Name: Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, zebrafish embriyolarında doku spesifik floresans görüntüleme yöntemiyle östrojen reseptör aktivitesini incelemeyi. Bu yarı otomatik protokol, gelişim biyolojisi araştırmalarında hormonal etkileri anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Susan Çiftçi ve Zebra balığı bakımı için UAB Zebrafish araştırma tesisi çalışanlarına teşekkür ederiz. Farmakoloji ve Toksikoloji Bölümü start-up fonları tarafından Award.

NOT: Bu protokol Birmingham Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi de Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği ve Yumurta Koleksiyonlar <ol><li> Üç gün kimyasal maruz başlamadan önce, ayrı erkek ve kadınlar için bölücüler ile üreme tankları monte. Yetiştiricilik sistemi su ile her bir tank yarıya doldurun. Bir bölücü ayırarak her tankta 2 erkek ve 3 kadın yerleştirerek, üreme tanklarında c262/c262 balık: Bir ağının kullanılması, Tg (GFP 5xERE) aktarmak. Her tankın üzerinde bir kapak yerleştirin ve tarih ve çapraz olmak üzere suşları ile etiket. </li><li> Ertesi sabah, bütün engelleri kaldırmak ve eğim üreme tankının bir ucunda sığ bir alan yaratmak için perdeler. Zebra balığı kesin gelişimsel evreleme sağlamak için 10 dk aralıklarla embriyolar toplama, çiftleşmek için izin verin. Petri kapları içine E3B orta ve nazikçe yıkayın embriyolarını kullanarak bir çay süzgeci ile durulayarak temizleyin yumurta. Kalıcı yetişkin balık dönüntanklar. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak, sıralama, sayma, ve herhangi bir, döllenmemiş anormal veya hasarlı embriyolar kaldırmak. Karanlık döngüsü: 14:10 ışık ile 28.5 ° C&#39;de E3B orta ve evde Petri kapları içinde yer embriyolar. Embriyo yoğunluk gelişimini etkileyebilir. 60 x 15 mm tabak içinde bir 100 x 35 mm tabak en fazla 100 embriyolar ve en fazla 50 embriyolar yerleştirin. </li><li> 24 hpf tarafından, 200 uM 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) içeren E3B ile medya değiştirin. PTU pigment oluşumunu önler ve zebra balığı embriyolar ve gelişmiş görüntü netliği için şeffaf larva tutar. DİKKAT: konsantre PTU stok tehlikelidir; E3B + PTU çözüm yaparken eldiven giyin. </li><li> 1 gün sonrası döllenme (DPF), elle ince forseps kullanarak her embriyo koryon çıkarın. Koryon östrojenlerin penetrasyonu etkileyecektir görünmüyor, ancak kaldırma görüntü netliğini artırır. Medyadan chorions kaldırmak için bir ihtiyaç vardır. Not: el Dechorionation için bir alternatif olarak, embriyo toplu che edilebilir11, daha önce tarif edildiği gibi mically, 1 mg / ml pronaz tedavi ile dechorionated. </li></ol> Embriyoların 2. Kimyasal Arıtma <ol><li> İşlemden önceki gün, 1000-kat DMSO konsantrasyonu (ya da uygun bir çözücü) her kimyasal stok çözelti hazırlayın. Örneğin, 10 uM, bisfenol A (BPA) için embriyolar maruz% 100 DMSO içinde bir 10 mM stok solüsyonu BPA hazırlamak. Bu, her bir tedavi muntazam bir DMSO konsantrasyonu sağlar ve DMSO içinde, toksik olmayan bir 1:1000 seyreltme, bir vasıta kontrolü olarak hizmet sağlar. -20 ° C&#39;de Mağaza stok çözümleri Bu protokol için, embriyolar 1 ve 10 uM BPA, 18.5 nM ve 1.85 mcM genistein, 367 nM östradiol (pozitif kontrol) ve araç (% 0.1 DMSO, negatif kontrol) maruz kalacağı. DİKKAT: BPA ve östradiol gibi kimyasallar tehlikeli ve insan fetus üzerinde zararlı etkileri olabilir. Dikkatle endokrin bozucular Kulp ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.