Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı zebra balığı larvalarındaki östrojene duyarlı hücreleri otomatik olarak tespit etmektir. Bu, östrojen raportörü zebra balığı embriyoları oluşturmak için önce beş X-E-R-E-G-F-P yetişkin balığının yetiştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, embriyolar 96 oyuklu bir plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına yerleştirilir.

Daha sonra embriyo tabağına östrojenler eklenir. Son olarak, plaka, motorlu bir aşamaya sahip bir epi floresan mikroskobu kullanılarak floresan için taranır. Sonuç olarak, östrojen reseptörlerinin dokuya özgü aktivitesini göstermek için floresan mikroskobu kullanılır.

Bu nedenle, bu tekniği kullanmanın yüksek verim veya yüksek içerikli tarama gibi diğer geleneksel tekniklere göre ana avantajı, zebra balığı larvalarındaki dokuya özgü floresansın sadece standart bir epi floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilmesidir. Motorlu bir tabla ile donatılmış, özel bir plaka okuyucu gerekli değildir. Dikkat: BPA ve estradiol içeren kimyasallar tehlikelidir ve insan fetüsü üzerinde zararlı etkileri olabilir.

Endokrin bozucuları dikkatli kullanın ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Bu gösteride, zebra balığı, zebra balığı yetiştiriciliğinden sonra döllenmeden 48 saat sonra başlayarak ve yumurtaları toplayıp eşitleyerek çeşitli dozlarda östrojen 17 beta estradiol, bisfenol A ve genine maruz bırakılacaktır. Tedavi günündeki metne göre, bir mililitre E üç B artı PTU girdabında bir ila 1000 arasında seyreltik çözülme stok kimyasal çözeltileri.

Araç kontrolü olarak. Büyük çaplı bir plastik transfer kullanarak E, üç, B ve PTU'da bir ila 1000 DMSO seyreltmesi kullanın. Pipet, her kuyucuk başına üç embriyoyu 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve koşul başına üç kuyucuk hazırlayın.

Uzun süreli tedavi sırasında ortamın buharlaşmasını önlemek için embriyoları dış kuyucuklara yerleştirmekten kaçının. Embriyoların kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışarak, ortamı her bir oyuktan çıkarın ve 200 mikrolitre iyi karıştırılmış tedavi çözeltisi ekleyin. Tüm embriyoların çözeltiye batırıldığını ve kuyu tarafına yapışmadığını görsel olarak onaylayın.

Embriyoları 72 saatte 28,5 santigrat derecede inkübe edin. Döllenme sonrası, mililitre trica başına 10 mikrolitre dört miligram ekleyerek embriyoları uyuşturun. Her birine, 96 kuyulu plakayı motorlu bir sahneye ve Zeiss Zen Blue 2011 yazılımını kullanarak iyice yerleştirin.

Numune taşıyıcı seçeneğini seçerek ve çok kuyulu 96'yı seçerek aşamayı kalibre edin. Ardından, 10 x objektif ve parlak alan veya BF ayarını kullanarak adım adım yönergeleri izlemeden önce kalibre et'i seçin, pozitif bir kontrol embriyosu tanımlayın ve pozlama ayarlarını BF ve GFP kanalları için uygun şekilde ayarlayın, floresan sinyalinin kamerayı doyurmadığından emin olun. Tek bir embriyoya odaklanın ve mikroskobu, mevcut odak düzleminin 50 mikrometre üstünde ve 50 mikrometre altında bir görüntü içeren toplam üç Z bölümü elde edecek şekilde programlayın.

Ardından, GFP ve BF kanallarını kullanarak döşenmiş bir görüntü elde etmek için yazılım parametrelerini ayarlamak için. Alma sekmesi altında gelişmiş kurulum'u seçin, döşeme bölgeleri'ni ve ardından döşemeler'i seçin. Daireyi seçin.

Kuyu seçeneği, seçilen kuyuların birden fazla görüntüsünü yakalamak için taşıyıcıyı ve doldurma faktörünü %90 olarak seçin, böylece her bir kuyu alanının %90'ı kompozit görüntüde görünür olacaktır. Seçenekler altında, görüntüler arasında düzgün bir dikiş sağlayan beş ila %10 gibi istenen örtüşme miktarını seçin. Ardından, 20 x objektif ve BF ayarını kullanarak görüntüleri manuel olarak yakalamak için görüntülemeye başlayın, pozitif bir kontrol embriyosunu tanımlayın.

BF ve GFP ayarlarını daha önce olduğu gibi ayarlayın ve fotoğraf çekin. Bu şekil, 96 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularından alınan kompozit görüntüleri göstermektedir. Her görüntü, %5 görüntü örtüşmesi olan 59 ayrı görüntüden oluşur.

Canlı zebra balığının her kuyucuk içinde rastgele yönlendirildiğini unutmayın. Yine de kalpteki floresanı karaciğerdeki floresanstan ayırt edebiliyoruz. Parlak alan görüntüleri, zebra balığı oryantasyonunu değerlendirmek ve morfolojik anormallikleri görselleştirmek için referans olarak kullanışlıdır.

Burada gösterilen görüntüler, daha ayrıntılı analiz için 20 x uzunluğunda bir çalışma mesafesi objektifi ile yakalanmıştır ve plakayı mikroskop aşamasından çıkarmadan az önce gösterilen otomatik taramadan hemen sonra alınmıştır. 20 x'lik bir objektif kullanılarak, kalpteki floresan, oklarla gösterilen atriyal ventriküler kapaklara ve ok ucuyla gösterildiği gibi aort kapaklarına tam olarak lokalize edilebilir. Bu tekniğe hakim olduktan sonra, günde 3.96 duvar plakasından görüntüler yakalanabilir.

Endokrin bozucu bileşiklerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi uygun önlemleri alın.