Name: Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin bıldırcın-ördek kimeraları kullanarak kraniyofasiyal gelişimde sinir kreti hücrelerinin tür özgü katkılarını inceleme yöntemini. Bu teknik gelişim biyolojisi araştırmalarında evrimsel süreçleri anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Diş Ulusal Enstitüsü ve Kranyofasyal Research (NIDCR) F32 hibe (DE021929) JLF ve RAS bir NIDCR R01 hibe DE016402 tarafından finanse edildi

1.. Tungsten iğneler hazırlayın <ol><li> Çubuk viraj değil ki tel kesiciler kullanarak yarısında bir tungsten çubuk kesti. </li><li> 5 borosilikat cam 3/4 Pasteur pipet konik ucundan çubuk geçirin. </li><li> Camdan dışarı çubuk yapışma yaklaşık 3/4 bırakarak, bir tutkal tabancası için kullanılan tutkal sopa &quot;sıcak eriyik yapışkan&quot; (HMA), küçük bir boncuk ile pipet için çubuk uygun. HMA hızlı bir şekilde tutkal yakmak ve siyah duman üretmek için özen gösterilerek, bir alkol alev eridi olmalıdır. </li><li> Forseps bir çift kullanarak, 45 ° &#39;lik açı ulaşana kadar (yaklaşık 1/4 üst ucundan olarak) tungsten çubuğunun uç viraj. </li><li> Pasteur pipeti tutarak, bir propan meşalesi alev içine tungsten çubuğun ucunun yaklaşık 1/8 yerleştirin. Ucu sabit ve aleve tam dik tutun. </li><li> Alevin dışarı iğne çekin an Tungs küçücük bir turuncu lekeiğne kapalı on sinekler. </li></ol> 2.. Spemann Pipetler hazırlayın <ol><li> Kısa konik ötesinde cam erimeye başlayana kadar bir Bunsen beki kullanarak, bir Pasteur pipet dar ucuna ısı. Alev çıkarın ve pipet mühürlü olana kadar ucu çekin. Yaklaşık 0.7-1.0 mm OD sahip şevli kısmının bir kısmı kalır emin olun. Konik yaklaşık 4 cm kapalı mühürlü ucunu kırın. </li><li> Pipet geniş (açık) ucuna lastik tüp yaklaşık 2 ft (60 cm) takın. Hava Pasteur pipet şevli kısmı ile geçiş sağlamak için kauçuk hortumun diğer ucunda darbe. </li><li> Bağlı bir kalem ile bir alev meşale propan yakıt silindir kullanarak, sadece konik başından altında pipet bir tarafında bir oval alan ısı. Basınç cüzi bir miktarı (lette başlangıcını söylemek için gerekli basınç yaklaşık miktarı ile kauçuk borular yoluyla, çok yavaşça ve sürekli üfleyinkonuşma düzeyinde r &quot;P&quot;). Cam bir tarafta yumuşak olur ve dışa toka başladığında, hızla alevden pipet kaldırmak ve lastik borular yoluyla sabit ve istikrarlı darbe. Bu ısıtılmış cam parçası ince olduğu, pop sosis şeklinde bir kabarcık oluşmasına neden olur. Kabarcık çok küçük ise, erime ve tekrar cam üfleme deneyin. Camda son açık pencere geniş uzun (12.7 mm) &#39;in 0,5 (6,35 mm), 0.25 civarında olmalıdır. </li><li> Sivri ucunu işaret yukarıya, yavaşça pipet girmesini cam parçaları önlemek için tüp yoluyla üflerken cam atık kabı içine balonu kazıyın. </li><li> Propan alev kullanarak, kabarcık ve yangın lehçe açık pencerenin kenarları arasında kalan kenarlarını yakmak. Pipet şaftı eritmek için özen gösterin. </li><li> Bir elmas nokta kalem kullanarak, penceresinden (30 mm) yaklaşık 1.25 pipet sivri ucunu puan ve ucu koparakforseps ile pipet açılış temiz (kırık veya düzensiz ipuçları ile ıskarta pipet) kesilir böylece. </li><li> Forseps kullanılarak ve bükük kısmı dikey bir düzlemde olacak şekilde, bir alkol, bir brülör ile alev kenar, yaklaşık 60 ° &#39;lik bir açı için ucundan (9.5 mm)&#39; de pipet 0.375 dar kısmını viraj sırasında pencere açma solak kullanım için sağ-elli kullanım ve 11:00 için 01:00 pozisyondadır. Bu adım en bir taslak serbest muhafaza yapılır. </li><li> Yangın lehçe bir mikroskop altında alkol alev kullanarak ucu. Ucunu kapatmak değil yuvarlak açılış tutmak ve herhangi bir daralma olmadan düzeltmek için değil emin olun. </li><li> , Kauçuk borudan yapılmış bir 1 (25 mm) parça kesin% 70 etanol ile boru parça sprey ve pencere açıklığı tamamen kapalı kadar pipet milin üzerine boru kaydırın. Bu Spemann pipet &quot;diyafram&quot; olarak çalışır. </li><li> Bir lateks kauçuk 2 ml ampul yerleştirinpipet açık alt bitti. Ampul Spemann pipet negatif basıncı korur. </li><li> , Spemann bir pipet kullanarak uygulama, bir mikroskop altında bir başka belirgin bir noktaya bir Petri kabındaki belirgin bir nokta çapı, yaklaşık 100-200 um&#39;lik kromatografisi boncuk aktarın. </li><li> Spemann pipet temizlemek için, alt pamuk veya gazlı bez ile kaplı ve distile su ve cam deterjan ile dolu uzun bir beher içinde, aşağı ucu, kauçuk ampulü ve yer pipet kaldırmak. </li></ol> 3.. Yumurta Sterilize ve inkübe <ol><li> % 70 etanol ile yumurta silin ve plastik yumurta tepsiler üzerinde yumurta yerleştirin. </li><li> 37.5 ° C ve 85-87% ısıtılmış bir inkübatör yumurta ayarlayın. </li><li> Onlar HH9.5, bıldırcın ve ördek için 48 saat boyunca yaklaşık 26 saat ulaşana kadar kuluçkaya. </li></ol> 4. Pencere Yumurta <ol><li> Iç kabuk m ponksiyon için özen, forseps ile yumurtanın üst dış kabuk küçük bir parça kaldırmazarı böylesine. </li><li> 1 inç iğne ile bir 18 G ile bir şırınga kullanarak, yumurta en dar ucunda bir delik açmak ve albümin yaklaşık 1-2 ml geri. </li><li> Kabuğunda delik ve delinme işareti üzerinde şeffaf bant yerleştirin. </li><li> Kavisli makas kullanılarak (saydam bant üzerinden) yumurtanın üst yüzeyi boyunca bir &quot;pencere&quot; kes. </li></ol> 5.. Embriyolar canlandırın ve Cerrahi hazırlanın <ol><li> Bir cam çubuk kullanılarak, yavaşça embriyo üzerinde Nötr Kırmızı küçük bir miktar (Hank BSS içerisinde 0.02 g / ml) fırça. </li><li> Vitellin membran kesin ve bir alev bilenmiş tungsten iğne kullanılarak embriyo üzerinden çekin. </li><li> Pencere üzerinde saydam bant koyarak yumurtayı yeniden mühürlemek. </li></ol> 6.. Donör Embriyo gelen Donör Doku ayırın <ol><li> Donör embriyo yumurtanın üzerinde penceresinden bandı çıkarın. </li><li> Donör embriyo komşu ektodermden sinir kat kesmek için, sid hem yarıklar yapmak(yukarıda tarif edildiği gibi imal edilmiştir) bir alev keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanılarak nöral tüp es. </li><li> Daha sonra, greft istenilen ön ve arka seviyede nöral tüpü boyunca kesilmiş ve nöral tüpün geri kalanından ayrı greft. </li><li> Bir Spemann pipet veya mikropipet diğer türlerinden birini kullanarak donör embriyo sinir kat çıkarın. </li><li> Sonra, ev sahibi yumurta üzerine penceresinden bandı çıkarın ve nakli alacak nöral tüp bölgeye bitişik ev sahibi embriyo yanında donör sinir kat yerleştirmek için Spemann pipet kullanın. </li></ol> 7. Ana Doku ayırın ve Donör doku nakli <ol><li> Donör ile yapıldığı gibi, ev sahibi embriyo nöral tüp sinir kat ayırın. Donör doku olarak eşit büyüklükte bir greft çıkarmak için özen. </li><li> Yavaşça uzak embriyo bu konak doku itin. </li><li> Daha sonra, kör bir iğne veya bir tungsten mi yuvarlatılmış ucu ilecropipette, yavaşça uygun ön-arka ve ön-ventral yönelimleri bakımı, donör sinir konak nöral tüp içine kat taşıyın. Greft kenarlarında sıkışmış olduğundan emin olun, ancak karıştırmak veya alttaki dokulara zarar değil emin olun. Orijinal yönü notun Nötr Kırmızı gelen donör doku veya diferansiyel boyama herhangi bir asimetri izlemenize yardımcı olmak için. Biz de fotoğraf-belge eşlik kesilmiş doku yanı sıra kimerasıyla donör embriyo hemen ameliyatı takiben. </li><li> Ev sahibi embriyo kuruma belirtileri gösteriyorsa, steril tuzlu yumurta ilave edilmelidir. </li><li> Şimdi, dikkatle yeniden mühür ve yumurta etiket ve yavaşça kimerik embriyo analizi için istenilen aşamaya gelişebilir bir yüksek nem inkübatör (% 70-80) iade. </li></ol> Kimeralar 8. Koleksiyonu <ol><li> Taze yapılmış soğuk Serra&#39;nın sabitleştirici kimerik embriyolar toplamak ve hemen bir ro üzerine koyun emin olunBir O / N tespit boyunca 4 ° C&#39;de cker. Bu, anti-bıldırcın antikoru ile bıldırcın hücrelerin daha hassas bir şekilde tespit sağlayacaktır. </li><li> Gen ifadesi RT-QPCR ile analiz için, önceden RNA ekstre sıvı azot içinde doğrudan embriyolar dondurma. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Nöral krest embriyo boyunca yoğun göç ve kraniofasiyal iskeletine katkıda kondrosit ve osteoblast dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri, içine ayırır geçici embriyonik hücre popülasyonu. Bıldırcın-ördek kimerik sisteminde nöral kret nakli kraniofasiyal iskelet gelişimini düzenleyen doku etkileşimleri ve sinyal yollarının anlayışımıza büyük katkıda bulunmuştur. Ancak, düz kas hücreleri, adipositleri, melanosit, Schwann hücreleri ve nöronlar oluşturmak için nöral büyük potansiyeli göz önüne alındığında, bıldırcın-ördek kimera sistem özellikle kök hücre biyolojisi hızlı ilerlemesi ile birlikte gelecek uygulamaları için muazzam bir potansiyele sahiptir ve rejeneratif tıp. Bıldırcın ve ördek hem ticari yetiştirilen türler olduğu için, nispeten ucuz döllenmiş yumurta hazır bir tedarik Çiftliklerin çeşitli edinilebilir. Böylece, bu teknik araştır erişilebilir olmalıdıronun bütçeleri ve tesis alanı geniş bir aralıkta faaliyet göstermektedir. Bu teknik çok güçlü olmasına rağmen, bazı sınırlamalar da kalır. Diğer cerrahi teknikleri gibi, bıldırcın-ördek kimeralarının kalitesi ve canlılığı araştırmacı cerrahi beceri güveniyor, ve bu nedenle, bu tür olanlar kullanan fare gibi diğer modellere kıyasla gibi deneyler arasında daha arası ve içi bireysel farklılıklar olacaktır genetik. Ayrıca, yeniden üretilebilirlik ve her nakli başarısına katkıda gelişimi ve bireysel embriyolar aşamalarının oranlarında varyasyon da vardır. Avian embriyoları, aynı zamanda su kaybı çok duyarlıdır ve ameliyat sırasında bu nedenle önemli bir adım minimuma mikroskop altında, düşük zaman ışık seviyelerini tutmak arasında, mümkün olduğu kadar çok yumurta bantla kapatılır, ve ameliyat sonrası inkübatör içinde yüksek nem kurumayı önlemek. Kimeralar canlılığı, u açısındanbu oranlar eski toplama aşamasını azaltabilirsiniz rağmen sually arasında% 50-75, hayatta. Cerrahi tipik 4-6 saat oturumda, deneyimli bir cerrah 10-15 kuruntulardan üretebilir. Nakli başarısı da araçların kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. İyi araçları daha tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlara yol. Tungsten iğne yapmak için bir propan meşale kullanarak son derece keskin iğneler yapılmasını sağlar. Bu alevin boyutunu denetler, çünkü kullanılan meşale türü büyük bir fark yaratıyor. Elektrolitik bileme da kullanılabilir, ancak bu yaklaşım bile keskin iğneler üreten yakın gelmiyor. Iğneler düz yapılabilir böylece yerine biriktirilen tel tungsten çubuklar kullanın. Spemann mikropipet, zaman alıcı ve yapmak zor, doku transferi için ideal bir araç iken. Pipet, farklı büyüklükte açıklıkları ile özelleştirilebilir, ve tekrar tekrar kullanılabilir. Istimal için kritik bir faktörga Spemann mikropipet embriyo yüzeyine ucu dokunmadan önce pipet bazı sıvı sahip olmaktır. Iletişim embriyo üzerinde menisküs ile yapıldığında sıvı bir kısmı her zaman dışarı akar. Biraz diyafram kadar izin yavaşça pipet içine donör greft dokusu berbat ise diyafram basılması, sıvı ve greft dokusu çok hassas dışarı sağlar. Diyafram pozitif basınç biraz bakımı aktarımı sırasında pipet ucu da verici aşı doku tutar ve diyafram küçük bir ek basınç verici doku grefti kasıtlı olarak konakta yerleştirilmesini sağlar. Depolama ve sterilizasyon sırasında Spemann pipet korunması için, geniş ucundan ampulü çıkarın ve dikkatli ampul içine konik ucu takın. Alüminyum folyo ile üst kapak ve ameliyat öncesi, otoklav, bir cam test tüpünde Spemann pipet yerleştirin. Birden pipetler yeniden olduktan sonraAmeliyat için yeniden sterilize edilecek Ady, pipetler ters damıtılmış su ve cam deterjan aynı çözelti içinde kaynamaya yaklaşık onları ısı ve daha sonra damıtılmış su ile tekrar tekrar yıkanır. Bireysel tüplerin Otoklav pipetler. Bunlar karanlık ve sert olunca diyafram ve kauçuk ampulü oluşturan kauçuk boru birkaç sterilizasyonlarda sonra değiştirilmesi veya gerekir. Bu protokolün bileşenleri çok tehlikeli ekipmanları içerir. Örneğin, Spemann Mikropipet yapmak için Prosedür üç alev tipleri hem de ısıtma, üfleme çekme, bükme, kesme, parlatma ve cam içerir. Bu nedenle, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyen gözlük gibi güvenliği artırır ve bir laboratuvar önlüğü kritik olduğunu. Ayrıca, birçok kişi muzdarip, ya, yumurta alerji gelişebilir yumurta tutarken her zaman eldiven kullanmak için potansiyel var çünkü. Akılda bu önlemler, bıldırcın-ördek kimerik sistemi ile iBirçok gelecek uygulamalar vardır sa, güvenli, verimli, ve nispeten ulaşılabilir bir yöntemdir.

Yüz iskelet ektodermal ve Endodermal epitel katmanları 1-11 çevrili nöral ve mezodermal mezenşimden oluşan birden fazla yüz süreçlerin büyüme ve füzyon gelişir. Her süreçte morfojenetik olaylar mezenşimin ve çevresindeki epitelya 12-16 arasında belirgin sinyal etkileşimler tarafından yönetilir. Bu sinyal etkileşimleri ve / veya onların aşağı efektörlere değişiklikler hastalık fenotipleri katkıda bulunmak ve aynı zamanda kraniofasiyal iskelet 17, 18 evrimi ile ilgili olabilir. Bu nedenle, doku etkileşiminin zamanlamasını ve niteliğini durulaştırmada yüz iskeletinin gelişimsel ve evrimsel biyoloji anlayışımızı arttırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Doku etkileşimleri araştırmak için kimerik embriyoların kullanılması gelişimsel biyoloji içinde uzun bir geçmişi vardır. Bu yaklaşım Hans Spemann ve onun laboratuar tarafından öncülük edilmiştirFarklı amfibi türlerin embriyolarının arasındaki dokuların nakli ile embriyonik &quot;organizatörleri&quot; keşfetti. Spemann el becerileri özel araçlar, özellikle Spemann pipet yaptığı kalkınma tarafından tamamlanmaktadır mikro-cerrahi teknikleri bir usta oldu. Viktor Hamburger Spemann Nobel ödülünü neden orijinal nakli deneyler yapıldı, hangi zaman, 1920&#39;lerde Freiburg Hans Spemann laboratuvarında bir yüksek lisans öğrencisi oldu. Hamburger 1935 yılında St Louis Washington Üniversitesi taşındı, o Deneysel Embriyoloji 19 onun Kılavuzunda bir Spemann mikropipet yapma sürecini ayrıntılı. Drew Noden Massachusetts, Amherst Üniversitesi ve daha sonra Cornell Üniversitesi taşındıktan sonra, Noden imalatı ve bıldırcın-civciv kuruntulardan ilgili yaptığı cerrahi nakli için Spemann mikropipetler kullanmaya devam etti. 1972&#39;ye kadar Washington Üniversitesi&#39;nde Hamburger laboratuvarında bir yüksek lisans öğrencisi oldu. &amp;# 160;. Bir yüksek lisans öğrencisi, 1995-1998 Cornell Drew Nodén eğitimli yazarlar (Rich Schneider) biri Spemann mikropipet yapmak için aşağıdaki protokol Hamburger ve Nodén tarafından yazılı açıklamalara göre, ve sonradan yaptığınız değişiklikleri içerir iken Schneider tarafından. Kraniofasiyal geliştirme çalışmaları için ve özellikle nöral krest hücrelerinin katkılarını anlamak için bıldırcın-civciv kimeralarının kullanımı Le Douarin ark 20 yorumlanan 1970&#39;lerin başında Nodén tarafından ve Le DOUARIN tarafından öncülük edilmiştir. Bu yaklaşım genel olarak birçok çalışma ve çok sayıda diğer araştırmacılar 1, 4, 5, 21-38 tarafından kabul edilmiştir. Büyüme ve bıldırcın ve civciv morfolojisi eşdeğer oranları hücre kaderinin ve soy izleme çalışması için içlerinde nakli idealdir. Ancak, bıldırcın ve civciv arasındaki benzerlikler, morfolojik değişimler inddonor hücreler tarafından uced deşifre etmek zordur. Buna karşılık, diğer kuş kimerik sistemleri 39-50 embriyolar anatomik olarak farklı yapmak mekanizmaları incelemek için bir yol olarak yerli ördek dahil ettik. Daha spesifik olarak, bıldırcın-ördek kimerik sistemi ev sahibi, ve tersi üzerinde donörün etkilerini sezmek için birden çok yarar sağlar. İlk olarak, bıldırcın ve ördek embriyolar gen ekspresyonu (Şekil 1 A ve B) &#39;nin diferansiyel etki için tahlil ile oluşum arasında verici veya konak-spesifik mekanizmaları keşfetmek için doğrudan bir yol sağlar vücut boyutu ve şekli, içinde farklıdır. İkincisi, bıldırcın ve ördek embriyo bıldırcın 17 günde çıkım ve ördek 28 gün içinde kuluçka ile, olgunlaşma oldukça farklı fiyatlar var. Nakledilen sinir ucu ana ortam içindeki iç olgunlaşma oranını muhafaza eder ve bu nedenle, geçici gen ekspresyonunda değişiklikler, doku etkileşimlerinin, histogenez ve morfojenezinin tanımlanması mümkündür51-57. Son olarak, anti-bıldırcın nükleer antikor (PN ¢ Q) verici ve ev sahibi hücresel katılım her yerde bulunan bir bıldırcın hücrelerinde ifade ancak ördek hücrelerinde bulunmaz bir proteini tanıma ile birbirinden ayırt kalıcı olmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s BSS, fenol kırmızısı</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr>, <tr><td>Nötr Kırmızı</td><td>Sigma</td>, <td>Aldrich N4638-5G</td>, <td>0.22 ve mikro; m filtreyle sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>18 G İğneler</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 ml şırınga</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Dumont forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Düz Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Spemann Pipet</td><td></td><td></td><td>Laboratuvarda el yapımı</td></tr><tr><td>Yumurta Tutucu</td><td></td><td></td><td>Cam küllük ve modelleme kili</td></tr><tr><td>Alkol Brülör</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Bant</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Cam Karıştırma Çubuğu</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td> Uç, bir alev Tungston teli (0.004 x 3 inç) <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>kullanılarak daraltılır ve yuvarlanır.Uç, propan meşalede alevle keskinleştirilmiştir</td></tr><tr><td>Bunsun Brülör</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9 inç (229 mm)</td></tr><tr><td>Kauçuk Boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>kehribar, ince duvarlı doğal kauçuk; duvar kalınlığı: 0,0625 inç / 1,6 mm; Dış Çap: 0,375 inç/9,5 mm; İç Çap: 0,25 inç/6,4 mm</td></tr><tr><td>Propan Yakıt Silindiri</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9, "A" meşale stili "A" ile vidalı pirinç "kalem alevi" meşale ile</td></tr><tr><td>Elmas Uçlu Kalem</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk Ampuller</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

bıldırcın-ördek chimeras kullanma kraniyofasiyal kalkınma için türlere özgü katılımlar değerlendirilmesi

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Kimerik embriyoların nesil cep kaderlerini, doku etkileşimleri ve histolojik ve omurgalı embriyolarının morfolojik gelişimine türe özgü katkılarını araştırmak için yaygın ve güçlü bir yaklaşımdır. Özellikle, kimerik embriyo kullanımı kraniofasiyal kompleksinin türe spesifik bir morfolojiye yönlendirilmesinde nöral önemini oluşturmuştur. Burada tarif edilen yöntem, oldukça farklı kraniofasiyal morfolojiye sahip, iki kuş türleri, ördek, bıldırcın ve kullanır. Bu yöntem büyük ölçüde kraniofasiyal kompleksi türe özgü desen moleküler ve hücresel düzenleme soruşturma kolaylaştırır. Bıldırcın ve ördek kimerik embriyolar deneyler zaten nöral krest aracılı doku etkileşimleri ve kraniofasiyal iskelet, kas, ve kabuklarıyla türe özgü desen düzenleyen hücre özerk davranışlar ortaya koymuştur. Nöral krest türevlerinin büyük çeşitlilik önemli bir potansiyele işaretomurgalı geliştirme, hastalık ve evrimini anlamak için bıldırcın-ördek kimerik sisteminin gelecekteki uygulamalar için.

Önce, daha fazla analiz için, transplantın etkinliği test edilmesi gerekmektedir. Histolojik için, morfolojik, veya gen ekspresyon doku örneklerinin analizleri, bıldırcın hücreleri 36 anlatıldığı gibi Q ¢ PN antikoru kullanılarak immunohistokimyasal tarafından tespit edilmelidir. RNA analizleri için, ilgi konusu dokulara türe özgü katkılar, PCR tabanlı bir strateji 58 kullanılarak hesaplanabilir. Nakli etkinliği doğrulandıktan sonra, bundan başka morfolojik veya moleküler parametreler kimeralar olarak değerlendirilebilir. Donör nöral krest hücreleri ve uygun histogenezi ve kraniofasiyal kompleksinin morfogenetiğine altında yatan çevreleyen konak-kaynaklı dokular arasındaki etkileşim, önceden yoğun çalışmalar yapılmıştır. Özellikle, nöral tepe mezenşimin yüzün türe özel bir morfoloji 7, 13, 51, 59, tüy model 52, kas model 56 yönlendirir </s<html> kadar&gt; ve kıkırdak 53, konak gen ifadesinin düzenlenmesi yoluyla 57. Örneğin, nöral krest mesenkimi zamansal BMP4 ifadeyi 55 düzenleyerek mandibulada zaman kemik formları belirler. Son zamanlarda, araştırmalar çok erken kraniofasiyal gelişiminde meydana gelen doku etkileşimleri üzerinde yoğunlaşmış. Bu bağlamda, bıldırcın-ördek kimeralar kullanan deneyler, ev sahibi embriyolar morfolojik sınırları saptanmasıyla sinir ucu değiştirmeye etki göstermiştir. Bu kimerik quck embriyolarda, donör bıldırcın nöral krest hücrelerinin bir ördek gibi kalıp (Şekil 1D) olarak konak ördek çene kavisi içine göç vardır. Nöral krest nüfusun büyüklüğüne bu konak katkısına rağmen, donör nöral krest bıldırcın gibi boyut ve şekil (Şekil 1E) olan bir alt çene iskeleti üretmeye devam etmektedir. e 1 &quot;fo: İçerik-width =&quot; &quot;fo: src =&quot; 6in / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Bıldırcın-Duck Chimeric Sistemi. Oluşturmak için (A) ve Quail (B) ördek kafatası boyutu ve şekli önemli ölçüde farklılıklar gösterebilir ve bu şekilde, en iyisi (Tokia et al. 56 değiştirilerek) kraniofasiyal gelişimini incelemek için bir kimerik sistemi kullanmak için uygundur. (C) Deney tasarımı evre-uyumlu HH9.5 bıldırcın ve ördek embriyolar tek taraflı kimerik quck embriyolar. Nöral kat bıldırcın embriyo bir taraftan uzaklaştırılır ve ördek embriyolara nakledilen sinir kıvrımın eşdeğer bir parça sonra kaldırıldı. (D) Quail verici hücreler (yeşil), bir anti-bıldırcın antikoru (Q kimeralar ile takip edilebilir HH12 kimerik embriyo ventral görünümünde gösterildiği gibi) PN ¢. (F) HH38 de quck çeneleriyle olarak, bıldırcın Meckel verici türetilmiş7, s kıkırdak daha büyük ve eğri olan karşı taraftaki ördek ev sahibi türevli Meckel kıkırdak için gözlenenden daha kısa ve daha düz olduğunu. Yayımlanmaktadır Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) Elsevier izni ile.

Bu makalede, kraniofasiyal gelişimine nöral ve / veya diğer dokuların türe özgü katkılar test etmek için tasarlanmıştır kimerik embriyolar oluşturmak için bir yöntemi tarif etmektedir.

Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Bu prosedürün genel amacı, kraniofasiyal gelişim sırasında nöral krist hücrelerinin türe özgü paternleri oluşturma mekanizmalarını araştırmak için bıldırcın kanal kimeralarını bir araç olarak kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle evre 9.5 bıldırcın embriyosunun orta ve ön arka beyin bölgesinden bir nöral kıvrım şeridinin diseke edilip çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, donör bıldırcın nöral kıvrımının ördek konak embriyosuna transferini içerir.Üçüncü adım, 9,5 evresindeki bir ördek konak embriyosunun eşdeğer bölgesinin diseke edilmesini ve çıkarılmasını içerir. Son adım, sarmal nöral kıvrımı ördeğin orta ve ön arka beyin bölgesine yerleştirmektir. Sonuç olarak elde edilen kimera embriyolar, in situ hibridizasyon aracılığıyla nöral krest kaynaklı gen ekspresyonu değişikliklerini belirleyebilir ve ayrıca histolojik analizler yoluyla morfolojik değişiklikleri ortaya çıkarabilir.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, San Francisco'daki Ocean Beach üzerinde uçan Kahverengi pelikanları izlerken edindim. Uzun gaga iskeletlerinin kemik ve kıkırdaklarını oluşturdukları için, türe özgü desenlerin kaynağının nöral krest hücreleri olması gerektiğini fark ettim. Kahverengi pelikan yumurtaları bulamasam da, beyaz Pekin ördeği bulmayı başardım.San Francisco'nun Asya dışındaki en büyük Chinatown'a sahip olduğu göz önüne alındığında, bıldırcınlar ve ördekler arasındaki olgunlaşma hızları ve morfoloji farklılıklarından yararlanılarak uygulanır. Bu yöntem, türlere özgü paternlerin kökenlerini anlamak gibi gelişimsel biyolojideki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Cerrahi işlem, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Jennifer Fish tarafından gerçekleştirilecek ve lisansüstü öğrencisi Kate Ovitz ona yardımcı olacaktır. Bir bek ve bükücü kullanarak, cam konik kısım erimeye başlayana kadar bir pastör pipetinin dar ucunu ısıtın. Alevi üzerinden çekin ve pipet mühürlenene kadar ucu çekin.Konik kısmın bir bölümünün dış çapının 0,7 ile bir milimetre arasında olduğundan emin olun. Ardından, kapalı ucu konik kısımdan yaklaşık dört santimetre uzaklıktan kırın. Sonra, pipetin açık ucuna yaklaşık iki fit uzunluğunda kauçuk hortum takın ve diğer uçtan üfleyin.Tüpe hafifçe üfleyerek basınç uygularken, pipetin bağlantı noktasından veya diğer ucundan hava geçmemelidir. Pipetin konik kısmının başladığı noktanın hemen altındaki bir bölgeyi ısıtmak için bir propan kalem veya pürmüz kullanın. Cam dışa doğru genişlemeye başladığı anda, pipeti alevden çekin ve kauçuk hortumdan hafifçe üfleyin.Bu işlem, camın ısıtılan kısmında sosis şeklinde bir balon oluşmasını sağlayacaktır. Çok fazla basınç uygulamak cam balonun patlamasına neden olur ve bundan kaçınılmalıdır. Pipette oluşan pencere yaklaşık bir santimetre genişliğinde ve bir buçuk ila iki santimetre uzunluğunda olmalıdır.Şimdi konik ucu yukarıya doğru yönlendirin ve cam parçalarının pipete girmesini önlemek için tüpün içinden hafifçe üfleyerek baloncuğu cam bir atık kabına kazıyın. Ardından, propan alevi kullanarak baloncuğun kalan kenarlarını dikkatlice yakın ve açık pencerenin kenarlarını ateşle cilalayın. Sonrasında, elmas uçlu kalemi dikey konumda tutarak, pipetin konik ucunu, konikliğin başlangıcından bir santimetre uzaklıktan elmas uçlu kalemle çizin.Pens kullanarak, pipeti işaretli çizgiden nazikçe kırın. Ucu çıkarmak için, kırılmanın temiz olduğundan ve pürüzlü olmadığından emin olmak amacıyla bir diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Pipeti, işaret parmağınız uca yaklaşık 9,5 milimetre uzaklıktaki açık pencerenin üzerinde olacak şekilde, bir kurşun kalem tutar gibi tutun.Pipetin camını bir alkol brülörünün alevının kenarına tutarak yumuşatın. Pipetin dar ucunu, bir diseksiyon mikroskobu altında 60 derecelik bir açıyla aşağı doğru bükmek için pensle ucuna basınç uygulayın. Alkollü brülör ile ucun ateşle cilalamasını hızlı ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.Oluşturulan açıklık yuvarlak ve engelsiz olmalıdır. Ucun, alevde çok uzun süre tutulması durumunda daralacağı ve kullanılamaz hale geleceği unutulmamalıdır. Şimdi, 2,5 santimetre uzunluğundaki bir kauçuk tüpü %70 ethanol ile yağlayın.Açık pencereyi kapatacak şekilde, pipetin gövdesi üzerinden aşağıdan yukarıya doğru kaydırın. Ardından, pipetin açık ucuna iki mililitrelik bir lateks ampul yerleştirin. İç hava basıncını korumak için öncelikle konak yumurtasını hazırlayın.Vitale membranını alevle keskinleştirilmiş bir tungsten iğne kullanarak kesin ve membranı embriyonun üzerine çekin. Ardından, donör yumurtada yapıldığı gibi yumurtayı bantla tekrar mühürleyin. Donör embriyodan nöral kıvrımı kesmek için donör yumurtadaki pencere üzerindeki bandı çıkarın.Alevle sivriltilmiş bir tungsten iğne kullanarak nöral tüpün her iki yanına yarıklar açın. Ardından, greftin istenen anterior ve posterior seviyelerinden nöral tüpü enlemesine kesin ve grefti nöral tüpün geri kalanından ayırın. Donör dokunun doğru şekilde yönlendirilmesini sağlayacak olan greftin anterior ve posterior şekli gibi özel anatomik ayrıntılara dikkat edin.Konakçıya yerleştirirken tungsten iğnenin son derece keskin olduğundan emin olun. Dokuyu tamamen ve tek parça halinde çıkarmak için hızlı ve kararlı darbeler uygulayın. Bağışçı embriyodan nöral kıvrımı bir shaman pipeti kullanarak çıkarın. Transfer sırasında dokunun sürüklenmemesi için mümkün olduğunca az sıvı çekin.Şimdi konak yumurtadaki pencerenin üzerindeki bandı çıkarın ve donör nöral kıvrımı, naklin yapılacağı nöral tüp bölgesinin bitişiğinde, konak embriyosunun yanına yerleştirmek için shaman pipeti kullanın. Şimdi, donörde yapıldığı gibi, nöral kıvrımı konak embriyosunun nöral tüpünden ayırın. Donör dokusuyla eşit büyüklükte bir greft çıkardığınıza dikkat edin.Bu konakçı dokusunu embriyodan nazikçe uzaklaştırın. Ardından, küt uçlu bir tungsten iğne veya bir mikropipetin yuvarlatılmış ucuyla, uygun anterior posterior ve dorsal ventral yönelimleri koruyarak, donör nöral kıvrımı konakçı nöral tüpünün içine nazikçe itin. Greftin yanlar boyunca yerleştiğinden emin olun, ancak altta kalan dokulara batırmadığınızdan veya zarar vermediğinizden emin olun.Steril salin, konak embriyonun üzerine dikkatli ve nazikçe uygulanmalıdır. Herhangi bir kuruma belirtisi varsa, yumurtayı dikkatlice yeniden mühürleyip etiketleyin ve kimerik embriyonun analiz için istenen aşamaya kadar gelişebileceği yüksek nemli bir inkübatöre nazikçe geri yerleştirin.Analiz için, kimera embriyoları taze hazırlanmış soğuk Sarah fiksatifine toplayın. Ardından, gece boyu fiksasyon için embriyoları derhal dört derece santigrat sıcaklıktaki bir rocker üzerine yerleştirin. Bu işlem, anti-bıldırcın antikoru ile bıldırcın yumurtalarının daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayacaktır.Real-time kantitatif PCR ile gen ekspresyon analizleri için bir diğer önemli adım, RNA ekstraksiyonu öncesinde embriyoları sıvı azot ile dondurmaktır. Bobinler ve ördekler boyut ve şekil bakımından önemli farklılıklar gösterir ve bu nedenle embriyoları, kraniofasiyal gelişimi incelemek için kimerik bir sistem oluşturmaya son derece uygundur.Özellikle sistem, nöral krist hücrelerinin rolünü araştırmak için faydalıdır. Kimera ördek-sülün embriyosunda yüz iskeletinin şekillenmesinde, donör sülün nöral krist hücreleri konak ördeğin mandibular arkına göç eder. Ördek benzeri bir patern şeklinde, donör sülün hücreleri ventral görünümden anti-sülün antikoru ile yeşil renkte görülmektedir.12. evredeki kimera bir embriyoda, donör nöral krista, boyut ve şekil bakımından sülüne benzer bir mandibüler iskelet oluşturur. Uzmanlaşıldığında, her bir transplantasyon yaklaşık beş dakikada gerçekleştirilebilir. İşlemin bundan daha uzun sürmesi, embriyoyu kurumaya karşı riske atar ve hayatta kalma oranını düşürür.Bu prosedürü gerçekleştirirken duruşunuza dikkat etmeniz, omuzlarınızı rahat bırakmanız ve ellerinizi doğru pozisyonda tutmanız önemlidir. Ayrıca, gözlerinizi mikroskopta tutabilmek ve ellerinizi otomatik bir şekilde hareket ettirebilmek için bir rutin oluşturun; cerrahi aletlerinizi ve reaktiflerinizi her zaman aynı yere yerleştirin.