</li><li> Tedavi gününde, çözülme hazır kimyasal çözeltiler hazırlanabilir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 1 ml E3B + PTU pipetlenerek ve stok kimyasal çözelti 1 ul ekleyerek 1:1,000 sulandırmak. Vortex şiddetle. Bir vasıta kontrolü olarak E3B + propiltiyourasil&#39;i içine DMSO 1:1000 seyreltin. İşlem yapılmamış bir kontrol olarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 1 mL E3B + PTU kullanın. </li><li> 96 oyuklu bir plakanın her bir geniş çaplı plastik bir transfer pipeti, Petri tabaklarına transfer embriyolar kullanılarak, embriyolar per 3 de, durum başına 3 kuyu. Uzun süreli tedavi sırasında buharlaşmasını önlemek için, plakanın dış satırlar ve sütunlar (satırlar A ve E, kolon 1 ve 12) &#39;dan embriyolar sayın. Dış kuyu E3B + PTU 300 ul ile doldurulabilir. Uygun plaka kapağı etiketleyin. </li><li> Ince uçlu bir plastik transfer pipet ile her kuyu bulunan ortamı çıkarın. Embriyoların kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışır. </li><li> De karşılık gelen muamele çözeltisinin 200 ul ekleyin. Unde kapağı yerleştirinuygun kuyulara ilave tedaviler sağlamak için bir kılavuz olarak plaka rneath. Vortex her tüp çözelti içinde kimyasal dağıtmak için pipetleme önce. Görsel olarak, her embriyo muamele çözeltisi içinde olduğunu teyit. Embriyolar kuyunun tarafında ise, muamele çözeltisi ile iyice içine yıkamak için temiz bir aktarma pipeti kullanın. </li><li> 28.5 ° C&#39;de inkübatör plaka koyun Embriyolar 72 hpf floresan için analiz edilecektir. </li></ol> 96 oyuklu plakalar içinde Embriyolar 3. Otomatik Görüntüleme <ol><li> Her bir oyuğa, 4 mg / ml tricaine 10 ul ekleyerek embriyolar anestezisi. NOT: önce görüntüleme embriyolar anestezisi. 24-96 hpf, zebra balığı kendiliğinden hareket ve görüntü çekimi sırasında değişen ışık kaynağına bir irkilme tepkisi gösterirler. Embriyoların anestezi görüntüleme sırasında hareket azaltır. </li><li> Motorlu aşamasında 96 oyuklu plaka yerleştirin ve sahne kalibre edin. Zeiss Zen Mavi mikroskopi Automati için 2011 yazılımı kullanmave kontrol, numune taşıyıcı seçeneğini seçin ve çukurlu 96 seçin. kalibre seçin. Sahne kalibre adım adım yönergeleri izleyin. NOT: Bu adımdan sonra kiremit düğmesini işaretini kaldırın etmeyin. Fayans düğmesi işaretli ise, kalibrasyon ayarları kaybolabilir ve 96-plaka yeniden kalibre edilmesi gerekir. </li><li> Ayarı (BF), 10x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, BF ve GFP kanallar için uygun pozlama ayarlarını. Tek embriyo odaklanın ve toplam 3 Z-bölümleri, yukarıda bir görüntü 50 mikron ve mevcut odak düzleminin altında bir 50 um elde etmek için mikroskop programlamak. NOT: Farklı dokular farklı odak düzlemleri işgal Çünkü her zebrabalıkları