Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi
23 Kasım 2014
Ultrason ve endomikroskopi olmak üzere iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemi kullanarak kanser hücreleri tarafından salgılanan bir faktör havuzunun anjiyojenik potansiyelini göstermek için bir matrigel tıkaç testi tarif ediyoruz. Hücre dışı bir matriks (ECM) taklidi jeli olan matrigel, konağı (fare) şartlandırılmış ortama (CM) salgılanan anjiyojenik faktörlerle tanıştırmak için kullanılır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, kanser hücreleri tarafından salgılanan bir faktör havuzunun anjiyojenik potansiyelini göstermek için ultrason ve endomikroskopi kullanmaktır. Bu, önce tümör hücrelerinin yokluğunda farede tümör benzeri bir ortam oluşturmak için bir tıkaç implante edilerek elde edilir. Daha sonra, kan damarı yoğunluğu ve tıkaç içindeki fonksiyonel kan damarlarının yüzdesi değerlendirilir.
Son adımda, kan damarlarının morfolojisi görselleştirilir. Sonuç olarak, hücreler tarafından salgılanan pro ve anti-anjiyojenik faktörler arasındaki denge ve bunların anjiyogenez üzerindeki etkileri, birbirini tamamlayan iki görüntüleme yöntemi ile int, vitalik ve çeşitli zaman noktalarında değerlendirilebilir. Bu tekniğin konvansiyonel matrigel tıkaç testi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tamamlayıcı intravital görüntüleme modalitelerini kullanırken hücreler tarafından salgılanan faktörlerden oluşan bir havuzun analizine izin vermesidir.
Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan F Andra Doktora öğrencilerini çalıştıracak: Hücre dışı matrisi veya ECM mimik jel tıkaç vaskülarizasyonunu değerlendirmek için ultrason kullanmak için, 80 mikrolitre taze hazırlanmış şartlandırılmış ortam içeren 1,5 mililitrelik bir einor tüpünü buz üzerine yerleştirerek başlayın. Prosedürün en zor kısmı, jeli buz gibi soğuk uçlar kullanarak kabarcıklar olmadan enjekte etmektir. Nazik karıştırma ve yavaş enjeksiyon, optimum bir jel uygulaması sağlayacaktır.
Daha sonra buz gibi 1000 mikrolitrelik uçlar kullanarak, gece boyunca 600 mikrolitre buz gibi dört santigrat derece karıştırın. ECM taklit jeli, kabarcık oluşturmamaya özen göstererek ortama çözdürülür. Ayak parmağınızı sıkıştırarak sedasyonu onayladıktan sonra, her farenin karnını tıraş edin ve deri altına yavaşça atmak için 27 gauge iğne ile donatılmış buz gibi soğuk bir mililitrelik şırınga kullanın.
Hayvan başına bir EEND DPH tüpünün içeriğini enjekte edin. Tüm hacim uygulandıktan sonra, katılaşma meydana gelene kadar iğneyi birkaç dakika yerinde tutun. Üç hafta sonra, farelerin karın bölgesini tekrar tıraş edin, tüy dökücü kremle fazla tüyleri alın ve ardından fareleri mikro manipülatör aşamasında sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
Daha sonra, 30 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik şırıngayı tuzlu su ile doldurun. Ardından iğneyi kuyruk damarının içine yerleştirin. İğneyi sıkıca sabitleyin ve şırıngayı gevşetin.
Şimdi dönüştürücüyü istenen tarama alanının ortasına yerleştirin ve 3D motor aşamasını başlatmak için 3D'ye tıklayın. 3D'ye tıklayın. Yine, tarama mesafesini ve adım boyutunu girin ve tara'ya basın.
Görüntülenen 3D görüntü verilerinde tüm fişin tarandığını onaylayın. Değilse, dönüştürücüyü tüm fiş görünecek şekilde ayarlayın ve alanı az önce gösterildiği gibi tekrar tarayın. Ardından, kontrastı seçin ve görüntüyü koyulaştırmak için zaman kazancı telafisini veya TGC kontrollerini ayarlayın, mikro kabarcıkları 45 saniye boyunca etkinleştirmek için bir flakon karıştırıcı kullanın.
Daha sonra 50 mikrolitre mikro kabarcıkları bir mililitrelik şırıngada 50 mikrolitre tuzlu su ile karıştırın. Gevşetilmiş şırınga içeren salini, aktive edilmiş mikro kabarcıkları içeren şırınga ile değiştirin ve seyreltilmiş mikro kabarcıkları her farenin kuyruk damarına enjekte edin. Baloncukların sabit bir duruma ulaşması için birkaç saniye bekleyin ve ardından 3B'ye tıklayın ve 3B elde etmek için tara'yı seçin.
Kontrastı artırılmış görüntüler. Görüntü verilerini kaydetmek için bir mağaza gördü'ye tıklayın ve ardından 3B'yi seçip 3B'yi yok edin. Mikro kabarcıkları yok etmek için tekrar 3D'ye tıklayın ve bir imha sonrası cena döngüsü elde etmek için tara'yı seçin.
Ardından tekrar bir mağaza gördüm'e tıklayın. Daha sonra referans ayarlarında referans oluştur'a tıklayın ve ardından çalışma yönetimi'ni seçin. Yıkım öncesi cena döngüsünü açmak için.
Şimdi yeşil bir kontrast kaplaması oluşturmak için işlem enteline tıklayın. Ardından ultrason görüntüleme yazılımında 3D'ye yükle'yi seçin. Ardından, mod ayarlarına tıklayın, ses seviyesine tıklayın ve paralel'i seçin.
Ardından, hedef dokunun 3B hacmini oluşturmak için bir dizi konturu segmentlere ayırın ve segmentasyonu tamamlamak için bitir'e tıklayın. ECM mimik jel tıkaç vaskülatür morfolojisini değerlendirmek için lifli konfokal endo mikroskopi kullanmak için, mililitre başına 200 mikrolitre 10 miligram enjekte edin, her deney hayvanının kuyruk damarına C etiketli dekstran sığar. Ardından, fişten yaklaşık bir santimetre uzakta küçük bir kesi uygulayın ve endomikroskopi probunu, fişi sağlam tutarken nazikçe tapanın üzerine yerleştirin.
Prob yerleştirildikten sonra, başlatma lazerine basmak için ayak pedalını kullanın. Floresan ekranda göründüğünde, filmler arasında 32. uzunluğa kadar kısa filmler elde etmek için ayak pedalıyla seç düğmesine basın, prob ucunu su içeren bir tüpte yıkayın. Çekim bittiğinde, ortalama damar çapını analiz etmek için ucu pamuklu çubukla temizleyin.
Ardından, gemi tespit modülü penceresini açmak için mikro gemileri tespit et'e tıklayın ve tercihler'e tıklayın. İlgilenilen istatistikte ortalama damar çapının olduğundan emin olun. Ekran modundaki pencere ve ekran histogram çubukları işaretlenir.
Seçilen ölçümleri görüntülemek için algıla'ya tıklayın. Kan damarlarına bitişik alanlardaki floresan sinyal yoğunluğunu analiz etmek için, daire ROI oluştur'u seçin ve ilgili alanda bir daire oluşturun. Son olarak, daire içine alınan bölgeyle ilgili değerleri hesaplamak için ROI içinde histogramı hesapla'yı seçin.
Burada, U 87 mg şartlandırılmış orta yüklü tıkaçlar içinde fonksiyonel kan damarlarının geniş bir şekilde yer alması, mikro kabarcık kontrastlı ultrason görüntüleme ile ortaya çıkar. Tersine, hareketsiz tümör üreten hücrelerden şartlandırılmış ortam içeren tıkaçlar içinde, kan akışı neredeyse tespit edilemez. Bu yeni oluşan kan damarlarının morfolojisi, bu temsili görüntülerde gösterildiği gibi, fit c dekstran uygulamasından sonra damarların lifli konfokal endo mikroskobu ile daha da vurgulanır, U 87 mg şartlandırılmış ortam ile yüklenen tıkaçlar içindeki kan damarlarının nasıl olduğuna dikkat edin Tipik bir sızdıran künt uçlu genişlemiş damar morfolojisi.
Genişlemiş ve oldukça karışık kan damarları aynı zamanda sürekli olmayan ve yavaş bir akış gösterir ve çevrede kan sızıntısı gözlenir ve ayrıca kan damarlarının dışında belirgin olan yüksek floresan sinyali ile kanıtlanmıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, anjiyogenez kinetiğini optimize etmek için birkaç zaman noktasında saatler içinde yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, kanser hücreleri tarafından salgılanan faktörlerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için ultrason ve endomikroskop kullanarak bir matrigel plak denemesini açıklar. Bu yöntem, farelerde oluşturulan tümör benzeri bir ortamda kan damarı yoğunluğu ve morfolojisinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Onkoloji
- anjiyogenez
Arka Plan
- Anjiyogenez, tümör büyümesi ve metastaz için kritik öneme sahiptir.
- Pro- ve anti-anjiyojenik faktörlerin dengesini anlamak hayatidir.
- Geleneksel yöntemler, salgılanan faktörleri etkili bir şekilde analiz etmeyebilir.
- Tamamlayıcı görüntüleme teknikleri, anjiyogenezin değerlendirilmesini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Kanser hücresinin salgıladığı faktörlerin anjiyojenik potansiyelini göstermek.
- Fare modelinde bir matrigel plak denemesini kullanmak.
- Kan damarı yoğunluğunu ve işlevselliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Tümör ortamını simüle etmek için farelere matrigel plak implantasyonu.
- Kan damarı yoğunluğu ve işlevsel kan damarlarının değerlendirilmesi.
- Görüntüleme yöntemleri kullanılarak kan damarı morfolojisinin görselleştirilmesi.
- Zaman içinde anjiyojenik faktörlerin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Fare üzerinde başarılı bir şekilde tümör benzeri ortam üretimi.
- Kan damarı yoğunluğunun nicel değerlendirmesi gerçekleştirildi.
- Kan damarı morfolojisinin görselleştirilmesi gösterildi.
- anjiyojenik faktörler dengesi hakkında bilgiler elde edildi.
Sonuçlar
- Matrigel plak denemesi, anjiyojenik potansiyeli etkili bir şekilde değerlendirir.
- Tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri ayrıntılı bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, kanser biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to evaluate the angiogenic potential of complex factor pools secreted by tumor cells in a physiologically relevant in vivo environment. By combining quantitative ultrasound imaging with high-resolution endomicroscopy, it provides mechanistic insights into vascular functionality and morphology, supporting target validation and de-risking of angiogenesis-modulating therapeutics. The assay facilitates early-stage assessment of pro- and anti-angiogenic factor balance, informing portfolio decisions and reducing late-stage biological risk in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the net angiogenic output of secreted factor pools from cancer cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through real-time measurement of blood vessel density and perfusion in a tumor-mimetic matrix.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating factor secretion profiles with vascular phenotypes, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized, reproducible biological systems for screening angiogenic or anti-angiogenic compounds using conditioned media as input.
- Quantitative Outputs: Generates measurable endpoints including blood vessel density, percent functional vessels, and mean vessel diameter for compound screening campaigns.
- Scalability & Reuse: Supports longitudinal monitoring at multiple time points, enabling kinetic analysis and platform reuse across factor libraries or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the angiogenic microenvironment of fast-growing glioblastoma, providing a translational bridge to preclinical efficacy studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular morphology (e.g., leaky, enlarged vessels) with functional readouts, supporting translational biomarker discovery.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by quantifying angiogenic response over time, reducing uncertainty in preclinical progression.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical validation, offering a functional readout that complements biochemical and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing the angiogenic potential of complex factor mixtures, clarifying pathway-level effects in angiogenesis regulation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative vascular readouts (vessel density, functionality) that enable reliable comparison of test conditions across wells or time points.
- Analytics: Provides multimodal data—ultrasound-derived perfusion metrics and endomicroscopy-based morphometric analysis—to inform comparative analytics and structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects in vitro factor secretion to in vivo vascular outcomes, supporting continuity from discovery through preclinical validation using disease-relevant vascular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating angiogenic or anti-angiogenic activity of factor pools, antibodies, or small molecules across oncology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by linking secreted factor profiles to functional vascular outcomes, reducing mechanistic ambiguity in angiogenesis modulation.
- Operational Value: Standardizes assessment through reproducible plug formation, standardized imaging protocols, and quantifiable endpoints across operators and sites.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of angiogenesis-targeting candidates, minimizing investment in biologically inactive approaches.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of angiogenic activity, supporting differentiation between pro- and anti-angiogenic mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vivo imaging techniques, including ultrasound contrast agent handling and fibered confocal endomicroscopy operation.
- Depends on access to high-frequency ultrasound systems with 3D motorized stages and microbubble contrast agents, plus endomicroscopy platforms with fluorescent dextran labeling capability.
- Necessitates cross-team standardization of plug preparation, imaging parameters, and image analysis workflows to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different cell lines, tumor types, or stromal co-cultures to maintain physiological relevance.
- Limited by the endpoint nature of the assay, requiring sacrifice of animals at each time point, which constrains longitudinal sampling in individual subjects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Extracellular Matrix (ECM)–mimic Gel Plug Inoculation into Mice
2:43
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vascularization Using Ultrasound
5:31
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vasculature Morphology Using Fibered Confocal Endomicroscopy
7:23
Results: Representative ECM–mimic Gel Plug Imaging
8:40
Conclusion
