Name: İki-Foton In vivo Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Öğrenin, inceltilmiş kafatası hazırlığı ve iki-foton mikroskobu kullanarak canlı fare korteksinde dendritik dikenlerin dinamiklerini görüntülemeyi. Bu yöntem sinaptik yapıların uzun süreli izlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz grafik gösterim için James Perna teşekkür ederim. Bu çalışma YZ Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü hibe tarafından desteklenmiştir

Onay cerrahi ve görüntüleme araştırmanın başlamasından önce eve kurumlardan elde edilmesi gerekmektedir. Bu yazıda anlatılan deneyler University of California, Santa Cruz Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. 1. Cerrahi <ol><li> Tüm cerrahi aletler otoklav ve iyice ameliyat öncesi% 70 alkol ile çalışma alanını sterilize. </li><li> KX anestetik çözeltisi (200 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg ksilazin) intraperitonal (IP) enjeksiyon ile fare anestezisi fare vücut ağırlığına göre Not:. KX doz sağlık durumu suşu, yaşa göre ayarlanmış edilebilir ve Farelerin. Optimum dozun belirlenmesi için veteriner danışmanlık da tavsiye edilir. </li><li> Farenin ayak basarak ve anestezi durumunu izlemek için refleksif bir tepki için kontrol ederek periyodik bir ayak tutam testini gerçekleştirin.Fare tamamen ameliyat başlamadan önce anestezi emin olun Not:. Uzun görüntüleme oturumları sırasında, gerekirse ek KX yönetmek, periyodik fare anestezi durumunu kontrol edin. </li><li> Ameliyat sırasında vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. </li><li> Kafa derisi maruz bir jilet kullanarak fare başını tıraş. </li><li> Alkol pedleri ve betadine alternatif ile cildi silerek traş alanı sterilize edin. Herhangi bir kalıntı saç kupürleri çıkarın. </li><li> Yavaşça bu nedenle deney sırasında dehidratasyon neden olduğu kalıcı hasarı önlemede, hem gözleri yağlamak için göz merhemi uygulanır. </li><li> Kafa derisinin orta hat boyunca düz bir kesi yapmak ve kafatasının kenarlarına doğru yanal cildi taşıyın. </li><li> Kafatasına bağlı bağ doku çıkarın. </li></ol> 2.. Inceltilmiş-kafatası Hazırlık <ol><li> Ster dayalı görüntüleme bölgeyi tespit. eotaxic koordinatlar Not: büyük kan damarları, blok ışık penetrasyonunu önlemek ve görüntülü yapıları bulanıklık çalışın. Kafatası steril tuzlu su ile nemli olduğunda damarsal iyi görülmektedir. </li><li> Kafatasının (0.5-1.0 mm çapında) ince bir dairesel bölgeye yüksek hızlı mikro matkap kullanın. Yerine kafatası karşı tutarak ve bastırarak yerine, kafatası yüzeyi matkap paralel hareket. Matkap dış kompakt kemik tabakası ve orta süngerimsi kemik tabakası hem kadar kaldırılır Not:. Aşırı ısınma nedeniyle zarar görmesini önlemek için, matkap ile kafatası arasındaki uzun süreli temasından kaçının. </li><li> Matkap-inceltilmiş bölgenin merkezinde bir mikrocerrahi bıçak ile iç kompakt kemik tabakası inceltme devam edin. Bir eşit yaklaşık bir kalınlığı olan küçük bir bölge (200-300 mikron çapında) inceltilmiş kadar kafatası karşı basmadan kafatası kazımak için yaklaşık 45 ° &#39;lik bir açı ile mikro bıçak tutunly 20-30 mikron elde edilir. . Nedeniyle kafatasının bir oto-floresan için, kalınlığı iki foton mikroskop altında Not kafatasının üst ve alt yüzey arasındaki mesafeyi tarama ile ölçülebilir: en az 20 um bir kalınlığı kafatası iyi bir görüntü kalitesi sağlar, ancak, daha sonraki yeniden görüntüleme oturumları incelme süreci zorlaştırır çünkü bu tavsiye edilmez. Aşırı inceltme önlemek için, kafatası kalınlığı (Tartışma) ameliyat sırasında periyodik olarak kontrol edilmesi gerekmektedir. </li></ol> 3. Immobilizasyonu <ol><li> Dikkatle kemik enkaz kaldırmak. </li><li> Otoklavlanmış olan steril kafa plakası, merkezi açıklığın her bir kenarında siyanoakrilat yapıştırıcı bir damla (bkz. Şekil 1) koyun. . Açıklığın ortasına Not bulunan inceltilmiş bölge ile kafatası sıkıca kafa plakası tutun: Tutkal, inceltilmiş r karışması durumundakazara egion, mikrocerrahi bıçak ile dikkatlice çıkarın. </li><li> Yavaşça kafa plakasının merkezi açıklığın kenarlarına kafatası taraftan deri çekin. </li><li> Kafa plakası de