İki-Foton In vivo Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, iki foton mikroskobu ile canlı fare korteksinde floresan olarak işaretlenmiş sinaptik yapılar olan transkraniyal görüntülemeye izin vermektir. Fareyi uyuşturduktan sonraki ilk adım, inceltilmiş bir kafatası hazırlığı yapmaktır. Daha sonra, farenin kafası özel yapım bir tutma plakası kullanılarak hareketsiz hale getirilir.

Daha sonra iki foton mikroskobu kullanılarak inceltilmiş kafatası aracılığıyla görüntü yığınları elde edilir. Sonuçta, yer değiştirme ve görüntüleme. Daha önce görüntülenen bölge, dendritik dikenlerin dinamiklerinin çeşitli koşullar altında farklı zaman dilimleri boyunca izlenmesine izin verdi.

Ameliyata hazırlanmak için, bir fareyi ketamin ve ksilazin ile uyuşturun ve tam anesteziyi sağlamak için bir ayak parmağı çimdikleme yapın. Ardından fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve kafayı tıraş etmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Tıraşlı alanı sterilize etmek ve kalan saç kırpıntılarını gidermek için cildi alternatif alkollü pedlerle silin.

Ayrıca, her iki göze de nazikçe göz merhemi sürün. Ardından, kafa derisinin orta hattı boyunca düz bir kesi yapın ve cildi yanal olarak kafatasının kenarlarına doğru hareket ettirin. Ardından, inceltilmiş kafatası hazırlığına başlamak için kafatasına bağlı bağ dokusunu çıkarın.

İlk olarak, orta hatta ve bgma'ya göreceli konumuna göre istenen görüntüleme bölgesini tanımlayın. Ardından, ışık penetrasyonunu engellediği ve görüntü yapılarını bulanıklaştırdığı için büyük kan damarlarının bulunduğu bir alanda kafatasının incelmesini önlemek için damar sistemini gözlemlemek için kafatasını tuzlu suyla nemlendirin. 0,5 ila bir milimetre çapında bir alan seçildikten sonra, kafatasının dairesel bir bölgesini inceltmek için yüksek hızlı bir mikro matkap kullanın.

Aşırı ısınmanın neden olduğu hasarı önlemek için matkabı kafatasına karşı tutmak ve aşağı bastırmak yerine kafatası yüzeyine paralel olarak hareket ettirin. Hem dıştaki kompakt kemik tabakası hem de orta süngerimsi kemik tabakası çıkana kadar matkap ucu ile kafatası matkabı arasında uzun süreli temastan kaçının. Daha sonra, matkapla inceltilmiş bölgenin ortasındaki iç kompakt kemik tabakasını inceltmek için yaklaşık 45 derecede tutulan bir mikrocerrahi bıçak kullanın.

Yaklaşık 20 ila 30 mikrometre kalınlığında 200 ila 300 mikrometre çapında eşit şekilde inceltilmiş bir bölge elde edilene kadar kafatasına bastırmadan kafatasını kazıyın. Kafatası yeterince inceltildikten sonra, kemik kalıntılarını dikkatlice çıkarın. Bir sonraki adım, bantlarla kaplanmış keskin kenarlı tıraş bıçaklarından yapılmış kafa plakasını takmaktır.

Kafa plakasının orta açıklığının her iki kenarına küçük bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı koyarak başlayın. Daha sonra kafa plakasını inceltilmiş bölge üzerinde ortalayın. Kafatasına sıkıca tutun.

Şimdi, cildi kafatasının yanlarından baş plakasının orta açıklığının kenarlarına doğru yavaşça çekin. Kafa plakasını bir ila iki dakika yerinde tutun. Ardından, kafa plakası kafatasına iyice takılana kadar sekiz ila dokuz dakika daha bekleyin.

10 dakika sonra, kafa plakasını tutma plakasının iki yan bloğuna yerleştirin. Ardından, fareyi tutma plakası üzerinde hareketsiz hale getirmek için kafa plakasının kenarlarındaki vidaları sıkın. Başın düzgün bir şekilde hareketsiz hale getirildiğinden emin olmak için farenin sırtını nazikçe doldururken farenin kafasına diseksiyon mikroskobu ile bakın.

Daha sonra, daha önce görüntülenen bölgeyi yeniden konumlandırmak için polimerize edilmemiş yapıştırıcıyı çıkarmak için kafatasını tuzlu suyla donatın. Sonraki görüntüleme seanslarında, açıkta kalan kafatasının incelmiş bölgesinin damar sisteminin bir fotoğrafını çekin, bu da harita bir olarak adlandırılır. Ardından fareyi görüntüleme mikroskobunun altına yerleştirin ve inceltilmiş alanı 10 x hava objektifinin altına yerleştirin.

Epi floresan kullanarak, en ince alanı görünümün merkezine taşıyın. Şimdi kafatasının üst kısmına bir damla tuzlu su ekleyin ve 60 x hedefine geçin. Tek tek dendritik dikenlerin dendritler boyunca net bir şekilde görüntülendiği bir bölge seçin.

Epi floresan görünümü ile damar sistemi fotoğrafı arasındaki damar sistemini karşılaştırarak ilgili bölgeyi harita birde tanımlayın ve etiketleyin. Ardından, iki foton lazer dalga boyunu floro dörtlüsüne göre ayarlayın. Daha sonra 60 x objektifi kullanarak, yaklaşık 200 mikrometreye 200 mikrometrelik bir alanı kaplayan Z ekseni boyunca iki mikrometre adımlı görüntü yığınları elde edin.

Bu, harita iki olarak belirlenmiştir ve sonraki görüntüleme oturumları sırasında görüntü dendritik segmentinin yerini değiştirmek için kullanılır. Şimdi üç x dijital yakınlaştırma kullanarak ikinci haritada dokuz görüntü yığını elde edin. Her görüntü yığını, Z ekseni boyunca 0,7 mikrometrelik adımlarla yaklaşık 70 mikrometreye 70 mikrometrelik bir alanı kaplar.

Görüntülemeyi takiben, kafa plakasını kafatasından nazikçe ayırın. Ardından, kalan yapıştırıcıyı kafatasından çıkarmak için bir mikrocerrahi bıçak kullanın. Daha sonra kafatasını ve cildi birkaç kez tuzlu su ile durulayın ve kafa derisini steril cerrahi dikişlerle dikin.

İyileşme sırasında, hayvanı ayrı bir kafeste bir ısıtma yastığı üzerinde tutun ve postoperatif ağrı için deri altına buprenorfin analjezik uygulayın. Tamamen iyileştikten sonra, hayvanı ev göstergesine geri koyun Başka bir gün dendritleri yeniden görüntülemek için hayvanı uyuşturun ve kafatasını açığa çıkarın. Daha önce olduğu gibi, kafa plakasını monte ederek ve tutma plakasına takarak kafa immobilizasyonunu tekrarlayın.

Ardından, vaskülatür desenini birinci haritayla ve dendritik dal desenini ikinci haritayla karşılaştırarak daha önce görüntülenen bölgeyi bulun. Bir hafta içinde yeniden görüntüleme yapılırsa, yeni çıkan kemikteki ince tabaka mikrocerrahi bıçak ile çıkarılabilir. Bir haftadan daha uzun bir süre sonra yeniden görüntüleme yapılırsa, kafatasını inceltmek için önce mikro matkabı, ardından mikrocerrahi bıçağı kullanın.

Şimdi, daha önce çekilen görüntü yığınlarıyla eşleşen görüntü yığınları elde etmek için iki foton mikroskobu altındaki konumu ve yönü ayarlayın. Görüntüleri aldıktan sonra, farenin iyileşmesine ve daha önce olduğu gibi kafesine geri dönmesine izin verin ve sonraki tüm görüntüleme oturumlarına referans vermek için harita bir olarak belirlenen ince kafatası alanını çevreleyen vasküler desenin bir görüntüsü kullanılır. Kara kutu, iki foton in vivo görüntünün elde edildiği bölgeyi gösterir.

Bir aylık bir farenin motor korteksindeki dendritik dalların bu görüntüsü, harita iki olarak belirlenmiştir. Beyaz kutu, görüntüleme için seçilen dendritik segmenti gösterir. Zamanla, sıfırıncı günde, ikinci günde, dördüncü günde ve sekizinci günde aynı dendritik segmentten iki foton görüntülemesi yapıldı.

Yeni oluşan dikenler. Yani, bir önceki görüntüleme seansında bulunmayan dikenler ok başı ile gösterilir; görüntüleme seansları arasında elimine edilen dikenler oklarla gösterilir. Philip Podia, bir kez ustalaştıktan sonra yıldızlarla gösterilir.

Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa bir ila iki saat içinde yapılabilir.