Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, bıldırcın kanalı kimeralarını, nöral kabuk hücrelerinin kraniyal yüz gelişimi sırasında türe özgü desenler oluşturduğu mekanizmaları araştırmak için bir araç olarak kullanmaktır. Bu, ilk olarak evre 9.5 bıldırcın embriyosunun orta ve ön arka beyin bölgesinden nöral kıvrımın bir şeridinin diseke edilmesi ve çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bıldırcın donör nöral kıvrımının ördek konakçı embriyosuna aktarılmasını içerir.

Üçüncü adım, evre 9.5 ördek konakçı embriyosunun eşdeğer bölgesinin diseksiyonunu ve çıkarılmasını içerir. Son adım, bobin nöral kıvrımını ördek, orta ve ön arka beyin bölgesine yerleştirmektir. Sonuç olarak, ortaya çıkan kimerik embriyolar, C iki hibridizasyonunda gen ekspresyonundaki nöral krest aracılı değişiklikleri belirleyebilir ve ayrıca histolojik analizler yoluyla morfolojik değişiklikleri ortaya çıkarabilir.

Bu yöntem fikri ilk olarak San Francisco'daki Ocean Beach'te kahverengi pelikanların uçarkını izlerken aklıma geldi. Nöral krest hücrelerinin, uzun gaga iskeletlerinin kemiklerini ve kıkırdaklarını meydana getirdikleri için türe özgü örüntünün kaynağı olması gerektiğini fark ettim. Kahverengi pelikan yumurtalarının izini süremesem de beyaz Pekin ördeği bulabildim.

San Francisco'nun Asya dışındaki en büyük Çin Mahallesi'ne sahip olduğu göz önüne alındığında Bıldırcınlar ve ördekler arasındaki olgunlaşma ve morfoloji oranlarındaki farklılıklardan yararlanarak. Bu yöntem, türe özgü örüntünün kökenlerini anlamak gibi gelişim biyolojisindeki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir, Ameliyatı gerçekleştirmek, doktora sonrası bir bilim adamı olan Dr.Jennifer Fish olacak Laboratuvarımda, yüksek lisans öğrencisi olan Kate Ovitz yardımcı olacak Bir çörek ve brülör kullanarak, bir macun pipetinin dar ucunu, konik boyunca cam erimeye başlayana kadar ısıtın. Alevden çıkarın ve pipet mühürlenene kadar ucunu çekin.

Konik parçanın bir kısmının 0,7 ile bir milimetre arasında bir dış çapa sahip olduğundan emin olun. Ardından kapalı ucu koniklikten yaklaşık dört santimetre uzakta kırın. Ardından, diğer uçtaki pipet darbesinin açık ucuna yaklaşık iki fit lastik boru takın.

Tüp üzerine üfleyerek hafif bir basınç sağlarken pipetin bağlantısından veya diğer ucundan hava geçmemelidir. Pipetin bir tarafında, konikliğin başlangıcının hemen altındaki oval bir alanı ısıtmak için bir propan kalemi, alev meşalesi kullanın. Cam dışa doğru bükülmeye başlar başlamaz, pipeti alevden çıkarın ve lastik borudan hafifçe üfleyin.

Bu, camın ısıtılmış kısmının sosis şeklinde bir kabarcık oluşturmasına neden olur. Çok fazla basınç cam baloncuğun patlamasına neden olur ve bundan kaçınılmalıdır. Pipette ortaya çıkan pencere yaklaşık bir santimetre genişliğinde ve bir buçuk ila iki santimetre uzunluğunda olmalıdır.

Şimdi konik ucu yukarı doğru tutun ve cam parçalarının pipete girmesini önlemek için borudan hafifçe üflerken baloncuğu bir cam atık kabına kazıyın. Daha sonra propan alevini kullanarak, balonun kalan kenarlarını dikkatlice yakın ve açık pencerenin kenarlarını ateşle parlatın. Ardından, elmas uçlu kalemi dikey konumda tutun, pipetin konik ucunu konikliğin başlangıcından bir santimetre uzakta çizmek için bir elmas uçlu kalem kullanın.

Forseps kullanarak, pipeti çentiklenen çizgide yavaşça kırın. Ucu çıkarmak için, kırığın temiz olduğundan ve pürüzlü olmadığından emin olmak için diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Pipeti, işaret parmağınızla bir kalemi açık pencerenin üzerinde uçtan yaklaşık 9,5 milimetre uzakta tutar gibi tutun.

Pipet üzerindeki camı, bir alkol brülörünün alevinin kenarına bitişik tutarak yumuşatın. Pipetin dar ucunu bir diseksiyon dürbünü altında 60 derecelik bir açıyla aşağı doğru bükmek için forseps ile uca baskı uygulayın. Hızlı ve dikkatli bir şekilde, ucu alkol brülörü ile ateşle parlattı.

Bitmiş açıklık yuvarlatılmış ve engelsiz olmalıdır. Alevde çok uzun süre tutulursa ucun daralacağını ve kullanılamaz hale geleceğini unutmayın. Şimdi 2,5 santimetre uzunluğundaki bir kauçuk tüpü% 70 etanol ile yağlayın.

Açık pencereyi kapatmak için pipet milinin üzerinde aşağıdan yukarıya doğru kaydırın. Ardından pipetin açık ucuna iki mililitrelik bir lateks ampul yerleştirin. İç hava basıncını korumak için önce konakçı yumurtayı hazırlayın.

Alevle bilenmiş bir tungsten iğnesi kullanarak Vitale zarını kesin ve zarı embriyonun üzerine çekin. Ardından, donör yumurta için yapıldığı gibi yumurtayı bantla tekrar kapatın. Donör embriyodan nöral kıvrımı kesmek için donör yumurtanın üzerindeki pencereden bandı çıkarın.

Alevle keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesi kullanarak nöral tüpün her iki tarafında yarıklar açın. Daha sonra greftin istenen ön ve arka seviyelerinde nöral tüpü kesin ve grefti nöral tüpün geri kalanından ayırın. Donör dokunun düzgün bir şekilde yönlendirilmesini sağlayacak olan greftin ön ve arka şekli gibi belirli anatomik ayrıntılara dikkat edin.

Ana bilgisayara yerleştirildiğinde, tungsten iğnesinin son derece keskin olduğundan emin olun. Dokuyu tamamen ve tek parça halinde çıkarmak için hızlı ve kasıtlı vuruşlar kullanın, Bir şaman pipeti kullanarak donör embriyodan nöral kıvrımı çıkarın. Mümkün olduğunca az sıvı çekin, aksi takdirde doku transfer sırasında yüzebilir.

Şimdi bandı konakçı yumurtanın üzerindeki pencereden çıkarın ve donör nöral kıvrımı, nakli alacak nöral tüp bölgesine bitişik konakçı embriyonun yanına yerleştirmek için şaman pipetini kullanın. Şimdi nöral kıvrımı, donörde olduğu gibi konakçı embriyonun nöral tüpünden ayırın. Donör doku ile eşit büyüklükte bir greft çıkarmaya özen gösterin.

Bu konakçı dokuyu nazikçe embriyodan uzağa itin. Daha sonra künt bir tungsten iğnesi veya bir mikro pipetin yuvarlak ucu ile, donör nöral kıvrımı nazikçe konakçı nöral tüpe hareket ettirin ve uygun anter posterior ve dorsal ventral oryantasyonları koruyun. Greftin yanlar boyunca sıkıştığından emin olun, ancak alttaki dokuları dürtmediğinizden veya zarar vermediğinizden emin olun.

Steril salin, konakçı embriyo üzerine dikkatli ve nazik bir şekilde uygulanmalıdır. Herhangi bir kuruma belirtisi varsa, şimdi yumurtayı dikkatlice yeniden kapatın ve etiketleyin ve nazikçe kimerik embriyonun istenen aşamaya gelebileceği yüksek nemli bir inkübatöre geri koyun. Analiz için.

Analiz için, kimerik embriyoları taze yapılmış soğuk Sarah'nın fiksatifinde toplayın. Ardından, gece boyunca sabitlemek için hemen dört santigrat derecede bir külbütöre yerleştirin. Bu, bıldırcın yumurtasının anti bıldırcın antikoru ile daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayacaktır.

Gerçek zamanlı kantitatif PCR ile gen ekspresyon analizleri için bir diğer önemli adım, embriyoların ve sıvı nitrojenin RNA'dan önce dondurulmasıdır. Ekstraksiyon bobinleri ve ördekler, boyut ve şekil bakımından önemli farklılıklar gösterir ve bu nedenle embriyoları, kimerik bir sistem yapmak için idealdir. C kraniyofasiyal gelişimini incelemek.

Özellikle, sistem nöral krest hücrelerinin rolünü araştırmak için kullanışlıdır. Kimerik qua embriyo donöründeki yüz iskeletinin modellenmesinde, bıldırcın nöral krest hücreleri, konakçı ördek mandibular kemerine göç eder. Ördek benzeri bir desende, yeşil renkteki bıldırcın donör hücreleri, ventral görünümden bir anti bıldırcın antikoru ile görüntülenir.

Evre 12 kimerik embriyoda, donör nöral krest, boyut ve şekil olarak bıldırcın gibi bir mandibular iskelet oluşturur. Bir kez ustalaştıktan sonra, her nakil yaklaşık beş dakika içinde yapılabilir. Daha uzun süre düzgün yapılırsa, embriyoyu kuruma riskine sokar ve hayatta kalma oranı düşer.

Bu prosedürü gerçekleştirirken duruşunuzun farkında olmak, omuzlarınızı gevşetmek ve iyi bir el pozisyonunu korumak önemlidir. Ayrıca, bir rutin geliştirin ve cerrahi aletlerinizi ve reaktiflerinizi her seferinde aynı yere yerleştirin, böylece gözlerinizi mikroskopta tutabilir ve ellerinizi otomatik bir şekilde hareket ettirebilirsiniz.