: standart klonlama teknikleri kullanılarak elde edilen bu çalışma (Dlx5 / 6.eGFP plazmid 3 ug / ml) kullanılan plazmid. EGFP cDNA Dlx5 / 6-Pmin-Poli A plazmidi içine klonlandı. Bu plazmid istek (demarn02@nyumc.org) üzerine mevcuttur. Mikroenjeksiyon Pipetler hazırlanması 1. <ol><li> 860 çektirmesi Isı 2. ayarlayın. </li><li> Yerleştirin ve filamanın yakın cam kılcal sabitleyin. Pipet dış çapı (OD) kabaca 30 mikron olup olmadığını kontrol edin. </li><li> &quot;Çekme&quot; düğmesine basın. </li><li> Dikkatlice kılcal çıkarın. Taban kısmı, bir iğne. Üst kısmını atın. </li></ol> 2. Anestezi Prosedürü <ol><li> Izofluran içeren odayı hazırlayın. Not: İsofluranın nedeniyle hızlı hareket ve yan etki azlığı için tercih edilen anestezi olduğunu. Pentobarbital başka bir seçenektir; Bununla birlikte, bu ilaç tolerans değişkendir ve izofluran daha yüksek bir ölüm oranına neden olabilir. </li><li> 0.5-1 L / dk O 2% 4-5 kadar izofluran akışını ayarlayın. </li><li> Kafa adaptörü için vana kapalı iken odası için vanasının açık olduğundan emin olun. </li><li> Odacık içinde hamile fare yerleştirin. </li><li> Fare anestezi etkisi altında gitmek için izin verin. Bu yaklaşık 2-3 dakika sürer. Solunum hızını kontrol edin. Fare ım başlarsa, izofluran dozunu. </li><li> Fare anestezi sonra derhal, bölmeden çıkarın. Isıtma yastığı ventral tarafta yerleştirin ve iameliyat boyunca izofluran tedarik etmeye devam edecek maskesi kafasını nsert. Kafa adaptörü bağlantı parçasını boru odacıktan izofluran akışını değiştirmek için emin olun. Her gözün göz yağlayıcı bir damla koyun ve gözlerinizi kapatın. </li><li> Hipotermi en aza indirmek için 36 ° C dereceye ısıtma yastığı ayarlayın. </li><li> Arka pençeleri ve kuyruk kısma ayak ve kuyruk reflekslerin yokluğu kontrol edin. </li></ol> 3. Cerrahi <ol><li> % 70 etanol ile karın kapsayan cildi temizlemek. </li><li> Yukarı cilt çekmek için forseps kullanabilir. Her ameliyat sonrası, deterjan ve su ile tüm enstrümanları yıkayın ve 72 ° CO / N sterilize. </li><li> Meme bezlerinin üçüncü ve dördüncü çiftleri arasındaki yarıda başlayan orta hat boyunca küçük bir düşey kesi (yaklaşık 2 cm) olun. Ince cerrahi makas kullanın. Karın duvarına zarar değil dikkat edin. </li><li> Yavaşça periton cilt ayırmak. </li><li> Arterleri görselleştirmekve karın duvarı üzerinde damarlar. Karın boşluğuna maruz (damarları kaçınarak) karın zarı aracılığıyla başka bir 2 cm kesi yapın. </li><li> Arterleri sıkma kaçınarak her tarafta deri ve karın duvarı Kelepçe. Not: arterler yanlışlıkla delinirse, servikal çıkık veya izofluran doz aşımı yaparak hayvanı hemen kurban. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar ısınmaya öncesi steril PBS. Kim mendil nemli PBS ile kelepçeleri örtün. </li><li> PBS ile maruz karın boşluğuna nemlendirir. Ameliyat yaparken bu adımı birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Yuvarlak forseps kullanarak, yavaşça uzak boşluğundan embriyonik zinciri (E15.5) çekin. Islak mendillerin üzerindeki zincir ömür. Birinci rahim yarısını ortaya başlayın. Içinde embriyolar elektroporasyona sonra,, içine geri getirmek ardından ikinci yarıda çalışır. </li></ol> 4. Elektroporasyon <ol><li> Embriyolar işlemek için yuvarlak forseps kullanmaya devam edin. </li><li> Viyanal ventriküller sualize. Orta hat (Şekil 1b) boyunca çalıştırın lateral ventriküller. </li><li> Hızlı Yeşil (Stok:% 10 ağ / hac) eklemek için, bir 01:20 karışım için DNA solüsyonuna enjeksiyon sırasında görselleştirmek için. Damıtılmış su içinde standart bir maksi-hazırlık saflaştırma protokolü elde edilen pelet eritilerek DNA solüsyonu hazırlayın. </li><li> Hızlı Yeşil DNA çözeltisi (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ml) 1 ml enjekte etmek için bir piston ile önceden çekilmiş mikropipetler kullanın. Pipet yüklemeden önce bir iğne ucunun sonuna omuz başlangıcından 6 mm uzunluk bırakmak için iyi bir forsepsle # 5 (Dumont) ile mikropipet ucu kesilir. Yuvarlak cımbız ile embriyo baş tutun. Orta hat yakınında bulunan lateral ventrikül amaçlayan bir 45 ° açıyla pipet ile beyin girin. İğne ventrikül ile nüfuz Eğer DNA enjekte pistonu kullanabilirsiniz gibi, yavaş yavaş pipet çekin. Ventrikül yeşile ne zamançözüm doldurmak başlar. Bu noktada, pipet hareket durdurmak ve DNA 1 ml enjekte edilir. Yavaşça, pipet çekilme. </li><li> 950 msn ile aralıklı 50 milisaniye beş 45V bakliyat CUY21 elektrogözenekleme ayarlayın. </li><li> E15.5 embriyolar 5 mm raket elektrotları kullanın. Etkili akım iletimi sağlamak için PBS içinde elektrotlar batırın. </li><li> DNA çözümü içeren ventrikül olumlu kürek ile embriyonun başının etrafında elektrot kürekler. Biraz ganglionik tubera ile ventral akım yaratmak için negatif bir saygı ile pozitif raket indirin. Bu manipülasyon piramidal hücrelerinde ektopik ifadesini minimize edecektir. </li><li> Elektrotlar yerleştirerek sonra, bir kez ayak pedalına basarak bir darbe teslim. </li><li> Elektrotları çıkarın ve temiz silin. Tekrar her bir embriyo ile 4,6-4,9 adımları. </li><li> Tüm embriyolar electroporating sonra, karın boşluğuna PBS 3 ml dökün ve karın boşluğunda onları geri. </li><li>Üretim dikiş iğnesi ve kavisli bir 5-0 ipek dikiş ipliği daha sonra deri ile karın duvarı. Yaranın üzerine Lidokain (% 4) uygulayın. Analjezi için Aspirin içi periton 120 mg / kg yönetmek. Not: Bütün işlem 20 dakika veya daha kısa yapılmalıdır. Bu yeni başlayanlar sadece kısa çalışma süresini tutmak için bir kaç embriyolar electroporate önerilir. Uzun süreli ameliyatlar embriyoların hayatta kalma oranını azaltacaktır. </li><li> Anestezi borudan hayvan çıkarın ve bir kağıt üzerinde ısıtma yastığı kurtarma silin sağlar. </li><li> , Kafes hayvan dönün 37 ° C&#39;de ısıtma yastığı üzerinde tutmak ve sağlık durumunu izlemek. Hayvanlar genellikle ameliyat iyi tolere ve anestezi tüp çıkarılır kısa bir süre sonra yavaş yavaş hareket etmeye başlar. Aşırı kanama ya da uyuşukluk görülürse, IACUC gibi servikal dislokasyon veya anestezi doz aşımı gibi ötenazi prosedürleri onaylanmış gerçekleştirerek hemen hayvan kurban. </li><li> Viva kafesi dönrium. Dişiler daha doğum doğal verecektir. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Tekniğin Sınırlamalar Bu teknik, hücre süreçlerinin hücre özerk analizi için sağlar, bu popülasyon analizi için uygun değildir. Electroporations beyin başına elektropore az bin hücreleri ile çok seyrek. Bunun bir sonucu olarak, bu teknik CGE türetilmiş internöron genetik manipülasyon kaynaklanan davranış sonuçlarını değerlendirmek için kullanılamaz. Elektroporasyon E13.5-E14.5 hedef MGE türetilmiş alt tiplerinde üzerinden taşınan, verimliliği düşük 10&#39;du...

Kortikal GABAerjik internöronlar toplu medial ve kaudal ganglion eminences (sırasıyla MGE ve JMO) adında iki geçici embriyonik yapılarından kaynaklanan 4. Parvalbumin ve somatostatin ifade internöron internöron JMO&#39;ya kaynaklanan ifade Kalretinin ise MGE (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) ve Reelin (Re) köken. Bu interneuron alt tipler kendi doğum günlerinin ile ayırt edilebilir. MGE türetilmiş alt tipler embriyonik gün 9.5 (E9.5) ve e16.5 5,6 arasında doğarlar. Buna karşılık, JMO türetilmiş internöron üretim E15.5 6 seviyesinde zirve ile E18.5 yoluyla E12.5 doğar. Bu geç doğdu nüfusun genetik hedefleme, ancak, zor kalır. Kemirgen distal-az (Dlx) genler sadece gelişmekte olan ventral önbeyin 3 olarak ifade edilmiştir. GABAerjik internöron ve striatum projeksiyon nöronları değil, kortikal piramidal hücreleri Dlx1 ifade, Erken gelişim evrelerinde 3 de 2,5, ve 6 genler. Gerçekten de, dlx genlerinin hepsi GABA&#39;erjik atalarda MGE ve CGE subventricular (SVZ&#39;una) olarak ifade edilmiştir. Bu genlerin sentezlenmesi postmitotik aşamalarında 7-9 de alt tiplerini belirlemek için kısıtlanır. Önceki deneysel kanıtlar Dlx5 / 6 arttırıcı bir eleman transgenik fare modellerinde 2 GABAerjik soy seçici hedefleme için izin verdiğini gösterdi. Bu, gelişmekte olan fare beyin epizomal ifade bağlamında bu zenginleştirici elemanların birinin kullanılmasını test edilmiştir. Bir minimal promotör ve Bluescript (BS) omurga plasmid olarak gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) (Şekil 1) ile birlikte Dlx5 / 6 güçlendirici elemanın alt klonlandı. Burada özellikle Cr, VIP hedef E15.5 rahimde elektroporasyon suretiyle plazmid tanıtıldı ve Yeniden 3,8,10 alt tip. Bizim teknik kolaylaştırır seyrek elektroporasyon, sağlarateşten hücrelerin morfolojik özellikleri yeniden. Buna ek olarak, kortikal nöronlarda GABAerjik gen ekspresyonu son derece yüksek seviyelerde fonksiyonel çalışmalarda da sağlar. Biz kaybı ve çeşitli yabani tip ve dominant negatif genler 11 ile fonksiyon testleri kazancını gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Pedallı elektroporatör</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5 mm kürek elektrotları&nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma yastığı&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Aletleri P30 Çektirme&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Anestezi Sistemleri</td><td>Harvard Aparatı</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Ameliyat Makası 4.75" Düz Keskin/Keskin</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 İpek Siyah Örgü 18" C-1 Kutu 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Forseps Uygulayan Mikro Klips 5.5"</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Kelepçe makası</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Tutma forsepsi&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal boru&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borozil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID</td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

kortikal internöronlar alt tip-selektif elektroporasyon

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Merkezi sinir sistemi (CNS) olgunlaşma çalışma sinirsel genetik hedefleme dayanır. Bununla birlikte, özel nöron alt tiplerine ilgi genlerinin ekspresyonunu kısıtlama görev nedeniyle spesifik promoter elementlerinin nispeten kıt olması oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. GABA&#39;erjik internöron geniş genetik ve morfolojik çeşitliliği olan bir nöronal nüfus oluşturmaktadır. Gerçekten de, GABAerjik internöron fazla 11 farklı alt tipi fare korteksi 1 ile karakterize edilmiştir. Burada GABAerjik nüfus seçici hedefleme için uyarlanmış bir protokol mevcut. Bu homeobox transkripsiyon enhanser elemanını kullanarak, GABAerjik internöron alt tip seçici olarak hedeflenmesini elde utero elektroporasyon spesifik genlerin ekspresyonunu ile sürücü ve Dlx5 Dlx6, Drosophila uzak-az (DLL) geni 2,3 homologlarını, faktörüdür.

Biz olgunlaşan nöronların hücre tipi özel hedefleme ulaşmak için utero elektroporasyon tekniği adapte. CGE türevi internöronlarda eGFP ekspresyonunu tahrik etmek için, Dlx5 / 6 güçlendirici eleman ikinci ve E15.5 için enjeksiyon sınırlı aşama CGE türetilmiş internöronlar çoğunluğu oluştuğunda. Biz de P8 analizi gerçekleştirilir ve P15 11 (Şekiller 1 ve 2). Biz E15.5 eşit molar konsantrasyonlarda CAG-mCherry ve Dlx5 / 6-EGFP plazmidler elekt...

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Bu prosedürün genel amacı, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare beynindeki ara nöronları hedeflemektir. Bu işlem, öncelikle enjeksiyon iğnelerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise embriyonik zincirin anestezi uygulanmış hayvandan çıkarılmasıdır.Ardından beyne DNA enjeksiyonu ve elektroporasyon uygulanır. Son adım, hayvanın cerrahi işlemden sonra iyileşmesine izin vermektir. Nihayetinde, in utero elektroporasyon, internöron alt tiplerinin seçici olarak hedeflenmesini sağlamak için kullanılır.Mevcut tekniklerimizden olan spesifik olmayan utero elektro-operasyon gibi yöntemlerin avantajı, kortikal internöronların bir alt kümesinin hücre otonom analizini gerçekleştirmek için gerekli araçları sağlamasıdır. Yüksek GFP ekspresyon seviyeleri, tekil internöronların görselleştirilmesine ve analizine olanak tanır. Bu yöntem, olgunlaşan internöronların entegrasyonunu yöneten kuralların neler olduğu gibi nörogelişim alanıdaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu prosedüre başlamak için, bir pipet çekici ile cam bir kapiler çekerek mikroenjeksiyon pipetini hazırlayın. Ardından, kapileri dikkatlice çıkarın ve mikroenjeksiyon için alt iğneyi alın. Şimdi, anestezi uygulanmış gebe bir fareyi karın bölgesi yukarı bakacak şekilde ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.Hastaneye boyunca izofluran sağlamaya devam edecek bir maske ile ağzını ve burnunu kapatın. Ardından her iki göze göz kayganlaştırıcı uygulayın. Hipotermiyi önlemek için ısıtma pedini 36 °C'ye ayarlayın.Arka patileri veya kuyruğu sıkarak ayak ve kuyruk reflekslerinin yokluğunu kontrol edin. Ardından, karın bölgesindeki cildi %70 etanol ile temizleyin. Cildi yukarı doğru çekmek için pens kullanın.Ardından, üçüncü ve dördüncü meme bezi çiftlerinin ortasından başlayarak orta hat boyunca iki santimetrelik küçük bir dikey insizyon yapın. Yuvarlak pens kullanarak karın duvarına zarar vermemeye dikkat edin. Embriyonik zinciri nazikçe boşluktan dışarı çekin.Zinciri ıslak mendillerin üzerinde bekletin. İlk olarak uterusun bir yarısını açığa çıkarın. Ardından, diğer yarıya geçmeden önce embriyoların elektroporasyonunu gerçekleştirin.Bu prosedürde, standart bir maxi prep saflaştırma protokolünden elde edilen pelet distile suda çözülerek DNA çözeltisi hazırlayın. Ardından, enjeksiyon sırasında görünürlüğü sağlamak için DNA çözeltisine 1:20 oranında fast green ekleyin. Sonrasında, önceden çekilmiş bir mikro pipetin ucunu, omuz başlangıcından ucun sonuna kadar altı milimetre kalacak şekilde ince bir pensle kesin.Ardından, enjeksiyon için mikro pipeti, fast green içeren bir mikrolitre DNA çözeltisi ile doldurun. Embriyonun baş kısmını yuvarlak cımbızla tutun. Pipeti, orta hatta yakın konumlanan lateral ventrikülü hedefleyerek 45 derecelik açıyla beyne yerleştirin.İğne ventrikülün içinden geçerse, pipeti yavaşça geri çekin. Çözelti ventrikülü doldurmaya başladığında, ventrikül yeşile dönmelidir. Bu noktada, pipeti hareket ettirmeyi bırakın ve bir mikrolitre DNA enjekte edin.Ardından pipeti nazikçe geri çekin. ECM 30 elektroporatörü, 950 ms'lik darbe arası aralıkla 50 ms süreli 5 adet 45 V voltaj darbesine ayarlayın. Akımın etkili bir şekilde iletilmesini sağlamak için beş milimetrelik palet elektrotları PBS'ye batırın.Ardından, DNA çözeltisini içeren ventrikülün üzerine pozitif ped gelecek şekilde elektrot pedlerini embriyonun başının etrafına yerleştirin. Ganglionik eminensler boyunca ventral bir akım oluşturmak için pozitif pedi negatif olanın biraz daha altına yerleştirin. Bu işlem, parametal hücrelerdeki ektopik ekspresyonu minimize edecektir.Şimdi ayak pedalına bir kez basarak bir darbe uygulayın, ardından elektrotları çıkarın ve temizleyin. Bu adımları her bir embriyo için tekrarlayın. Tüm embriyoların elektroporasyonu tamamlandıktan sonra.Karın boşluğuna üç mililitre PBS dökün ve embriyoları karın boşluğuna geri yerleştirin. Ardından, kavisli bir iğne ve 5-0 ipek sütür ile önce karın duvarını, sonra da cildi dikin. Yara üzerine lidokain uygulayın ve analjezi için başlangıç olarak kilogram başına 120 miligram aspirin uygulayın.Hayvanı anestezi tüplerinden çıkarın ve kağıt havlu üzerindeki ısıtma pedinde iyileşmeye bırakın. Ardından, hayvanı kafesine geri koyun. Hayvanı 37 °C'deki ısıtma pedinde tutun ve sağlık durumunu izleyin.Bu deneyde, elektropore edilmiş inter nöronlar, CGE kaynaklı alt tip markerlarının ekspresyonu ile belirlenmektedir. Bu görüntü, CGE kaynaklı inter nöronların bir DLX 5/6 EGFP plazmidi ile elektropore edildiğini göstermektedir. Bu görüntü, P8 aşamasındaki VIP eksprese eden bir inter nöronu göstermektedir.EGFP ekspresyonu, tekil nöronların tüm dendritik ağacını ve aksonal dallanmasını belirginleştirir; burada P8 evresindeki NPY eksprese eden bir internöron görülmektedir. NPY ekspresyonu, nörogliaform hücreleri belirginleştirir. Son olarak, burada P15 evresindeki NPY eksprese eden bir internöron yer almaktadır.Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde 20 dakikada tamamlanabilir. Spesifik plazmidlerin ve genetiği değiştirilmiş fare hatlarının kullanımı birleştirilerek, ilgilenilen genlerin ekspresyonunda zamansal ve mekansal kontrol sağlamak mümkündür. Bazı deneylerde, AU bağımlı transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için A-D-L-X-T-T-A plazmidi kullanmaktayız.Bu deneylerde, doksisiklin uygulayarak transgen ekspresyonunu susturuyoruz.

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Bu video, bir dizi in vitro hipokampal dilim kültürü boyunca hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlardaki genlerin tek hücreli elektroporasyonu için protokolü göstermektedir. Teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır.

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon: Beyin Hipokampal Dilimlerinde Hedeflenen Nöronların İçine Plazmitleri Vermek İçin İn Vitro Bir Teknik

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Burada, erken doğum sonrası farelerin korteksine nakledilen kortikal internöron atalarının aktivitesini manipüle etmek için kemogenetik araçları kullanmak üzere tasarlanmış bir protokol sıyoruz.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Burada, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyon ile akut genetik manipülasyonunu sunuyoruz. Bu kortikal organoid modeller, ventrikül benzeri yapılar dilimlemeden sonra kolayca tanımlanabildiğinden, insan kortikal gelişiminin, nörogelişimsel bozuklukların ve kortikal evrimin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağladığından, enjeksiyona özellikle uygundur.

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Öğrenin, gelişen fare ön beynindeki kortikal internöron alt tiplerini in utero elektroporasyon ile hedeflemeyi. Bu yöntem, seçici gen ekspresyonu sağlayarak nörogelişim araştırmalarında hücre özerk analizler yapılmasına olanak tanır.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet