Name: Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Keşfedin Arabidopsis thaliana ovüllerinde immün boyama ve FISH ile kromatin modifikasyonlarının ve nükleer mimarinin tek hücreli analizi. Bu yöntem bitki biyolojisi araştırmalarında yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Teknik ve finansal destek için Ueli Grossniklaus'a (Zürih Üniversitesi) teşekkür ederiz. Genel laboratuvar desteği için Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos ve Peter Kopf'a teşekkür ederiz. Bu araştırma Zürih Üniversitesi tarafından finanse edilmiş, İsviçre Ulusal Vakfı'ndan CB (31003A_130722) ve Ueli Grossniklaus'a (31003A_141245 ve 31003AB-126006) ve Agence Nationale de la Recherche'den DG'ye (ANR-BLANC-2012 Programı) hibe edilmiştir.

Prosedür, Şekil 1 &#39;de iş akışı tarif edilmektedir, ve diseksiyon ve dokuların yerleştirilmesi için kurulum Şekil 2&#39;de sunulmuştur. 1.. Doku Fixation <ol><li> Buz üzerinde taze BVO sabitleyici tampon içeren bir mikrofuj tüp içinde 20-30 carpels toplayın. </li><li> Yumuşak, oda sıcaklığında çalkalanarak doku 30 dak. </li><li> 400 x g de bir tezgah üstü mikrosantrfuj 1 dakika içinde sabitleyici carpels ihtiva eden tüpler dönerler. </li><li> Dikkatlice sabitleyici tamponunu çıkarın ve PBT 1 ml eklemek, buz üzerinde tüpleri. </li></ol> 2.. Diseksiyon ve katıştırma <ol><li> Bir taze yapılmış,% 5 akrilamid karışımı her 200 ul beş Eppendorf tüpleri hazırlayın. </li><li> Beş Superfrost slaytlar% 70 etanol ile önceden temizlenmiş ve bir kalem ile etiketlenmiş hazırlayın. </li><li> Bir% 20 APS bölüntüsünün ve buz üzerinde% 20 Naps her çözülme. </li><li> Bir kesim uç ucu, yer ile 4-5 carpels alıntemiz bir slayt üzerine onları, sıvı fazlalığı kaldırın. </li><li> Ince bir iğne ile uzunlamasına kesim yapın ve gösterildiği gibi, Şekil 2 ovüller satır serbest bırakmak için meyve yaprağı duvarları ayırmak, PBS (en fazla 10 ul) ile kaplayarak kurumayı önlemek. </li><li> Çabuk 12 ul Naps, 200 ul akrilamid karışımı bir bölümüyle 12 ul APS ekleyin ve karıştırın. </li><li> Kesilmiş ovüllerde üzerine aktive akrilamidin 30 ul ekle. </li><li> 20 x 20 mm lamel ile kaplayın, oda sıcaklığında 45-60 dk polimerize edelim. </li><li> Bir jilet kullanarak lamel çıkarın. Bu aşamada, numuneler PBS içeren bir Coplin kavanoz içinde 4 ° C&#39;de bir gece boyunca muhafaza edilebilir. </li></ol> 3.. Doku İşleme Not: 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 ve 3.4.3 dışındaki tüm aşamalar oda sıcaklığında kimyasal başlık altında 80 ml solüsyonu ile Coplin kavanoz içinde gerçekleştirilmektedir. Slaytlar düz uçlu forseps ile aktarılır. <ol><li> Doku açıklama vesabitleme: <ol><li> Metanol içinde 5 dakika inkübe edin. </li><li> Etanol içinde 5 dakika inkübe edin. </li><li> Ksilen (1:1): Etanol içinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> Etanol içinde 5 dakika inkübe edin. </li><li> Metanol içinde 5 dakika inkübe edin. </li><li> % 2.5 formaldehit ile tamamlanır, metanol ve PBT (1:1) içinde 15 dakika inkübe edin. </li><li> PBT 2 x 10 dakika durulayın. Bu aşamada, slaytlar, 4 ° C de bir gece tutulabilir </li></ol></li><li> Hücre duvarı sindirim: <ol><li> Buz üzerinde hücre duvarı sindirim karışımı bir kısım çözülme. </li><li> Bir kağıt havlu üzerinde dikey yerleştirerek sıvının aşırı drenaj, Coplin kavanoz bir slayt atın. </li><li> Akrilamid pad üzerinde hücre duvarı sindirim karışımı 100 ul ekleyin ve 23 x 46 mm lamel ile kaplayın. Diğer slaytlar için tekrarlayın. (Malzemelerde anlatılan) bir nem odası içinde 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> PBT slaytlar 2 x 5 dakika yıkanır. </li></ol></li><li> Bir tedavi RNaz: <ol><li> Coplin kavanoz bir slayt atın, inci tahliyedaha önce olduğu gibi, fazla sıvının e. </li><li> % 1 Tween-20, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir odaya ile PBS içinde 100 ug / ml &#39;de RnazA 100 ul her bir slayt inkübe edin. </li><li> PBT 2 x 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın. </li></ol></li><li> Post-fiksasyon ve permeabilizasyon: <ol><li> Taze yapılmış PBT-F 20 dakika için Post-fix. </li><li> PBT içinde 10 dakika için slaytlar durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de% 2 Tween-20 ile PBS içinde 2 saat boyunca geçirgen </li><li> PBT 2 x 5 dakika boyunca slaytlar durulayın. </li></ol></li></ol> 4. İmmünoboyama NOT: Bu adımda, birincil antikorun optimum konsantrasyonu, değişik seyreltiler antikorların (1:200, 1:500, 1:1000) kullanılarak test edilmesi gerekir. <ol><li> 4 ° C&#39;de 12-24 saat süre ile% 0.2 Tween-20 ile PBS içinde seyreltilmiş birincil antikor, 100 ul her bir slayt inkübe </li><li> Nazik çalkalama altında oda sıcaklığında 2-4 saat boyunca PBT slaytlar yıkayın. </li><li> Uygulaİkincil antikor 1:200 PBS +% 0.2 Tween-20, 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de </li><li> Nazik çalkalama altında oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBT slaytlar yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca PBS içinde 10 ug / ml propidyum iyodür Counterstain, daha sonra oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak, PBS içinde 15 dakika durulayın. </li><li> Anti-solma sıvı mountant Mount 10 ug / ml propidyum iyodür ile takviye edilmiştir. Montaj orta CLSM görüntüleri almadan önce 1 saat boyunca sertleşmeye bırakın. </li></ol> 5.. Sayısal Görüntüleme <ol><li> Görüntü edinimi: <ol><li> Ideal daha uzun görüntüleme üzerinde 23 floresan sinyallerin korunması ve 63X gliserol daldırma objektifi sağlayan bir rezonans tarama modunu kullanarak, CLSM kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüler elde. </li><li> Kesinlikle boyunca takip için standart bir toplama prosedürü tanımlamak için böyle bir deney başında lazer yoğunluğu, kazanç, iğne deliği, voksel boyutu ve yakınlaştırma faktörü olarak satın alma parametreleri testTutarlı kantitatif ölçümler için tüm slaytlar. </li><li> Fluorochromes arasında çapraz konuşma olmadığını doğrulayın. Eğer varsa, sıralı bir tarama kurmak. Ayrı ayrı ve eş zamanlı iletim görüntü kazanır. </li><li> X ve y boyutlarında mümkün olan en yüksek çözünürlükte ve z boyut (Nyquist kuralı) 2x Oversampling ile seri, üç boyutlu görüntü alımı gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Görüntü işleme: <ol><li> Ticari veya açık kaynak kodlu yazılım kullanarak üç boyutlu olarak seri görüntüleri yeniden. </li><li> 3D ilgi her çekirdek (veya hücre) etrafında kontur yüzeyleri tanımlayın. </li><li> Her nesne piksel yoğunluklarının toplamı olarak, her kanaldaki floresansı ölçmek. </li><li> Istatistiksel analizler için Excel&#39;e veri ihracat. Örneğin, DNA boyama sinyallerine karşı antikor sinyallerini normalleştirmek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+introduction+to+the+embryology+of+angiosperms%22">An introduction to the embryology of angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li>
<li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li>
<li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li>
<li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li>
<li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li>
<li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li>
<li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development%3A+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li>
<li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li>
<li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li>
<li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li>
<li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li>
<li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+%28Zea+mays%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li>
<li>Niedojadło, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li>
<li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+%28Illiciaceae%3B+Austrobaileyales%29%3A+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots%2C+eumagnoliids%2C+and+eudicots%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li>
<li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis%3A+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li>
<li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li>
<li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li>
<li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li>
<li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li>
<li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li>
<li>Lysak, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLysak%2C+M+%22Cytogenetic+analyses+of+Arabidopsis+In+Arabidopsis+Protocols%3A+Methods+in+Molecular+Biology%2C+2nd+ed%22">Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).</li>
<li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feulgen+reaction+75+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Procedures+for+In+Situ+Hybridization+to+Chromosomes%2C+Cells%2C+and+Tissue+Sections.+Nonradioactive+in+situ+hybridization+application+manual%22%5BJournal%5D)">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Çiçekli bitkilerde, dişi üreme soy nedenle teknik zorlu tüm montaj sitolojik lekelenme render nucellus ve ovül teguments dahil olmak üzere birçok hücre tabakası ile çevrilidir. Burada örneğin tam montaj in situ hibridizasyon immüno-boyama, DNA boyama ve floresan gibi sitolojik boyanması için uygun ovüller, çok sayıda hazırlanmasını ve işlenmesini sağlayan etkin bir protokol sunmaktır. Başarıyla Arabidopsis 21,22 dişi üreme tohum çizgisi analizi için kullanılır. Birkaç farklı slaytlar boyanma...

