Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Merhaba, ben Finlandiya'daki Helsinki Üniversitesi'nden Christina McKennan. Belirli bir protein kompleksini karakterize etmedeki zorluklardan biri, onun moleküler kompozisyonunu belirlemektir. Bu durum, kompleksin hücresel ortamından izole edilmesi ve saflaştırılması için yöntemlerin geliştirilmesini gerektirir.

Mikroorganizmalar alanındaki araştırma konumuz bitki virüsü konak etkileşimleridir ve bu nedenle enfeksiyon sırasında oluşan çeşitli viral ribonükleoprotein kompleksleriyle ilgilenmekteyiz. Geçmişte, bu kompleksleri kendi bünyemizde uyguladığımız afinite tabanlı saflaştırma yöntemlerini kullanarak başarıyla inceledik. Twin-strep etiketi, en iyi etiketlerden biri olduğunu kanıtlamıştır.

Buna rağmen, kullanımında düşük verim gibi bazı sınırlamalar gözlemledik ve bu nedenle bu yöntemi geliştirmek istedik. Merhaba, benim adım Mata ve size deneysel protokol boyunca rehberlik edeceğim. Ancak öncelikle, yönteme genel bir bakış sunayım.

Twin-strep etiketli proteinler ile fizyolojik bağlanma ortakları arasındaki spesifik kompleksleri saflaştırmak için strep-tactin makro prep boncukları kullanıyoruz. Yeşil renkte twin-strep etiketli protein tetrameri, mavi renkte bağlanma ortağı ve kırmızı renkte iki adet strep etiketi gösterilmiştir.

Kanonik yaklaşımda, gri oklarla gösterilen bağlanmamış proteinler yıkama ile uzaklaştırılır. Bağlanmış kompleksler, pembe ile gösterilen biotin ile rekabetçi olarak elüe edilir. Ancak, bu yaklaşım kullanılırken, sadece küçük bir kısmın strep tachin boncuklarından başarıyla ayrıldığı, bağlanmış komplekslerin elüsyonunun tamamlanmadığı gözlemlenmiştir.

Bu durum, düşük hedef protein geri kazanımıyla sonuçlanır. Herhangi bir ileri analizi zorlaştıran bu durum, S-D-S-S-D-S ile denatüre edici elüsyon kullanılarak hedef protein geri kazanımının artırılmasıyla çözülebilir. Denatüre olmuş twin strep ttag yem proteininin etrafında mis hücreleri oluşur.

Bağlanma partneri ve strept aktinin ayrışmış monomerlerinin çevresi. Numunenin kütle spektrometrisi ile daha fazla analiz edilmesi gerekiyorsa, serbest kalan strept aktin nedeniyle oluşan numune kontaminasyonu kabul edilemez. Numune kontaminasyonu sorununu aşmak için, strept aktin tetramerinin önce kimyasal çapraz bağlama ile stabilize edildiği bir yöntem geliştirdik.

Elde edilen çapraz bağlı reçine, yem proteini ve onun bağlanma ortağı örneği saflaştırmak için kullanılır; SDS ile elüsyon yüksek protein geri kazanımı sağlarken, reçinenin kimyasal olarak çapraz bağlanması, strept etiketli yem proteininin ve bağlanma ortağının, örneğin kontaminasyonu olmadan elüye edilmesini sağlar. Serbest kalan strept ile dengelemek için, iki miligram BS3 çapraz bağlayıcı içeren sızdırmaz bir mikro tüpü oda sıcaklığına getirin.

Pipet ucunun ucunu keserek reçine transferi için hazırlayın; Strep-Tactin ve Macro-Prep reçinesini kısa süreli ve kuvvetli bir şekilde çalkalayarak yeniden süspande edin ve süspansiyonun 600 µL'sini hemen bir CoStar spinx filtre kolonuna aktarın, ardından 4.000 RPM'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında 450 µL fosfat tamponlu salin ekleyin. Bu adımın amacı, primer amin tris'i reaktif olmayan fosfat ile değiştirmektir.

Akış sıvısını atın. Tüpü birkaç kez altüst ederek içeriği karıştırın. Santrifüjleme ve yıkama adımlarını iki kez tekrarlayın ve reçineyi 430 µL PBS pH 8 içerisinde bırakın.

Son santrifüj işleminden sonra, no way mikrotüpün folyosunu 100 µL Milli-Q su içeren bir pipet ucuyla delin. BS3 tozunu, pipetle hafifçe aşağı yukarı çekerek suda çözün. BS3 tamamen çözündüğünde, çözeltiden 20 µL'yi derhal Spin-X kolonuna ekleyin. İçeriğin uygun şekilde karıştırıldığından emin olun.

Reçinenin BS three çözeltisiyle uygun şekilde karıştığından emin olarak kolonu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün. Reaksiyonu durdurmak için, hidroklorik asit ile pH 7.5'e ayarlanmış altı mikrolitre 3 M tris ekleyin. Kolonu oda sıcaklığında 15 dakika daha döndürün ve ardından 4,000 RPM'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, çapraz bağlı reçineyi 450 µL tween 20 içeren tris tamponlu saline içinde süspande edin ve akış sıvısını atın. Santrifüj ve yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın. Son adımda, reçineyi 450 µL TBS içinde yeniden süspande edin. Reçine süspansiyonunu yeni bir tüpe aktarın, kolonda kalan reçineyi başka bir 450 µL TBS ile yeniden süspande edin ve aynı tüpe aktarın.

Reçinenin kolondan tüpe maksimum düzeyde aktarıldığından emin olmak için son adımı bir kez daha tekrarlayın. Reçine süspansiyonunun bulunduğu tüpü oda sıcaklığında 10 dakika bekletin ve hacmi 600 microliters düzeyine ayarlayın. Fazla TBS uzaklaştırıldıktan sonra reçine, hemen kullanıma hazır hale gelir veya dondurulmadan dört degrees Celsius sıcaklıkta saklanabilir.

Bu yöntem, herhangi bir twin strep etiketli füzyon proteininin ve ilişkili komplekslerinin saflaştırılması için uygundur. Protein; hayvan, bitki veya bakteri kökenli olabilir ve toplam hücre lizatından veya zenginleştirilmiş organel fraksiyonundan izole edilebilir. Bu örnekte, virüsle enfekte olmuş bitkilerin nükleer fraksiyonundan patates virüsü A'ya ait bir twin strep etiketli protein olan VPG Pro'yu izole ediyoruz; bağlama tamponu içindeki bir mililitre yem protein örneğini 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 RPM'de santrifüj ederek başlayın.

Endojen biotinillenmiş proteinlerin strep tact ve reçineye bağlanmasını en aza indirmek için süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. İçeriğin iyice karıştığından emin olarak, nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde avadon ekleyin. Dört °C'de 15 dakika boyunca döndürün.

Çapraz bağlanmış reçineyi vorteksleyerek yeniden süspanse edin ve bir kupa pipet ucu kullanarak reçine süspansiyonundan 50 µL'yi hemen yem protein örneğinin bulunduğu tüpe ekleyin. Beklerken 4 °C'de 30 dakika daha döndürün. Termo mikseri 55 °C'ye ayarlayın ve elüsyon adımında kullanmak üzere 500 µL Elü tamponunu önceden ısıtın; ardından 4 °C'de, 2000 RPM hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı atın ve reçineyi bir mililitre önceden soğutulmuş yıkama tamponu 1 ile yıkayın. Beş dakika boyunca 4 °C'de döndürün. Santrifüj ve yıkama adımlarını son aşamada üç kez tekrarlayın.

Reçineyi 250 µL yıkama tamponu 2 içerisinde yeniden süspande edin ve reçine süspansiyonunu yeni bir spinx kolonuna aktarın. Tüpte kalan reçineyi başka bir 250 µL yıkama tamponu 2 içerisinde yeniden süspande ederek aynı kolona aktarın ve 4 °C'de, 2000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Kolonu yeni bir 2 mL'lik dolphin nose tüpe aktarın ve süzüntüyü atın.

Hemen şu sonraki elüsyon adımına geçin. Spin kolonuna 150 µL önceden ısıtılmış elüsyon tamponu ekleyin. Çözeltiyi termo mikserde 55 °C'de beş dakika boyunca 1400 RPM'de çalkalayarak inkübe edin, oda sıcaklığında 4.000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve kolonu atın.

Saflaştırılmış hedef proteinler artık ileri analizler için hazırdır ve -20 °C'nin altındaki sıcaklıklarda saklanabilir; görüntü, biotin ile strept actin macro prep reçinesinden protein elüyonunun, SDS ile yapılan elüyonla karşılaştırıldığında tamamlanmadığını göstermektedir. Western blot sinyal yoğunluklarındaki fark, iki elüsyon tekniği ile elde edilen farklı protein verimlerini yansıtmaktadır. SDS ile elüsyon, biotin ile elüsyondan çok daha verimli olsa da, serbest kalan strept actin nedeniyle numune kontaminasyonuna yol açar.

Görüntü, Strept actin Macro prep reçinesinden elde edilen SDS EIT'lerin gümüş boyama jelini göstermektedir; sol şeritte salınmış strept actin mevcutken, sağ şeritte bulunmadığı görülmektedir. Soldaki örnek çapraz bağlanmamış reçineden, sağdaki örnek ise BS three ile çapraz bağlanmış reçineden elüe edilmiştir. Bu sonuçlara dayanarak, BS three ile çapraz bağlamanın, SDS elüsyonu sırasında strept actinin reçineden salınmasını önlediği sonucuna varıyoruz.

Bu örnekte, bait protein VPG PRO ve onun bağlanma ortaklarını saflaştırmak için BS3 ile çapraz bağlanmış Streptactin macro prep reçinesi kullandık. Saflaştırılmış örneğin bir alikotu, protein tanımlaması için kütle spektrometrisi analizine tabi tutuldu. Negatif kontrolde spesifik bir bandın bulunmaması, pull-down işleminin özgünlüğünü doğrulamaktadır.

Alt bant yem protein VPG PRO'ya, üst bant ise kütle spektrometrisi ile tanımlanan bağlanma partneri NIB replikasuna karşılık gelmektedir. Merhaba, kimyasal çapraz bağlamanın, strep tactin reçinesinden denatürasyon ve elüsyonla ilişkili kısıtlamaları aşmak için nasıl kullanılabileceğini size gösterdik. Yöntem, protein-protein komplekslerinin saflaştırılmasının yanı sıra, formaldehit ile tersine çapraz bağlanmış olanlar da dahil olmak üzere nükleik asitler içeren protein komplekslerini saflaştırmak için de kullanılabilir.

Son olarak, bu yöntem strep tech membran proteinlerini saflaştırmak için kullanılabilir. Deterjanlar ile çözünür hale getirilirler. Bu hidrofobik proteinlerin çözeltide kalması için deterjanlar gereklidir.

Ancak, varlıkları örneklerin strep tane salınımıyla kontamine olmasına yol açabilir. Hafif biotin evrimi kullanıldığında bile, reçinenin çapraz bağlanmasının örnek kontaminasyonu sorununa bir çözüm sağlayabileceğini düşünüyoruz. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz. Tamam.