Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem Arabidopsis

Bu prosedürün genel amacı, Arabidopsis Vues'u tüm mount hibridizasyonuna ve immüno boyamaya hazırlamaktır. Bu, önce taze çiçek tomurcuklarının fiksatif çözeltiye sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, vueleri minyatür akrilamid pedlere doğrudan mikroskopi slaytları üzerine dikkatlice incelemek ve gömmektir.

Daha sonraki doku işleme, doku berraklaşmasını ve geçirgenliğini sağlar. Son adım, muamele edilen numunelerin immüno-boyama için bir antikor çözeltisi veya C iki hibridizasyonunda floresan için etiketli bir prob ile inkübe edilmesidir. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme ve ardından üç boyutlu rekonstrüksiyon, tek hücre düzeyinde tüm montajda kantitatif analize izin verir.

Bu yöntem başlangıçta görünümde BT organizasyonu hakkında bilgi sağlamak için kullanıldı, ancak aynı zamanda daldırmanın diğer dokularındaki ve diğer model organizmalardaki diğer hücre bölmelerini analiz etmek için de uygulanabilir Tüp başına 20 ila 30 karpal oranında buz üzerinde soğutulmuş taze yapılmış BBO tamponu ile doldurulmuş mikro fuge tüplerine, tüpleri yarım saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallanacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, tüpleri 400 Gs'de bir dakika boyunca döndürün.Daha sonra süpernatantları dikkatlice aspire edin, atın ve karpallara bir mililitre PBT ekleyin. Her bir karpal tüpünün monte edilmesi için tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

Buz üzerinde hazırladınız. 200 mikrolitre içeren beş tüp. Taze yapılmış %5 akrilamid karışımı.

Bir kalemle etiketlenmiş beş temiz süper don slaytı, bir tüp karpaldan %20 PS'lik bir düşünce Eloqua ve %20'lik bir NAPS düşünce Eloqua'sı. Kesik uçlu dört veya beş tane alın ve her birini bir slayta yerleştirin. İnce iğneler kullanarak dikkatli bir şekilde pipetleyerek fazla sıvıyı çıkarın.

Karpallarda uzunlamasına kesimler yapın ve vues sıralarını serbest bırakmak için karpal duvarları çıkarın. Bu adım pratik yapacaktır. 10 mikrolitreye kadar PBS, ardından akrilamid karışımını içeren bir mikro füj tüpüne ekleyerek buharların kurumasını önleyin.

Hızlı bir şekilde 12 mikrolitre NAPS ve 12 mikrolitre PS ekleyin. Çözeltiyi pipetleme ile iyice karıştırın ve bu aktif akrilamidden 30 mikrolitre hızlı bir şekilde ekleyin. Disseke edilmiş vues ile bir slayt üzerine karıştırın. Preparatın üzerine nazikçe küçük bir örtü fişi yerleştirin ve çözeltinin oda sıcaklığında yaklaşık bir saat polimerize olmasına izin verin.

Her slaydı daha sonra bu şekilde hazırlayın. Kapak kızaklarını kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Numuneler, PBS'li bir koplan kavanozunda dört santigrat derecede gece boyunca saklanabilir veya doğrudan işleme devam edilebilir.

Genel olarak, işlem 80 mililitre çözelti içeren coplan kavanozlarında yapılmalıdır. Ve davlumbazın altında. Dokuları bir dizi metanol etanol, bire bir etanol ksilen çözeltisi ve tekrar etanol ve ardından metanol içinde inkübasyon yoluyla berraklaştırarak başlayın.

Her banyo beş veya 30 dakikadır. Metin protokolüne bakın. Ardından, 15 dakika boyunca %2,5 formaldehit içeren bire bir metanol PBT çözeltisi kullanın.

Daha sonra dokuyu PBT'de banyo başına 10 dakika boyunca iki kez durulayın. Bundan sonra, slaytlar gerekirse gece boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Ardından, kavanozdan altı slayta kadar alın ve fazla sıvıyı boşaltın.

Bunları bir kağıt mendil üzerine yerleştirin ve hızlı bir şekilde 100 mikrolitre soğutulmuş hücre duvarı sindirim enzimi ekleyin. Pedlerin üzerine karıştırın. Ardından slaytları büyük kapak fişleri ile örtün.

Slaytları nemli bir odada 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Her yeni enzimatik çözelti için CO sindirim sıcaklığını optimize etmek önemlidir, çünkü bu adım daha sonra homojen bir boyama için kritiktir. Slaytları yıkama başına beş dakika boyunca PBT ile iki kez yıkayın.

Ardından slaytları şimdi her slayta boşaltın. %1 ara ile tamamlanmış PBS'ye 100 mikrolitre RNA A ekleyin ve inkübasyondan sonra slaytları nemli bir odada 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin, slaytları daha önce olduğu gibi PBT ile iki kez yıkayın ve ardından slaytları 20 dakika boyunca taze yapılmış bir PBTF banyosunda inkübe ederek dokuyu tekrar sabitleyin. PBTF'yi PBT'de bir kez yıkayarak 10 dakika durulayın.

Daha sonra, slaytları PBS'de dört santigrat derecede iki saat boyunca% 2 ara ile inkübe ederek doku penetrasyonuna devam edin. Geçirgen solüsyonu çıkarmak için PBT'de her biri beş dakikada iki yıkama kullanın. Ardından immün boyama ile devam edin.

İlgilenilen birincil antikordaki slaytları inkübe etmekle başlayın. PBS'de seyreltilmiş ve her slayta %0.2 olacak şekilde antikorun 100 mikrolitre alikotunu uygulayın. Slaytları nemli bir odaya aktarın ve 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Slaytları bir PBT banyosunda iki ila dört saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayarak yıkayın. Daha sonra, PBS'de bir ila 200 oranında seyreltilmiş 100 mikrolitre ikincil antikor, 20 arasında% 0.2 ile ekleyin ve slaytları dört santigrat derecede 24 saat inkübe edin. PBT'de hafif sallanma ile bir saatlik bir banyo, bağlanmamış ikincil antikorun slaytlarını yıkamak için yeterlidir.

Daha sonra DNA'yı PBS'de mililitre propidyum iyodür başına 10 mikrogramlık bir çözelti ile lekeleyin. Boyamanın 15 dakika devam etmesine izin verin ve ardından slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hafif sallama kullanarak PBT ile yıkayın. Şimdi slaytları, mililitre propidyum iyodür başına 10 mikrogram ile desteklenmiş bir solma önleyici ortamla monte edin.

Bir saat bekletildikten sonra, slaytları 63 x gliserol daldırma lensi kullanarak konfokal bir mikroskopta görüntüleyin. Bu nedenle, görüntü alımı sırasında, karşılaştırmalı nicelemeyi sağlamak ve doğrusal bir algılama modu kullanmak için tarama ayarlarının numuneler arasında aynı tutulması çok önemlidir. Daha sonra seri görüntüleri üç boyutlu yapılar halinde yeniden oluşturun, ilgilenilen her bir çekirdeği bölümlere ayırın ve sinyalleri ölçmek için 3D görüntü işleme yazılımını kullanın.

Bu sağlam büyük ölçekli hazırlık protokolünü kullanarak, tüm Mount Vues üç boyutlu yapılarını koruyacaktır. Hücre altı yapılar kromatinde görüldüğü gibi yüksek detay ile görünür hale gelir. DNA boyanırken, hetero kromatin, dekonvolüsyon uygulamaya gerek kalmadan parlak ve iyi tanımlanmış odaklar olarak görünür.

Bu protokol, bir turda birkaç antikorla paralel immün boyamaya izin verir. Örneğin, U kromatinle ilişkili izin veren markör, H üç trimm metillenmiş lizin dört ve hetero kromatinle ilişkili markör H üç monometil lizin 27'nin her ikisi de, kromatin dinamiklerini analiz etmek için farklı replikat slaytlar üzerinde bir deneyde tespit edildi. Başka bir uyumlu teknik, floresan C iki hibridizasyon veya balık balığının 45 s.Ribozomal'a çıkarılmasıdır.

Nükleer organizasyon bölgelerini tanımlamak için DNA tekrarları kullanıldı. Prob doğrudan Alexa 4 88 ile etiketlendi ve DNA sayaçlar boyandı Ifikasyon analizi için, mümkün olan en düşük seviyede sağlam ve hogen sinyali veren koşulları belirlemek için farklı ve vücut seyreltmelerini ve inkübasyon sürelerini test etmek çok önemlidir. Ve vücut pişmanlığı.

Bu yöntem, kromatin organizasyonunun tek hücre analizi için dokunun mükemmel bir şekilde korunmasını ve optimal geçirgenliği sağladığından, bitki hücre biyolojisi veya bitki epi epigenetiği alanındaki bilim adamlarının nükleer veya hücre altı organizasyonu tek hücre düzeyinde ve tüm insan bağlamında araştırmalarının yolunu açar.