Çiçekli bitkilerde üreme soy kurulması SMC&#39;lerinin farklılaşması, kadın MMC ve erkek Mikrospor anne hücre ile başlar. MMC ovül primordiumunun uzak ucunda bir alt epidermal nucellar hücreden gelişen ve mikrospor anne hücre derin çiçek organları 1 içinde bulunan anter lokül içinde sporogenous dokusundan gelişir. SMC&#39;ler sonra mitoz üzerine gametofitleri doğuran haploid sporlar, üretmek için mayoz tabi. Dişi gametofit veya embriyo kesesi, bir yumurta hücresinin, tek bir merkezi hücrenin, iki synergids ve üç zıtlar oluşur. Erkek gametofit veya polen, bir bitkisel hücre ve iki sperm hücrelerinin oluşmaktadır. Erkek gametofit nispeten erişilebilir nesne-of-çalışma devam ederken, kadın gametofitin kendisi çiçek karpelin içine, ovüldeki içine gömülü, ve dolayısıyla moleküler ve sitolojik analizler belirli zorluklar teşkil edilir. Ancak son zamanlarda, lazer desteklimikrodisseksiyon Transkriptomik MMC ve kadın gemotofitik hücrelerde 2-4 analizleri sağlayan zarif bir çözüm sundu. Aday gen ekspresyonuna ek olarak sitolojik analizleri, belirli hücre boyama doğrudan ya da dolaylı immüno-lekeleme kullanılarak, endojen hücre bileşenlerinin dinamiklerini araştıran, in situ melezleme ya da raportör gen deneyleri, örneğin RNA sağlar kullanarak analiz eder. Özellikle, birlikte kromatin modifikasyon veya kromatin bileşenleri immün ile, FISH ve DNA boyama kullanılarak sitogenetik boyama Arabidopsis&#39;de 5 kromatin dinamikleri ve nükleer organizasyon aydınlatmak için merkezi yaklaşımlardır. Tipik olarak, mayoz de 6,7 meiocytes bitki erkekte araştırılmıştır spesifik kromozom dinamikleri gerektirir; muhtemelen dinamik epigenetik yeniden programlama yansıtan daha büyük ölçekli, hücreye özel kromatin düzenlenmesi, polen gelişimi sırasında 8-10 tarif edilmiştir. Buna karşın, nedenikadın meiocyte ve gametofit göreli erişilememesi nedeniyle, bu soruşturmaların uygulamak teknik olarak zor kalır ve sık sık (aşağıya bakınız) kesit veya manuel diseksiyonu ve enzimatik sindirim gerektirir. Buna ek olarak, tüm montaj içinde optik netlik yaygın olmaması sağlam ovüllerindeki üreme hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir engeldir. Tüm montaj ovüllerindeki kromozom örgüt sitolojik analizi için klasik bir yöntem Feulgen en lekelenme 11-13 kullanır. Protein denatürasyonu ile sonuçlanır ve bu nedenle, kromatin yapısının yok edilmesine neden olan DNA (hipokloröz asit kullanılarak) asit hidrolizi içerir. Alternatif olarak, kadın meiocytes ve gemotofitik hücrelerde kromozom organizasyonu (örneğin 14-18 bakınız) yarı-ince kesitler veya disseke embriyo keseleri ve MMC Dapi ve immun boyama kullanılarak görülebilir. Açıkçası, ancak, manuel diseksiyon ve kesit yoğun emek olabilir vekromatin epitoplarının büyük bir sayıda nitel ve nicel analizi engellemektedir. Burada bütün montaj içinde alt sitolojik lekelenme çeşitli için uygun Arabidopsis ovüller, çok sayıda hazırlanması için etkin bir protokol sağlar. Kısaca, çiçek tomurcukları bir sabitleyici çözelti içinde inkübe edilir, ovüller sıraları karpelin ayrılır ve polen meiocytes 19,20 için yapıldığı gibi slayt üzerinde akrilamid gömülü. Gömülü ovüller bundan başka, metanol, etanol, ve hücre duvarı sindirim ve nüfuziyet önce iksilen içinde temizlendi ve sabitlenir. Bu adımların olası varyasyonları tartışılmıştır. Numuneler daha sonra DNA lekeleme, imüno ve FISH için kullanılabilir. Hazırlık modu verimli ve (en fazla 16 slaytlar farklı alt analizi için bir gün içinde hazırlanabilir) paralel deneysel set-up sağlar. Açıklanan tedaviler, tüm montaj içinde homojen sinyalleri etkinleştirmek ve iyi histolojik, hücresel konservelerive hücre tipleri arasında nitel ve nicel karşılaştırmaları yarar üreme hücreleri ve çevresindeki nucellar hücrelerde nükleer organizasyonu. Kalibre, 3-boyutlu rekonstrüksiyon ardından CLSM-tabanlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme floresan sinyalleri anlamlı kantitatif ölçümleri sağlar. Biz başarıyla ayırt MMC 21 ve dişi gametofit 22 gelişmekte kromatin dinamiklerini analiz etmek için bu prosedürü kullanılır; biz burada tüm montaj ovüllerindeki heterokromatinin analizi, kromatin immünoboyamayla, GFP İmmunosteyn ve FISH temsilcisi sonuçlarını sunmak. Bu protokol daha da diğer bitki dokularında ve türleri için uygun olacağına inanıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Çözümler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BVO Fiksasyon Tamponu (32 dayalı)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7.5, %1 (h/h) formaldehit, %10 DMSO, 1x PBS, %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS, %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, %2.5 (h/h) formaldehit</td></tr><tr><td>%30 akrilamid:bisakrilamid</td><td></td><td></td><td>3 g akrilamid, 0.33 g bisakrilamid, 1x PBS (10 ml hazırlayın, 4 ° C'de saklayın; C)</td></tr> <tr>PBS'de <td></td><td></td><td>200 ml %5 akrilamid karışımı</td><td>34 ml %30 akrilamid:bisakrilamid, 166 ml 1x PBS (%30 stoktan taze yapın)</td></tr><tr><td>%20 amonyumpersülfit</td><td></td><td></td><td>0.2 g amonyumpersülfit, 1 ml steril su (1 ml ile alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın; C)</td></tr><tr><td>% 20 sodyum sülfit</td><td></td><td></td><td>0.2 g sodyum sülfit, 1 ml steril su (1 ml ile alikotlar hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C)</td></tr> <tr><td>Hücre duvarı enzim karışımı</td><td></td><td></td><td>% 0.5 (a / h) selülaz,% 1 (a / h) driselaz,% 0.5 (a / h) pektoliyaz</td></tr><tr><td>Reaktifleri ve Malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Schaurlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pektoliyaz</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Merck</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>akrilamid</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>bisakrilamid</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td>toksik</td></tr><tr><td>amonyumpersülfat</td><td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sülfit</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anti-trimetil-Histon H3 (Lys4)</td> <td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anti-monometil-histon H3 (Lys27)</td> <td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ~ keçi ~ anti ~ tavşan (H + L)</td> <td>Moleküler Prob</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>toksik</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>toksik</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Coplin kavanozu</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>DUMONT BİYOLOJİ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Nemli oda</td><td></td><td></td><td>İçinde nemli kağıt havlu bulunan plastik bir kutu, slaytları desteklemek ve slaytları sudan korumak için kutuya plastik bir destek konur.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus slayt</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td></tr><tr><td>BALIK Etiketi DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP güçlendirici</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tüm montaj ovüllerindeki in kromatin modifikasyonu ve nükleer mimarlık kantitatif, tek hücreli analizi için etkin bir yöntem<em&gt; arabidopsis</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Çiçekli bitkilerde, somatik-to-üreme hücresi kader geçiş yetişkin bitkinin çiçek organlarında spor anne hücrelerin şartnamede (SMC&#39;ler) ile işaretlenir. Kadın SMC (Megaspor anne hücre, MMC) yumurta hücresi primordiumunun içinde ayırır ve mayoz uğrar. Seçilen haploid Megaspor sonra birlikte aksesuar hücreleri ile, gamet sebebiyet verecek çok hücreli dişi gametofit, yumurta hücresi ve merkez hücre oluşturmak için mitoz uğrar. Ovüldeki içindeki MMC, meiocyte ve dişi gametopitin sınırlı erişilebilirlik sitolojik için teknik olarak zor ve sitogenetik tek hücre düzeyinde analiz eder. Özel olarak, hücresel ya da nükleer epitoplar doğrudan ya da dolaylı immunodeteksiyon bitki hücresi ve tek hücre görüntüleme içindeki reaktiflerin zayıf penetrasyon ile bozulur tüm montaj dokularda optik berraklık eksikliğinden demize edilir. Böylece, Nucl analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirditüm montaj gömülü Arabidopsis ovüllerindeki tek bir hücrede yüksek çözünürlükte kulak organizasyon ve kromatin modifikasyonu. Bu, bir mikroskop lamı üzerine akrilamid jel ince bir tabaka olarak diseksiyon ve sabit ovüllerin gömülmesi dayanmaktadır. Gömülü ovüller immüno-boyama reaktiflere doku açıklık ve geçirgenlik iyileştirmeyi amaçlayan kimyasal ve enzimatik tedavilere tabi tutulur. Bu tedaviler hücresel ve kromatin organizasyonu, DNA ve protein epitoplar korumak. Numuneler Kromatin immüno-lekeleme, in situ hibridizasyon (FISH) floresan ve heterokromatin analiz için DNA lekeleme gibi farklı alt sitolojik analizi için kullanılabilir. 3D rekonstrüksiyon geçmez yüksek çözünürlüklü konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) görüntüleme, tek hücreli çözünürlükte nicel ölçümler sağlar.

Bu tam montaj sitolojik boyanması için uygun olan Arabidopsis ovüller, büyük ölçekli hazırlanması ve işlenmesi için sağlam bir protokol sağlar. Gömme sayesinde, ovülller bir 3-boyutlu yapı (Şekil 3) korur. Ayrıca, optik açıklama dahil olmak üzere doku işleme yüksek çözünürlükte görüntüleme hücre içi yapıları sağlar. 4 heterokromatinin (hayır Dekonvolüsyonun bu resim için kullanılan) de göze çarpan odaklar tanımlandığı gibi parlak görünen tüm montaj tohumcuk primordiada DNA boya...

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Bu prosedürün genel amacı, Arabidopsis çiçek tutamlarını bütün monte hibridizasyon ve immün boyama için hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle taze çiçek tomurcuklarının tespit çözeltisinde tespit edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, tutamların dikkatlice diseke edilmesi ve doğrudan mikroskopi lamları üzerindeki minyatür akrilamid pedlere gömülmesidir.Ardından gelen doku işleme aşaması, doku şeffaflaştırma ve permeabilizasyonu sağlar. Son adım, işlem görmüş örneklerin immün boyama için bir antikor çözeltisiyle veya floresan in situ hibridizasyon için işaretli bir prob ile inkübe edilmesidir. Nihayetinde, yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme ve ardından gelen üç boyutlu rekonstrüksiyon, bütün montajda tek hücre düzeyinde kantitatif analize olanak tanır.Bu yöntem başlangıçta görüş alanındaki CT organizasyonuna dair bilgi sağlamak amacıyla kullanılmıştır, ancak daldırma işleminin diğer dokularındaki ve diğer model organizmalardaki diğer hücre kompartmanlarını analiz etmek için de uygulanabilir. Tüp başına 20 ila 30 karpal olacak şekilde, buz üzerinde soğutulmuş taze hazırlanmış BBO tamponu ile doldurulmuş mikrosantrifüj tüplerine karpalleri yerleştirin ve tüpleri oda sıcaklı