görüntüleri odak kalp ve karaciğer ile yakalanan için, bu sağlayacaktır. </li><li> GFP ve BF channe kullanarak bir kiremitli bir görüntü elde etmek için yazılım parametrelerini ayarlayınls. Satın alma sekmesi altında, gelişmiş ayarları seçin. Seç karo bölgeler, daha sonra fayans. Daire iyi seçeneği seçin. NOT: Fayans her oyuğa bileşik bir görüntü oluşturmak için kullanılır. Tek bir alan-of-view her iyi sadece küçük bir kısmını yakalar. Fayans fonksiyonu otomatik olarak tüm kuyunun bir kompozit görüntü oluştururken, alanlar-görünümü her kuyudan birden fazla bitişik yakalayabilir. Her kompozit görüntü tek bir kuyudan birkaç düzine bireysel görüntüleri içeren nerede, otomatik olarak plaka başına 96 kompozit görüntüler yakalamak mümkündür. </li><li> Taşıyıcıyı seçmek ve faktör% 90 doldurun. % 90 dolgu faktörü belirlemek, her bir kuyunun alanının% 90, kompozit görüntüde görülebilir olacağı seçilmiş kuyucuklara birden fazla çekim olacaktır. Not: dolgu faktörü seçilirken, bir diyagramdır, görüntülenecek olan alanı temsil görüntülenecektir. Kuyunun alanını içerecek bir yüzdesini seçinbu deney için uygundur. </li><li> Seçenekleri altında, istenilen örtüşme miktarını seçin. NOT: Tek bir temsili görüntü için birlikte fayans Dikiş zaman,% 5-10 bir örtüşme görüntüleri arasında düzgün bir dikiş sağlar. Görüntü dikiş gereksiz Ancak,% 0 örtüşme kullanarak görüntüleme süresini azaltacaktır. % 90 dolgu faktörü ve% 5 üst üste kullanılarak, tek bir kuyunun bir kompozit görüntü 59 tek tek görüntü oluşur. </li><li> Görüntüleme başlayın. Mikroskop görüntüleri otomatik olarak kazanacaklardır. </li><li> Elle doku-spesifik floresan için de her kompozit görüntüler (Şekil 1) inceleyin. </li><li> NOT: Bu kimyasal maruziyet öncesinde deneysel tedavi kuyuları gözlemleyerek çalıştı onaylamak için pozitif kontrol ile başlamak en iyisidir. </li></ol> 96 oyuklu bir plaka içerisinde Embriyolar 4. Manual Resim yakalama NOT: sonuçlarını onaylamak ac için 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanmak içinquire daha detaylı görüntüleri manuel (Şekil 2). <ol><li> Ayarı (BF), 20x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, uygun BF ve GFP kanalları için pozlama ayarlarını. </li><li> Elle tek tek embriyo ve yakalama görüntüleri tespit. NOT: pozlama ayarları pozitif kontrol embriyo için seçildikten sonra, ayarları değiştirmek yok. Her bir görüntü muntazam koşullar altında yakalanır gibi bu floresan yoğunluğunun bir karşılaştırma sağlar. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir maddi çıkarları var.

Bu protokol, zebra balığı embriyolar otomatik görüntü dokuya özel floresan için basit bir yöntem tarif edilir. Protokol, bir Zeiss Axio Observer kullanılarak geliştirilmiştir. Z1 Zen Blue 2011 yazılım ile, ancak teknik kompozit görüntüler oluşturmak için fayans gerçekleştirebilirsiniz motorlu bir sahne ve mikroskop kontrol yazılımı ile herhangi bir ters mikroskop kullanılarak adapte edilebilir. Motorlu bir sahne ile ters bir mikroskop donatılması yüksek içerik tarama için özel ekipman satın alma için pratik, daha az pah...

Transgenik zebra balığı gibi fibroblast büyüme 1, retinoik asit 2 faktörleri ve canlı embriyolar, 3, östrojen gibi sinyal yolaklarına aktivite doğrudan görselleştirme için izin geliştirilmiştir. Bu tür araçlar (flüoresan yoğunluğundaki değişim olarak analiz) sinyal yolları bozmakta ve kimyasal ya da dokuya özel bir şekilde, 4 (floresan lokalizasyonunda değişim) olarak işaret modüle maddeler için tarama sağlar. Otomatik görüntü yakalama dramatik 5,6 kimyasal ekranların verimini artırır. Canlı Zebrafish otomatik tahlil floresan genellikle pahalı, özel ekipman güveniyor Ekranları. Sözde yüksek içerik tarama yüksek çözünürlük, sayısal görüntüleme ama konfokal mikroskopi 7,8 donanımlı özel plaka okuyucu kullanarak maliyetle yarar sağlar. Bu yöntemin amacı, zebra balığı embriyolar otomatik olarak analiz dokuya özel floresan etmektirStandart bir epifluorışıma mikroskobu kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde. Doku spesifik floresan bu tekniği kullanarak ayırt edilebilir ve özel plaka okuyucu veya yüksek içerik tarama donanımları ulaşamadıkları laboratuvarlar için makul bir yaklaşım olabilir. Bu protokol, biz 3 gün sonra döllenme (DPF) doku-spesifik östrojen reseptörü (ER) canlı zebrabalıkları agonistleri algılamak için otomatik görüntüleme kullanın. Transgenik satır Tg (5xERE: GFP) c262/c262 yeşil floresan protein (GFP) akış yukarı 5 tandem östrojen tepki elemanı DNA dizileri (ERE) içeren 3. Ligandın yokluğunda, ER normal olarak etkin değildir. Ligand bağlayıcı bir reseptör ERE DNA bağlama ve transkripsiyonu düzenleyen 9 sağlayan uygun bir değişiklik başlatır. 5xERE: GFP balık ER modülatörleri için kimyasal kütüphanelerinin taranması için kullanılabilir ve östrojenik kirletici maddeler için çevre su örnekleri taranması için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Plastik transfer pipetleri; geniş çaplı</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Plastik transfer pipetleri; ince uç</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu, yuvarlak, düz tabanlı plakalar</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>100 x 35 mm plakalar</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>35 x 60 mm plakalar</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ince forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td>uç boyutları 0,05 x 0,01 mm, embriyolardan koryonları manuel olarak çıkarmak için</td></tr><tr><td>Trikain metansülfonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>tarif için Zebra Balığı Kitabına bakın (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-fenil 2-tiyoüre (PTU)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>20 mM stok (100x) hazırlayın ve 200 & mu'da kullanın; E3B'de M&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protokolü, motorlu kademeli bir ters floresan mikroskobu gerektirir</td></tr><tr><td>20x uzun çalışma mesafesi objektifi</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>0,4 NA ve 8,4 mm çalışma mesafesine sahip bir objektif kullanıyoruz</td></tr><tr><td>Axiocam HRm dijital kamera</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 mikroskop kontrol yazılımı</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protokol, motorlu bir sahne Metilen Mavisi Sigma Aldrich MB-1 kullanarak döşenmiş görüntülerin yakalanmasını sağlamak için mikroskopi otomasyonu ve kontrol yazılımı gerektirir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>; 25 gram</td><td>, E3B (aşağıda)</td> E3B</tr><tr><td></td><td></td><td></td> 60X E3'te kullanım için RO suyunda% 2'lik çözelti oluşturur <td>ÇÖZÜM: NaCl ve nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17.2 gram KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.76 gram CaCl2-2H<>sub2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2.9 gram MgSO4-7H2O&nbsp; - 4.9 gram veya MgSO4 - 2.39 gram 1 litre Milli-Q suda çözülür; Steril 1 litrelik şişede saklayın. ZEBRA BALIĞI IÇIN 1X E3B ÇÖZÜMÜ: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 ml %2 metilen mavisi&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 ve mu; l&nbsp; Milli-Q su ile 9 litreye getirin & nbsp;</td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyolar doku spesifik floresans yarı otomatik görüntüleme

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embriyolar küçük moleküllerin büyük ölçekli tarama için güçlü bir araçtır. Floresan haberci proteinleri eksprese eden transjenik zebra balığı sıkça, gen ekspresyonunu modüle eden kimyasal tanımlamak için kullanılır. Canlı Zebrafish floresan tahlil Kimyasal ekranlar genellikle yüksek içerik tarama için pahalı, özel ekipman güveniyor. Biz, bir motorlu kaide otomatik görüntü zebra balığı embriyolar için olan standart bir epifluorışıma mikroskop kullanılarak bir prosedür tarif ve dokuya özel floresan tespit eder. GFP ekspresyonu üzerinden östrojen reseptörü aktivitesi rapor transgenik zebrafish kullanarak, bir dokuya-özgü şekilde raportör aktif östrojen reseptör ligandları taranması için bir yarı-otomatik bir prosedür geliştirilmiştir. Bu videoda, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 24-48 saat sonra döllenme (HPF) at zebra balığı embriyolar arraying ve östrojen reseptörlerine bağlanan küçük moleküller eklemek için işlemleri tarif eder. 72-96 hpf, her görüntüleri kuyudantüm plaka otomatik olarak toplanan ve el doku-spesifik floresan için denetlenmektedir. Bu protokol, ancak karaciğer, kalp valfleri reseptörlerinin aktive östrojen algılama yeteneği göstermektedir.

Şekil 1, bir 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğinden bileşik görüntüleri gösterir. Her kompozit görüntü% 5 görüntü bindirme ile 59 ayrı görüntü oluşur. Canlı Zebrafish de her biri içinde rastgele odaklı, henüz biz karaciğer kalp floresan ayırt edebiliyoruz unutmayın. Zebra balığı aydınlık görsel yönünü belirlemek ve morfolojik anormallikleri (Şekil 1 A ve 1 C) görselleştirmek için referans olarak yararlıdır. 10x objektif kullanılarak otomatik görüntüleme kimyasallar ekran ve daha yüksek...

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı zebra balığı larvalarında östrojen duyarlı hücreleri otomatik olarak tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle östrojen raporlayıcı zebra balığı embriyoları üretmek için beş X-E-R-E-G-F-P yetişkin balığın çiftleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, embriyolar 96 kuyucuklu bir plakanın münferit kuyucuklarına yerleştirilir.Ardından, embriyoların bulunduğu plakaya östrojenler eklenir. Son olarak, plaka motorize tabla tertibatlı bir epi floresan mikroskop kullanılarak floresan açısından taranır. Nihayetinde, östrojen reseptörlerinin dokuya özgü aktivitesini göstermek için floresan mikroskopi kullanılır.Bu tekniği yüksek kapasiteli veya yüksek içerikli tarama gibi diğer geleneksel tekniklere tercih etmenin temel avantajı, zebrafish larvalarındaki dokuya özgü floresansın sadece standart bir epi-floresan mikroskop kullanılarak görüntülenebilmesidir. Motorize bir sahne ile donatıldığında, özel bir plaka okuyucuya gerek duyulmaz. Dikkat: BPA ve estradiol içeren kimyasallar tehlikelidir ve insan fetüsü üzerinde zararlı etkileri olabilir.Endokrin bozucuları dikkatli bir şekilde taşıyın ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Bu gösterimde, zebra balıkları çiftleştirilip yumurtalar toplandıktan ve eşitlendikten sonra, döllenmeden 48 saat sonra başlayarak çeşitli dozlarda 17 beta estradiol, bisfenol A ve genine östrojenlerine maruz bırakılacaktır. Metne göre, uygulama gününde, çözülmüş stok kimyasal çözeltileri bir mililitre E3B+PTU içinde 1:1000 oranında seyrelterek kuvvetlice vorteksleyin.Araç kontrolü olarak. Büyük ağızlı plastik transfer pipeti kullanarak E3B ve PTU içinde 1/1000 oranında DMSO dilüsyonu kullanın. Her koşul için üç kuyucuk hazırlayarak, 96 kuyucuklu bir plakaya her kuyucuğa üç embriyo transfer edin.Uzun süreli işlemler sırasında besiyerinin buharlaşmasını önlemek için embriyoları dış kuyucuklara yerleştirmekten kaçının. Embriyoların kurumasını önlemek amacıyla hızlıca hareket ederek, her kuyucuktaki besiyerini uzaklaştırın ve 200 µL iyice karıştırılmış işlem solüsyonu ekleyin. Tüm embriyoların solüsyonun içinde kaldığını ve kuyucuk duvarlarına yapışmadığını gözleyle doğrulayın.Embriyoları 28.5 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin. Döllenme sonrası, 4 mg/mL trica çözeltisinden 10 µL ekleyerek embriyoları anesteziye alın. 96 kuyucuklu plakayı motorlu bir tablaya yerleştirin ve Zeiss Zen Blue 2011 yazılımını kullanın.Örnek taşıyıcı seçeneğini belirleyip 96 kuyucuklu (multi well 96) seçeneğini seçerek sahneyi kalibre edin. Ardından, adım adım talimatları izlemeden önce kalibre seçeneğini belirleyin; 10x objektif ve parlak alan veya BF ayarını kullanarak pozitif kontrol embriyosunu tanımlayın ve floresan sinyalinin kamerayı doyurmadığından emin olarak BF ve GFP kanalları için pozuzlama ayarlarını uygun şekilde yapın. Tek bir embriyoya odaklanın ve mikroskobu, mevcut odak düzleminin 50 µm üzerinde ve 50 µm altında birer görüntü olacak şekilde toplam üç Z kesiti alacak şekilde programlayın.Ardından, GFP ve BF kanallarını kullanarak döşemeli (tiled) bir görüntü elde etmek için yazılım parametrelerini ayarlayın. Edinme (acquisition) sekmesi altında, gelişmiş kurulumu (advanced setup) seçin, döşeme bölgelerini (tile regions) ve ardından döşemeleri (tiles) seçin. Daireyi seçin.Seçilen kuyucukların birden fazla görüntüsünü yakalamak için kuyucuk seçeneği taşıyıcısını ve her bir kuyucuğun alanının %90'ının kompozit görüntüde görünür olmasını sağlayacak şekilde %90 dolgu faktörünü seçin. Seçenekler altından, görüntüler arasında pürüzsüz bir birleşim sağlayan %5 ile %10 gibi istenen örtüşme miktarını seçin. Ardından, 20 x objektif ve BF ayarını kullanarak görüntüleri manuel olarak yakalamak için görüntülemeyi başlatın ve pozitif kontrol embriyosunu tanımlayın.BF ve GFP ayarlarını daha önce olduğu gibi ayarlayın ve görüntüler alın. Bu şekil, 96 kuyucuklu bir plakanın münferit kuyucuklarından alınan kompozit görüntüleri göstermektedir. Her bir görüntü, %5 görüntü örtüşmesine sahip 59 münferit görüntüden oluşmaktadır.Canlı zebrafishlerin her bir kuyucuk içinde rastgele yönlendikleri unutulmamalıdır. Buna rağmen, kalpteki floresan ile karaciğerdeki floresanı ayırt edebiliyoruz. Brightfield görüntüleri, zebrafish yönelimini değerlendirmek ve morfolojik anomalileri görselleştirmek için referans olarak kullanışlıdır.Burada gösterilen görüntüler, daha ayrıntılı analiz için 20 x uzun çalışma mesafeli objektif ile yakalanmıştır ve plaka mikroskop tablasından çıkarılmadan, az önce gösterilen otomatik taramanın hemen ardından alınmıştır. 20 x objektif kullanıldığında, kalpteki floresans, oklarla belirtilen atriyoventriküler kapaklara ve ok ucuyla gösterilen aort kapaklarına hassas bir şekilde lokalize edilebilir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, günde 3 adet 96 kuyucuklu plaka görüntüsü yakalanabilir.Endokrin bozucu bileşiklerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu donanım kullanmak gibi gerekli önlemleri her zaman alın.

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Kaynak: Zhang, X., ve diğerleri. Biyomateryalle İlişkili Staphylococcus aureus Enfeksiyonunun İn Vivo Görselleştirmesi ve İntravital Analizi için Zebra Balığı Embriyo Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Staphylococcus aureus enjekte edilen zebra balığı embriyolarının floresan görüntülemesini göstererek, biyomateryal mikrokürelerin in vivo konakçı-patojen etkileşimleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için enfeksiyon ilerlemesinin ve bakteri dağılımının ölçülmesini sağlar.

 Zebra Balığı Embriyolarında Biyomateryalle İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonun Floresan Görüntülemesi

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Öğrenin, zebrafish embriyolarında doku spesifik floresans görüntüleme yöntemiyle östrojen reseptör aktivitesini incelemeyi. Bu yarı otomatik protokol, gelişim biyolojisi araştırmalarında hormonal etkileri anlamaya katkı sağlar.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Daha fazla video keşfet