kafatası bağlı olduğu kadar, yaklaşık 10 dakika bekleyin. </li><li> (Bkz. Şekil 1) tutma plakasının iki yan bloklar üzerinde kafa plaka koyun ve ardından tutma plaka üzerinde fare hareketsiz kafa plakasının kenarları üzerinde vidaları sıkın Not:. Arasında deri ya da bıyık olduğundan emin olun vidaları sıkmadan önce kafa plaka ve blokları. Hayvanın geri hafifçe dokundu zaman iyi bir hareketsiz preparat mikroskop altında, kafatası gözlenebilir bir hareket göstermelidir. </li><li> . Polimerleşmemiş tutkal kaldırmak için tuzlu su ile maruz kafatası durulayın Not: polimerleşmemiş tutkal görüntüleri buğulu ve zarar hedeflerini mikroskop gibi, kalan tutkal kaldırmak için önemlidir &lt;./ Li&gt; </ol> 4. Görüntüleme <ol><li> (Bkz. Şekil 2) sonraki görüntüleme oturumlarda görüntülü bölgeyi taşınmaya kullanılan Haritası 1, gibi inceltilmiş bölge ile maruz kafatası damar bir fotoğraf çekin. </li><li> Görüntüleme mikroskop altında fare yerleştirin. Epifloresans kullanarak 10X hava objektif altında inceltilmiş alan bulmak ve bakış merkezine ince alanı taşımak. </li><li> Kafatasının üst tuzlu bir damla ekleyin ve steril su ile durulanır edilmiş 60X objektif, geçin. Bireysel dendritik dikenler açıkça dendritler boyunca görüntülenmiştir bir bölge seçin. Belirlemek ve epifluorescent görünümü ve damarsal fotoğraf arasındaki damarsal karşılaştırarak Haritada 1 ilgili bölgeyi etiket. </li><li> Fluorophores göre Ayarlama iki-fotonlu lazer dalga boyu. Örneğin, YFP için 920 nm; GFP için 890 nm; DsRed ve tdTomato 24 için 1,000 nm. </li><li> 2 ile görüntü yığınlarını Edinme60X objektif kullanılarak z-ekseni boyunca um adımlar. Bu görüntü yığını yaklaşık 200 mikron x 200 mikron alanı (512 x 512 piksel) kapsar ve (bkz. Şekil 2) sonraki görüntüleme oturumları sırasında tehcir için 2 Haritası olarak kullanılır. </li><li> 3X dijital zoom kullanarak 2 Haritası içinde dokuz görüntü yığınlarını edinin. . Her bir görüntü yığını z ekseni boyunca not 0,7 um adımlarla 70 um x 70 um (512 x 512 piksel) yaklaşık bir alanı kaplamaktadır: fototoksisite en aza indirmek için örnekler hızda ölçüldüğünde lazerin yoğunluğu 40 mW altında olmalıdır. </li></ol> 5. Kurtarma <ol><li> Görüntüleme ardından, yavaşça kafatası kafa plaka ayırmak. </li><li> İyice kafatası ve tüm kalan tutkal kaldırmak için cilt temizlemek Not:. Ciltte herhangi bir kalan tutkal tahrişe neden ve kafatası üzerinde kalan tutkal kafatasının erozyon ve neden olurken cilt iyileşme yavaşlarngiogenesis yeni yetişen kemik tabakasında, daha sonraki tehcir ve yeniden görüntüleme zorlaştırır. </li><li> Kafatası ve tuzlu birkaç kez cildi durulayın. </li><li> Steril cerrahi sütür ile kafa derisi dikin. </li><li> Ayrı bir kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde hayvan tutun. Post-operatif ağrı azaltmak için deri altına buprenorfin analjezik (0.1 mg / kg) yönetmek. Tam iyileşme sonra eve kafesine hayvan dönün. Kesi iyileşmiş ve dikişler kadar (günde en az bir kez kontrol edin) yakından hayvan izleyin. Gerekirse buprenorfin analjezik sonraki enjeksiyonları yönetmek. </li></ol> 6. Tekrar görüntü <ol><li> Tekrarlayın 1,1-1,8 adımları. </li><li> Tekrar 3,1-3,6 adımları </li><li> 1 Harita için damar desen ve 2 Harita için dendritik şube desen karşılaştırarak daha önce görüntülenmiş bölgeyi bulun. </li><li> Tekrar görüntü alma 1 hafta içinde gerçekleştirilirse, inceltilmiş yeniden üstüne yeni çıkan kemik ince tabakayı kaldırmak için adım 2.3 tekrarlayınmikrocerrahi bıçak kullanarak dür. Tekrar görüntü alma fazla 1 hafta sonra gerçekleştirilirse, Adım 2.2 ve 2.3 hem de tekrar Not:. Yeni çıkan kemik tabaka azaltılmış resim kalitesine neden orijinal kompakt kemik tabakası ile karşılaştırıldığında, daha az yoğunlaştırılmış bir yapı oluşur. Bu nedenle, aynı kaliteyi elde etmek için, bir önceki görüntüleme oturumu biraz daha ince kafatası için gereklidir. </li><li> Daha önce iki foton mikroskop altında görüntü yığınlarını çekilen eşleşme görüntü yığınlarını elde etmek için konumunu ve yönünü ayarlayın. </li><li> Adım 4.6 gibi görüntü kazanır. </li><li> Tekrar görüntüleme sonra 5,1-5,5 adımları. </li></ol>

<ol><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+plasticity+in+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li>
<li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+looking+beyond+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li>
<li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+and+long-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li>
<li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li>
<li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li>
<li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li>
<li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li>
<li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Başarılı bir inceltilmiş kafatası hazırlık elde etmek için, bu protokolde birkaç adım çok önemlidir. 1) kafatası kalınlığı. Kafatası kemiği, iki yüksek yoğunluklu kompakt kemik tabakaları ve düşük yoğunluklu süngersi kemiğin bir orta tabaka ile, bir sandviç yapıya sahiptir. Yüksek hızlı mikro delme kompakt kemik ve süngersi kemiğin dış katmanlarını çıkarılması için uygun olmakla birlikte, mikrocerrahi bıçak kompakt kemik iç tabaka inceltme için idealdir. Gelişim sırasında kafatası artar kalınlığı ve sertliği gibi, yetiş...

Memeli korteks duyusal algı ve hareket kontrolü soyut bilgi işleme ve biliş, birçok beyin fonksiyonları katılır. Çeşitli kortikal işlevleri nöronların farklı iletişim ve bireysel sinaps bilgi alışverişi oluşur farklı sinirsel devreler, üzerine inşa. Sinapsların yapısı ve işlevi sürekli deneyimleri ve patolojiler yanıt modifiye ediliyor. Olgun Beyinde, sinaptik plastisite oluşumu ve fonksiyonel bir nöral bakımında önemli bir rol oynayan, kuvvet değişiklikler ve sinaps ekleme / kaldırma hem şeklini alır. Dendritik dikenler, memeli beyninde uyarıcı sinapsların çoğunluğunun postsinaptik bileşenleridir. Sürekli ciro ve dikenler morfolojik değişimler sinaptik bağlantıları 1-7 modifikasyon iyi bir göstergesi olarak hizmet inanılmaktadır. Iki-fotonlu lazer tarama mikroskopi kalın, opak hazırlıkları ve sağlam 8 beyin canlı görüntüleme için uygun hale düşük fototoksisite aracılığıyla derin nüfuz sunuyor. Floresan etiketleme ile birlikte, iki-foton görüntüleme yaşayan beyin içine gözetleme ve yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip bireysel sinapsların yapısal reorganizasyon takip için güçlü bir araç sağlar. Çeşitli yöntemler, canlı görüntüleme 9-13 için fareler hazırlamak için kullanılmıştır. Burada, biz fare kortekste postsinaptik dendritik dikenler yapısal plastisite araştırmak için in vivo iki foton görüntüleme bir inceltilmiş-kafatası hazırlanmasını açıklar. Bu yaklaşımı kullanarak, bizim yeni çalışmalar, floresanla işaretlenmiş alt-nöronal ve in vivo etiketleme teknikleri hızlı bir gelişme ile transgenik hayvanların artan durumu ile öğrenme, motor beceri tepki olarak dendritik omurga değişikliklerin bir dinamik resim tasvir var, burada açıklanan benzer prosedürler de uygulanabilir araştırılmakte başka hücre tipleri ve kortikal bölgelerinde, diğer manipülasyonlar ile birlikte, hem de 16-23 hastalık modellerinde kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>Anestezi için ksilazin ile karıştırılmış</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Lloyd laboratuvarları</td><td>139-236</td><td>Anestezi için ketamin ile karıştırılmış</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>Enjeksiyon ve görüntüleme için% 0.9 NaCl</td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>72000</td><td>Çift kenarlı paslanmaz çelik tıraş bıçakları</td></tr><tr><td>Alkol pedleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Steril alkol hazırlama pedleri</td></tr><tr><td>Göz merhemi</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>Petrolatum oftalmik merhem steril oküler kayganlaştırıcı</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı mikro matkap</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18000-17</td><td>Yüksek hızlı mikro matkap, kompakt kemiğin dış tabakasını inceltmek ve küçük bir alanı hedeflemek için uygundur</td></tr><tr><td>Mikro matkap çelik çapaklar</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>19007-14</td><td>1,4 mm çap</td></tr><tr><td>Mikrocerrahi bıçak</td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>Mikrocerrahi bıçak, kompakt kemiğin iç tabakasını ve süngerimsi kemiğin orta tabakasını inceltmek için uygundur</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9062131</td><td>Kafa plakasını kafatasına sabitleyin</td></tr><tr><td></td><td>Sütür Havard Aparatı</td><td>510461</td><td>Emici olmayan, steril ipek sütür, 6-0 monofilament</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Infinity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İki foton mikroskobu</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X objektif</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 0.30, hava</td></tr><tr><td>60X objektif</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1.1, IR geçirgen, suya daldırma</td></tr><tr><td>Ti-safir lazer</td><td>Spektrum-Fizik</td><td></td><td>Mai Tai HP</td></tr></tbody></table>

İki-foton<em&gt; in vivo</em&gt; bir inceltilmiş-kafatası hazırlık kullanarak fare cortex dendritik dikenler görüntüleme

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Memeli kortekste, nöronlar son derece karmaşık ağları ve sinaps bilgi alışverişi oluşturur. Sinaptik gücü, hem de sinaps ekleme / kaldırma değişiklikleri, nöronal plastisite yapısal temel sağlayan, bir deneyim bağımlı bir şekilde meydana gelir. Kortekste en uyarıcı sinapsların postsinaptik bileşenleri olarak, dendritik dikenler sinaps iyi bir vekil olarak kabul edilir. Fare genetik ve floresan etiketleme teknikleri, bireysel nöronlar ve bunların sinaptik yapılarının alarak avantajları sağlam beyinde etiketli olabilir. Burada in vivo zamanla floresan etiketli postsinaptik dendritik dikenler takip için iki-foton lazer tarama mikroskobu kullanarak bir Transkranial görüntüleme protokolü tanıtmak. Bu protokol sağlam kafatası tutar ve menenjlerin maruz kalma ve korteks tarafından kaynaklanan inflamatuar etkileri ortadan kaldıran inceltilmiş-kafatası hazırlık, kullanır. Bu nedenle, görsel su sonra hemen elde edilebilirrgery gerçekleştirilir. Deneysel prosedür saat yıla kadar değişen çeşitli zaman aralıklarında tekrar tekrar yapılabilir. Bu preparatın Bu uygulama aynı zamanda, fizyolojik ve patolojik koşullar altında, değişik bölge ve kortikal katmanları, hem de diğer hücre türlerini araştırmak için genişletilebilir.

YFP-H hattı farelerde 25&#39;de, sarı floresan protein kortekstekinden yüzeysel tabakalarına apikal dendrit çıkıntı tabaka V piramidal nöronlar, bir alt grubunda ifade eder. Inceltilmiş-kafatası hazırlık, floresan etiketli dendritik kesimleri hkr saatten ay arasında değişen çeşitli görüntüleme aralıklarında iki foton mikroskop altında görüntülenebilir. Burada bireysel dikenleri yanı sıra filopodia açıkça dendrit boyunca görselleştirilebilen bir 1 aylık fare, motor kortekste 8 gün boyunca aynı dendritler bir d...

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Bu prosedürün genel amacı, iki foton mikroskopisi ile canlı fare korteksindeki floresan işaretli sinaptik yapıların transkraniyal görüntülenmesini sağlamaktır. Fareyi anesteziye aldıktan sonraki ilk adım, inceltilmiş kafatası hazırlama işlemini gerçekleştirmektir. Ardından, farenin başı özel yapım bir tutma plakası kullanılarak sabitlenir.Ardından, iki foton mikroskobu kullanılarak inceltilmiş kafatası üzerinden görüntü yığınları elde edilir. Son olarak, daha önce görüntülenen bölgenin yeniden konumlandırılması ve görüntülenmesi, dendritik dikenlerin dinamiklerinin çeşitli koşullar altında farklı zaman dilimleri boyunca izlenmesine olanak sağlamıştır.Cerrahiye hazırlık için, bir fareyi ketamin ve ksilazin ile anestezi edin ve tam anestezi sağlandığından emin olmak için ayak parmağı sıkıştırma testi yapın. Ardından fareyi bir ısıtma pedine yerleştirin ve baş bölgesini tıraş etmek için bir jilet kullanın. Tıraş edilen alanı sterilize etmek ve kalan kıl parçalarını temizlemek için cildi sırayla alkollü pedlerle silin.Ayrıca, her iki göze nazikçe göz merhemi uygulayın. Ardından, kafa derisinin orta hattı boyunca düz bir insizyon yapın ve deriyi kafatasının kenarlarına doğru yanlara çekin. Daha sonra, inceltilmiş kafatası hazırlığına başlamak için kafatasına bağlı bağ dokusunu temizleyin.İlk olarak, orta hatta ve bgma'ya göre konumunu belirleyerek istenen görüntüleme bölgesini tanımlayın. Ardından, ışık geçirgenliğini engelleyip görüntü yapılarını bulanıklaştırdıkları için büyük kan damarlarının bulunduğu bir bölgede kafatasını inceltmekten kaçınmak amacıyla, vaskülarizasyonu gözlemlemek için kafatasını salin ile nemlendirin. 0,5 ile 1 mm çapında bir alan seçildikten sonra, kafatasının dairesel bir bölgesini inceltmek için yüksek hızlı bir mikro matkap kullanın.Aşırı ısınmanın neden olabileceği hasarı önlemek için matkabı kafatasına yaslayıp aşağı doğru bastırmak yerine, kafatası yüzeyine paralel şekilde hareket ettirin. Dış kompakt kemik tabakası ve orta süngerimsi kemik tabakası tamamen kaldırılana kadar, matkap ucu ile kafatası arasındaki temasın uzun süreli olmasından kaçının. Ardından, matkapla inceltilmiş bölgenin merkezindeki iç kompakt kemik tabakasını inceltmek için yaklaşık 45 derecelik açıyla tutulan bir mikrocerrahi bıçak kullanın.Kafatası üzerine bastırmadan, 200 ila 300 mikrometre çapında ve yaklaşık 20 ila 30 mikrometre kalınlığında homojen bir şekilde inceltilmiş bir bölge elde edilene kadar kazıyın. Kafatası yeterince inceltildiğinde, kemik kalıntılarını dikkatlice temizleyin. Bir sonraki adım, keskin kenarları bantlarla kapatılmış jiletlerden yapılmış olan kafa plakasının takılmasıdır.Kafa plakasının merkez açıklığının her kenarına küçük bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı sürerek başlayın. Ardından kafa plakasını inceltilmiş bölgeye ortalayın. Plakayı kafatasına sıkıca bastırın.Şimdi, deriyi kafatasının yanlarından kafa plakasının merkezindeki açıklığın kenarlarına doğru nazikçe çekin. Kafa plakasını bir ila iki dakika boyunca yerinde tutun. Ardından, kafa plakası kafatasına iyice yapışana kadar sekiz ila dokuz dakika daha bekleyin.10 dakika sonra, baş plakasını tutucu plakanın iki yan bloğunun üzerine yerleştirin. Ardından, fareyi tutucu plaka üzerinde sabitlemek için baş plakasının kenarlarındaki vidaları sıkın. Başın düzgün şekilde sabitlendiğinden emin olmak için farenin sırtını hafifçe destekleyerek farenin kafasına bir diseksiyon mikroskobu ile bakın.Ardından, daha önce görüntülenen bölgeyi yeniden belirlemek amacıyla, polimerize olmamış yapıştırıcı kalıntılarını temizlemek için açıkta kalan kafatasını salin ile durulayın. Sonraki görüntüleme oturumlarında, harita bir olarak tanımlanan açıkta kalan kafatasının inceltilmiş bölgesindeki vaskülatürün bir fotoğrafını çekin. Daha sonra fareyi görüntüleme mikroskobunun altına yerleştirin ve 10 x hava objektifi altında inceltilmiş alanı bulun.Epi floresans kullanarak, en ince alanı görüş alanının merkezine getirin. Şimdi kafatasının üst kısmına bir damla salin ekleyin ve 60 x objektife geçin. Dendritler boyunca tekil dendritik dikenlerin net bir şekilde görüntülendiği bir bölge seçin.Epi-floresan görünüm ile vaskülarite fotoğrafı arasındaki damarlanmayı karşılaştırarak bir numaralı harita üzerindeki ilgili bölgeyi belirleyin ve işaretleyin. Ardından, iki foton lazer dalga boyunu floroforlara göre ayarlayın. Daha sonra 60x objektif kullanarak, Z ekseni boyunca 2 µm adımlarla, yaklaşık olarak 200 µm x 200 µm'lik bir alanı kapsayan görüntü yığınları edinin.Burası harita iki olarak belirlenmiştir ve sonraki görüntüleme oturumları sırasında dendritik segment görüntüsünün yeniden konumlandırılması için kullanılır. Şimdi üç x dijital zoom kullanarak harita iki içerisinde dokuz görüntü yığını edinin. Her bir görüntü yığını, Z ekseni boyunca 0.7 µm adımlarla yaklaşık 70 µm x 70 µm'lik bir alanı kapsar.Görüntüleme işleminin ardından, baş plakasını kafatasından nazikçe ayırın. Ardından, kafatasında kalan yapıştırıcıyı temizlemek için mikrocerrahi bıçak kullanın. Daha sonra kafatasını ve cildi birkaç kez serum fizyolojik ile durulayın ve saçlı deriyi steril cerrahi sütürlerle dikin.İyileşme sürecinde, hayvanı ayrı bir kafeste ısıtma pedinin üzerinde tutun ve ameliyat sonrası ağrı için cilt altına buprenorfin analjezik uygulayın. Tam iyileşme sağlandıktan sonra, hayvanı ana kafesine geri döndürün. Başka bir günde dendritlerin görüntülemesini tekrarlamak için hayvanı anesteziye alın ve kafatasını açığa çıkarın. Daha önce olduğu gibi, baş plakasını monte ederek ve onu tutucu plakaya sabitleyerek baş immobilizasyonunu tekrarlayın.Ardından, damarlanma paternini birinci harita ile ve dendritik dallanma paternini ikinci harita ile karşılaştırarak daha önce görüntülenen bölgeyi bulun. Yeniden görüntüleme bir hafta içinde gerçekleştirilirse, yeni oluşmuş ince kemik tabakası mikrosurgical bistüri ile kaldırılabilir. Yeniden görüntüleme bir haftadan daha uzun süre sonra gerçekleştirilirse, kafatasını inceltmek için önce mikro matkabı, ardından mikrosurgical bistüriyi kullanın.Şimdi, daha önce alınan görüntü yığınlarıyla eşleşen görüntü yığınları elde etmek için iki foton mikroskobu altındaki konumu ve yönelimi ayarlayın. Görüntüler alındıktan sonra, farenin toparlanmasına izin verin ve onu daha önce olduğu gibi kafesine geri koyun; harita bir olarak belirlenen ince kafatası bölgesini çevreleyen vasküler paternin görüntüsü, sonraki tüm görüntüleme oturumlarına referans olarak kullanılır. Siyah kutu, iki foton in vivo görüntülerin alındığı bölgeyi göstermektedir.Bir aylık bir farenin motor korteksindeki dendritik dalları gösteren bu görüntü harita iki olarak belirlenmiştir. Beyaz kutu, görüntüleme için seçilen dendritik segmenti göstermektedir. Zaman içerisinde, aynı dendritik segmentin sıfırıncı gün, ikinci gün, dördüncü gün ve sekizinci günde iki foton görüntülemesi yapılmıştır.Yeni oluşmuş dikenler. Önceki görüntüleme oturumunda mevcut olmayan dikenler ok ucuyla, görüntüleme oturumları arasında yok olan dikenler ise oklarla gösterilmiştir. Filipodlar yıldızlarla belirtilmiştir.Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında bir ila iki saat içinde tamamlanabilir.

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir...

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Biz milimetre yayılan ve beyin iltihabı olmadan ay dayanır farenin kafatasında bir görüntüleme penceresi oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem de iki foton mikroskopi kullanılarak kan akımı, hücresel dinamiği ve hücre / vasküler yapının uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

Cilalı ve takviyeli ince kafatası (portlar) kraniyal pencere ve glioblastoma (GBM) hücre enjeksiyonu birleştirerek, glioma inisiyasyon ve uzunlamasına bir canlı fare beynindeki enjekte GBM hücreleri büyüme gözlemleyebilirsiniz.

Görüntüleme Glioma Başlatma<em&gt; In Vivo</em&gt; Bir Parlak ve Takviyeli İnce kafatası Kranial Pencere arkası

Kaynak: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY Doku Temizleme ile Sağlam Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu videoda, konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak dendritik direkleri, omurga morfolojisini ve nöronal dağılımı incelemek için temizlenmiş bir fare beyninin hazırlanmasını, görüntülenmesini ve analizini gösteriyoruz.

Temizlenmiş Bir Fare Beyninde Sağlam Dendritik Arbors ve Omurga Morfolojisinin Konfokal Mikroskopi Görüntülemesi

Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Murine hipokampustaki dendritik dikenleri görüntülemek ve analiz etmek için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM) uygulanır.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Öğrenin, inceltilmiş kafatası hazırlığı ve iki-foton mikroskobu kullanarak canlı fare korteksinde dendritik dikenlerin dinamiklerini görüntülemeyi. Bu yöntem sinaptik yapıların uzun süreli izlenmesini sağlar.

İki-Foton

Daha fazla video keşfet