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Arabidopsis çift döllenmede sperm nükleer morfolojisi temelinde epifloresan mikroskobu kullanılarak başarılı veya başarısız döllenmeyi belirlemek için bir yöntem gösterilmektedir.

Arabidopsis Çift Döllenmede Sperm Nükleer Morfolojisinin İzlenmesi ile Döllenme Durumunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, Arabidopsis thaliana tohumlarında endosperm hücre tabakasının sağlam örneklerinin hazırlanmasını açıklar. Yöntem, yalnızca enjeksiyon iğnesi ve hassas forseps gibi yaygın laboratuvar ekipmanı gerektirir ve hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlardaki endosperm hücrelerinin yüksek çözünürlüklü floresan canlı hücre görüntülemesini sağlar.

Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Mayoz fazı sırasında kromozom hareketi, spor oluşumu için temel olan, yeterince anlaşılmamış bir olgudur. Bu protokol, Arabidopsis thaliana erkek mayositlerinde mayotik faz sırasında sentromer hareketlerini elde etmek, analiz etmek ve ölçmek için bir yöntemi açıklar.

Arabidopsis thaliana'da Erkek Mayoz Fazı Sırasında Sentromer Hareketlerinin Canlı Görüntüleme Karakterizasyonu

Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.

Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol

Erkek mısır meyositlerindeki bu immünolokalizasyon protokolü, meyoz sırasında hücrelerin üç boyutlu bütünlüğünü korur. Bu yöntem, korunmuş paraformaldehit sabit materyalde üç bağımsız antikorun hücre içi lokalizasyonunun dinamik izlenmesine olanak tanır; ayrıca DNA boyayan DAPI'ye ek olarak.

Mısır Meiositlerinde Üç Boyutlu İmmünolokalizasyon

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Keşfedin Arabidopsis thaliana ovüllerinde immün boyama ve FISH ile kromatin modifikasyonlarının ve nükleer mimarinin tek hücreli analizi. Bu yöntem bitki biyolojisi araştırmalarında yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem Arabidopsis (Video) | JoVE Journal

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet