Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez

Aşağıdaki deneyin genel amacı, belirli bir genin bütün bir embriyo içerisinde nerede eksprese edildiğini göstermektir. Bu, ikinci bir adım olarak, lokalize edilecek RNA'nın embriyo içerisindeki konumunda sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. İlgilenilen gene özgü bir antisense RNA probu, embriyo içerisindeki hedef RNA ile hibridize edilir.

Bu prob, genellikle digoksin olan ve daha sonra tespit edilebilen bir epitop içerir. Ardından, alkalin fosfataza bağlı bir antikor, RNA probu üzerindeki epitopla hibritlenir ve bunu kolorimetrik bir boyama işlemi izler. RNA'nın embriyo içinde nerede lokalize olduğunu görselleştirmek için, renk reaksiyonuna ve embriyo anatomisi bilgisine dayanarak, ilgilenilen genin tam olarak nerede eksprese olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir.

Enstitü protokolümüzün mevcut protokollere göre temel avantajı, kalite kaybı görülmeksizin daha hızlı olması ve daha az reaktif kullanmasıdır. Bu yöntem, dokuların nasıl spesifiye edildiği ve desenlendiği gibi embriyolojideki temel sorulara yanıt verebilir. Bu yöntem, opus gelişimine dair içgörüler sağlayabilmenin yanı sıra, zebra balığı ve erken evre fare embriyoları gibi diğer birçok küçük embriyo için de kullanılabilir.

Orijinal yöntemler çok fazla zaman aldığı için öncelikle bu yöntemleri geliştirmeye başladık ve kaliteden ödün vermeden prosedürün verimliliğini artırmak amacıyla Ed aşamalarını atlamayı denemeye başladık. Embriyo fiksasyonu aşamalı olarak gerçekleştirilir. İlk olarak, sürecin tüm aşamaları boyunca embriyoların izlenebilmesine olanak tanımak için, embriyoların nihai saklaması da dahil olmak üzere tüm adımlarda kullanılacak cam şişeleri hazırlayın.

Kapaklarında kaliteli Teflon sızdırmazlık contası bulunan şeffaf tüpler kullanın ve kalıcı bir marka kalemle tüpleri uygun deney bilgileriyle etiketleyin. Prosedür boyunca etiketlerin silinmesini önlemek için etiketlerin üzerini şeffaf bantla kaplayın. Alkollerin ve diğer çözücülerin kullanımı nedeniyle, MFA sabitleme çözeltisini protokol metninde açıklandığı şekilde hazırlayın.

Etiketlenmiş her bir cam şişeyi üç ila dört mililitre MFA çözeltisi ile doldurun. %100 metanol çözeltisini -20 °C'de saklayın. Bir cam pipet hazırlayın ve embriyoları fiksasyon için Memphis çözeltisi içeren cam şişelere aktarmak için kullanın.

Embriyo ortamından minimum sıvı transferi yaparak embriyoları ekleyin. Her tüpe 20 ile 30 adetten fazla embriyo sabitlemeyin. Embriyoları, bir çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında iki saat boyunca Memphis çözeltisinde bekletin.

Paraformaldehit fiksasyonu tamamlandığında, embriyoları prob sentez reaksiyonunu hazırlamadan önce saklamak için Memphis çözeltisini yaklaşık dört mililitre -20 °C'deki %100 metanol ile değiştirin; DNA su NTP karışımının ve polimeraz tamponunun oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Bu prosedürün başarısı için en kritik adımlardan biri, prob reaksiyonunun doğru şekilde hazırlanmasıdır.

Prob sentez reaksiyonunu oda sıcaklığında hazırlayın. Aşağıdaki bileşenleri 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne sırasıyla ekleyin. Kalıp DNA, reaksiyonun toplam hacmini 20 µL'ye tamamlayacak şekilde su ile ayarlayın, NTP karışımı, RNA inhibitörü, RNA polimeraz tamponu ve RNA polimeraz; transkripsiyon reaksiyonunu 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

İki saatten biraz daha uzun süren inkübasyonların herhangi bir olumsuz etkisi yoktur ancak verimde de pek bir artış sağlamazlar; eğer bir saat boyunca inkübe edilirse, iyi bir prob yapmak için hala yeterli olsa da verim azalacaktır. Transkripsiyon reaksiyonu tamamlandığında, %1'lik TAE jelinde kontrol etmek için reaksiyon karışımından bir mikrolitre alın. Geri kalan reaksiyon karışımına.

TE tamponunda %1 SDS'den 80 µL, beş molar amonyum asetatdan 10 µL ve soğuk etanolden 220 µL ekleyin. Karışımı kuvvetlice vorteksleyin ve RNA kalite kontrol sonuçları belli olana kadar buz üzerinde bekletin. Çöktürme öncesinde ayrılan 1 µL RNA'ya su ve standart yükleme boyası ekledikten sonra, RNA'yı EtBr içeren %1'lik TAE jelinde yürütün.

Probun kalitesini kontrol etmek için etidyum bromür ile işaretlenmiş RNA'yı bir UV ışığı translüminatör kullanarak jel üzerinde görüntüleyin. Altında veya üstünde yayılma olmayan tek bir bant görülmelidir. RNA'nın kalitesi doğrulandıktan sonra, buz üzerinde bekletilen kalan RNA'yı bir mikrosantrifüjde tam hızda 10 ila 15 dakika döndürerek çöktürün.

Süpernatantı çekilmiş bir cam pipetle uzaklaştırın ve RNA'nın kısa bir süre kurumasını bekleyin. Ardından, prob RNA hibridizasyon tamponunda yeniden süspanse edilir ve -20 °C'de, 15 mililitrelik vidalı kapaklı polistiren tüp içerisinde saklanır. Bu prosedüre başlamak için, -20 °C metanolde saklanan embriyoları çıkarın ve oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin.

Tüm prosedür cam viallerde gerçekleştirilir. Bir gruptaki farklı embriyolar farklı problarla incelenecekse, problar eklenmeden hemen öncesine kadar onları tek bir vialde tutun. Prob ekleme hazırlığında ilk günkü değişkenliği ve iş yükünü azaltmak için, bu tabloda özetlendiği gibi embriyoları bir metanol serisi aracılığıyla rehidre edin; embriyolar bu adım sırasında kolayca hasar görebileceği için her bir solüsyonu dikkatlice çıkarmak ve eklemek için cam pipetler kullanın.

Sıvıları transfer ederken, embriyoların kapakların içinde kalmadığından emin olmak için kapların içini kontrol edin. Embriyoların yan yüzeylere veya birbirlerine yapışmadığından emin olmak için her değişimden sonra onları nazikçe döndürün. Ayrıca, RNA hibridizasyon tamponu ve prob 65 °C'ye önceden ısıtılmadan önce, tüpleri bir çalkalayıcıya yerleştirerek embriyoları sallayın.

Embriyoları prob çözeltisi içinde, ertesi güne kadar 65 °C'de sallayarak gece boyunca hibritleyin. Prob çözeltisini uzaklaştırın ve tarih ile probun kaç kez kullanıldığı belirtilmiş 15 mL'lik vidalı kapaklı polistiren bir tüpte saklayın. Prob çözeltisini -20 °C'de depolayın.

Prob çıkarıldıktan sonra, burada belirtilen bir dizi yıkama işlemiyle embriyoları proba karşı antikor boyamasına hazırlayın; embriyo tüplerinin takılı olduğu mutatoru, uygun sıcaklığa ayarlanmış hibridizasyon fırınlarına doğrudan taşıyarak sıcaklığı gereksinimlere göre değiştirin. Embriyolar bloklama çözeltisi içinde inkübe edilirken, antikora embriyolara eklenmeden önce bloklanması için uygun hacimdeki bloklama çözeltisini ve anti-D dig antikoru hazırlayın. Embriyoları antikor çözeltisi içinde, dört derece Celsius'ta sallanarak gece boyunca inkübe edin ve işlemi ertesi gün tamamlayın.

Antikor çözeltisini uzaklaştırın ve maleik asit ile sodyum klorür içeren bir çözelti olan mab ile yıkayın. Oda sıcaklığında, sallama yöntemiyle en az 1230 dakikalık yıkamalar gerçekleştirin. Son yıkama çözeltisini alkali fosfataz substratı ile değiştirin.

Boyama reaksiyonunu oda sıcaklığında, bir gece boyunca sallayarak gerçekleştirin ve işlemi ertesi gün tamamlayın. Boyama reaksiyonunu durdurun ve bu tabloda belirtildiği şekilde sıvıları değiştirerek embriyoları saklama ve görüntüleme için hazırlayın. Embriyoları yeniden hidrate ettikten sonra, boyayı 30 dakika boyunca MFA ile sabitleyin.

Fiksasyon tamamlandıktan sonra MFA'yı uzaklaştırın ve embriyoları %25 methanol ile yıkayın. Endojen pigmentlerin giderilmesi gerekiyorsa, %25 methanol'u uzaklaştırıp ağartma çözeltisini ekleyin. Ağartma işlemi nispeten hızlı gerçekleştiğinden işlemi yakından gözlemleyin; farklı etkiler elde etmek için ağartma derecesi değiştirilebilir.

Uzun süreli saklama için, embriyoları metanol serisi ile %100 metanolle dehydrate edin; kısa süreli saklama ve ardından yapılacak görüntüleme için ağartma işlemini takiben embriyoları PBS'ye aktarın. Berraklaştırılmamış embriyolar, %1'lik aros arka planında en iyi şekilde görüntülenir ve fotoğraflanır. Aros çözeltisini hazırlamak için, arosu suya ekleyin ve aros çözünene kadar kaynatın. Aros 50 °C'ye soğuduktan sonra, yaklaşık iki milimetre derinliğe ulaşacak şekilde bir Petri kabına dökün.

Aros kabı hazır olduğunda, temizlenmemiş embriyoları kaba yerleştirin ve görüntülemeye geçin. Aros, embriyo ve boyama reaksiyonunun mavi rengi ile iyi kontrast oluşturan mavi-gri bir arka plan sağlar. Ayrıca, embriyoyu ventral taraf gibi alternatif açılardan görüntülemek için dikkati embriyodan uzaklaştıran rahatsız edici gölgelerin ve yansımaların dağılmasına yardımcı olur.

Embriyoyu yerleştirmek için ince pensler kullanarak oranda kesikler açın. Yönlendirme için embriyoları bu kanallara yerleştirin. Embriyolar kolayca zarar görebileceği için onları manipüle ederken dikkatli olun.

Embriyoyu sığ bir açıyla aydınlatmak için fiber optik ışık kaynağını kullanın; ağartma işlemi, faydalı referans noktaları sağlayan pigmentleri yok edebileceğinden, embriyo üzerinde görüntüye derinlik katan ve yüzey yapılarının ayırt edilmesine yardımcı olan gölgeler oluşturun. Güçlü şekilde ağartılmış embriyolar için gölgelendirme yöntemini kullanın. Şeffaflaştırılmış embriyolar, göbek kordonu, akciğer veya beynin belirli bölgelerinde olduğu gibi, embriyonun derinliklerindeki boyamaları görüntülemek için kullanılır.

Bu protokolde, embriyodaki boyanmayı görselleştirmek için farklı düzeylerde ağartma kullanılır. Boyama güçlü ise, bir miktar pigmentasyon bırakan daha hafif bir ağartma, embriyonun daha iyi evrelenmesini ve yönlendirilmesini sağlar. Ancak, boyama böbrek gibi pigmentasyon seviyesinin yüksek olduğu bir bölgedeyse, daha güçlü ağartma daha iyi sonuç verir.

ARO tabanının manipülasyonu, embriyo oryantasyonuna yardımcı olabilir. Örneğin, aros üzerinde ince bir kanal açarak, yan yatmış iribaş evresindeki bir embriyo, iyi bir görüntü yakalamak için yeterli stabiliteyle ventral taraftan görüntülenebilir. Bu embriyo, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumunu sabitleyen küçük bir deliğe yerleştirilerek, ilgilenilen genin ekspresyon paterninin tam olarak görüntülenmesi sağlanmıştır.

İç organlar, hem şeffaflaştırılmamış hem de şeffaflaştırılmış embriyolarda görüntülenebilir; PAX 2 için boyanmış şeffaflaştırılmamış opak bir embriyoda, 34. evrede optik sap ve nöral tüp görselleştirilebilir. Ancak ayrıntılar net değildir. Embriyonun şeffaflaştırılmasıyla, optik sap da dahil olmak üzere ekspresyon bölgelerinin sınırları daha net hale gelir.

Şeffaflaştırma derecesi, bu embriyoda her iki gözün de görülebilmesinden anlaşılmaktadır. Ancak, şeffaflaştırılmış embriyolarda karşılaşılan yaygın bir sorun, bazı boyaların iç boşluklarda birikmesidir. Bu videoyu izledikten sonra, daha az reaktif kullanarak hızlı bir şekilde nasıl tüm mount in situ işlemi gerçekleştirebileceğiniz ve yüksek kaliteli görüntüler nasıl yakalayacağınız konusunda iyi bir fikre sahip olacaksınız.