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyalizasyon ve yüzey sefalik ektoderm desenlendirme özellikleri test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği açıklar.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Bıldırcın-chick kimerik embriyo kuş nöral krest hücrelerinin göç ve nihai kaderi analiz etmek için bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, aksi ayarlanmamış bir civciv embriyo içinde ayırt etmek zor göç ve farklılaşma sırasında nöral krest hücrelerinden izlemek için basit ve kolay bir tekniktir.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Deneysel verilerin görselleştirilmesi bilimsel topluluk sonuçların sunulması önemli bir unsur haline gelmiştir. Büyüyen embriyoların canlı time-lapse kayıt Üretimi karmaşık bir gelişimsel süreçlerinin daha iyi tanıtımı ve anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Bu protokol Zebrafish kaede protein Fotoçevrim yoluyla hücre etiketleme için bir adım-adım bir kılavuzdur.

Sox10 içinde Kraniyofasiyal Kalkınma Görselleştirme: kaede Transgenik Zebra balığı Hattı Time-lapse konfokal mikroskopi kullanılarak

Xenopus arasında yüz doku "Extreme Anterior Etki" nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis'den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Xenopus laevis embriyoların hastanın ağız boyutunu ve şeklini ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, geleneksel boyutu ölçümleri, hastanın ağız geliştirme ve kusur daha sofistike analizlerine olanak sağlamak için geometrik morfometrik ile birleştirilir.

Orofasial fenotipleri Niceleme Xenopus

Kraniyofasiyal kemiklerin Hücre organizasyonu uzun öne sürülmüştür ancak doğrudan görüntülenmiştir olmamıştı. Çok spektral hücre etiketleme ve in vivo canlı olarak   Görüntüleme Zebra balığı alt çene dinamik hücre davranışı görselleştirme sağlar. Burada, biz detay protokolü Zebrabow transgenik balık işlemek için doğrudan hücre ardalanması ve Meckel kıkırdak kondrosit morfolojik değişiklikleri gözlemek.

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Bu makalede embriyonik dokulardan saf formu ex vivo chimeric organları için bir araya getirilebilen bıldırcın ve tavuk embriyolar izole etmek için bir yöntem sağlar.

Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu

Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

Burada, farelerde kraniyomaksillofasiyal kemik gelişiminin mevcut yöntemlerle mümkün olandan daha iyi değerlendirilmesi için farelerde kraniyomaksillofasiyal kemiklerin 3D modellerini segmentlere ayırmak ve ölçmek için mikrobilgisayarlı tomografiye dayanan bir yöntemi derinlemesine açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Mikrobilgisayarlı Tomografi Kullanılarak Farelerde Kraniyomaksillofasiyal Malformasyonların Analizi

Öğrenin bıldırcın-ördek kimeraları kullanarak kraniyofasiyal gelişimde sinir kreti hücrelerinin tür özgü katkılarını inceleme yöntemini. Bu teknik gelişim biyolojisi araştırmalarında evrimsel süreçleri anlamak için değerlidir.

Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet