Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare beynindeki ara nöronları hedeflemektir. Bu işlem, öncelikle enjeksiyon iğnelerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise embriyonik zincirin anestezi uygulanmış hayvandan çıkarılmasıdır.

Ardından beyne DNA enjeksiyonu ve elektroporasyon uygulanır. Son adım, hayvanın cerrahi işlemden sonra iyileşmesine izin vermektir. Nihayetinde, in utero elektroporasyon, internöron alt tiplerinin seçici olarak hedeflenmesini sağlamak için kullanılır.

Mevcut tekniklerimizden olan spesifik olmayan utero elektro-operasyon gibi yöntemlerin avantajı, kortikal internöronların bir alt kümesinin hücre otonom analizini gerçekleştirmek için gerekli araçları sağlamasıdır. Yüksek GFP ekspresyon seviyeleri, tekil internöronların görselleştirilmesine ve analizine olanak tanır. Bu yöntem, olgunlaşan internöronların entegrasyonunu yöneten kuralların neler olduğu gibi nörogelişim alanıdaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu prosedüre başlamak için, bir pipet çekici ile cam bir kapiler çekerek mikroenjeksiyon pipetini hazırlayın. Ardından, kapileri dikkatlice çıkarın ve mikroenjeksiyon için alt iğneyi alın. Şimdi, anestezi uygulanmış gebe bir fareyi karın bölgesi yukarı bakacak şekilde ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.

Hastaneye boyunca izofluran sağlamaya devam edecek bir maske ile ağzını ve burnunu kapatın. Ardından her iki göze göz kayganlaştırıcı uygulayın. Hipotermiyi önlemek için ısıtma pedini 36 °C'ye ayarlayın.

Arka patileri veya kuyruğu sıkarak ayak ve kuyruk reflekslerinin yokluğunu kontrol edin. Ardından, karın bölgesindeki cildi %70 etanol ile temizleyin. Cildi yukarı doğru çekmek için pens kullanın.

Ardından, üçüncü ve dördüncü meme bezi çiftlerinin ortasından başlayarak orta hat boyunca iki santimetrelik küçük bir dikey insizyon yapın. Yuvarlak pens kullanarak karın duvarına zarar vermemeye dikkat edin. Embriyonik zinciri nazikçe boşluktan dışarı çekin.

Zinciri ıslak mendillerin üzerinde bekletin. İlk olarak uterusun bir yarısını açığa çıkarın. Ardından, diğer yarıya geçmeden önce embriyoların elektroporasyonunu gerçekleştirin.

Bu prosedürde, standart bir maxi prep saflaştırma protokolünden elde edilen pelet distile suda çözülerek DNA çözeltisi hazırlayın. Ardından, enjeksiyon sırasında görünürlüğü sağlamak için DNA çözeltisine 1:20 oranında fast green ekleyin. Sonrasında, önceden çekilmiş bir mikro pipetin ucunu, omuz başlangıcından ucun sonuna kadar altı milimetre kalacak şekilde ince bir pensle kesin.

Ardından, enjeksiyon için mikro pipeti, fast green içeren bir mikrolitre DNA çözeltisi ile doldurun. Embriyonun baş kısmını yuvarlak cımbızla tutun. Pipeti, orta hatta yakın konumlanan lateral ventrikülü hedefleyerek 45 derecelik açıyla beyne yerleştirin.

İğne ventrikülün içinden geçerse, pipeti yavaşça geri çekin. Çözelti ventrikülü doldurmaya başladığında, ventrikül yeşile dönmelidir. Bu noktada, pipeti hareket ettirmeyi bırakın ve bir mikrolitre DNA enjekte edin.

Ardından pipeti nazikçe geri çekin. ECM 30 elektroporatörü, 950 ms'lik darbe arası aralıkla 50 ms süreli 5 adet 45 V voltaj darbesine ayarlayın. Akımın etkili bir şekilde iletilmesini sağlamak için beş milimetrelik palet elektrotları PBS'ye batırın.

Ardından, DNA çözeltisini içeren ventrikülün üzerine pozitif ped gelecek şekilde elektrot pedlerini embriyonun başının etrafına yerleştirin. Ganglionik eminensler boyunca ventral bir akım oluşturmak için pozitif pedi negatif olanın biraz daha altına yerleştirin. Bu işlem, parametal hücrelerdeki ektopik ekspresyonu minimize edecektir.

Şimdi ayak pedalına bir kez basarak bir darbe uygulayın, ardından elektrotları çıkarın ve temizleyin. Bu adımları her bir embriyo için tekrarlayın. Tüm embriyoların elektroporasyonu tamamlandıktan sonra.

Karın boşluğuna üç mililitre PBS dökün ve embriyoları karın boşluğuna geri yerleştirin. Ardından, kavisli bir iğne ve 5-0 ipek sütür ile önce karın duvarını, sonra da cildi dikin. Yara üzerine lidokain uygulayın ve analjezi için başlangıç olarak kilogram başına 120 miligram aspirin uygulayın.

Hayvanı anestezi tüplerinden çıkarın ve kağıt havlu üzerindeki ısıtma pedinde iyileşmeye bırakın. Ardından, hayvanı kafesine geri koyun. Hayvanı 37 °C'deki ısıtma pedinde tutun ve sağlık durumunu izleyin.

Bu deneyde, elektropore edilmiş inter nöronlar, CGE kaynaklı alt tip markerlarının ekspresyonu ile belirlenmektedir. Bu görüntü, CGE kaynaklı inter nöronların bir DLX 5/6 EGFP plazmidi ile elektropore edildiğini göstermektedir. Bu görüntü, P8 aşamasındaki VIP eksprese eden bir inter nöronu göstermektedir.

EGFP ekspresyonu, tekil nöronların tüm dendritik ağacını ve aksonal dallanmasını belirginleştirir; burada P8 evresindeki NPY eksprese eden bir internöron görülmektedir. NPY ekspresyonu, nörogliaform hücreleri belirginleştirir. Son olarak, burada P15 evresindeki NPY eksprese eden bir internöron yer almaktadır.

Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde 20 dakikada tamamlanabilir. Spesifik plazmidlerin ve genetiği değiştirilmiş fare hatlarının kullanımı birleştirilerek, ilgilenilen genlerin ekspresyonunda zamansal ve mekansal kontrol sağlamak mümkündür. Bazı deneylerde, AU bağımlı transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için A-D-L-X-T-T-A plazmidi kullanmaktayız.

Bu deneylerde, doksisiklin uygulayarak transgen ekspresyonunu susturuyoruz.