Name: BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Keşfedin FUEL tekniğini, biyolüminesan bakteriler ve lüminesan nanopartiküller kullanarak kırmızı foton üretimi için. Bu yöntem, floresans araştırmalarında mevcut paradigmaları sorgulamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar JD, AH ((SLS), AB-FP7 programı &quot;Otomasyon&quot;, Institut Carnot Programı 11 (JD, CS, CS) New York Pasteur Vakfı&#39;nın maddi destek için şükranlarını sunarım , AR, RT, SLS) ve RT, SLS Projesi IMNOS (), Conny-Maeve Vakfı (SLS), Moleküler Görüntüleme European Masters (BT), Bölge Ile de France programları MODEXA (SLS), SUSAM (SLS) ve DimMalInf (SLS, RT), Biologie-Santé en ANR Program Grandes Investissement de L&#39;Avenir Altyapılar Nationales: Fransa LifebioImaging (FLI) Fransa Yaşam Görüntüleme (RT, SLS), Fransa Biyogörüntüleme (JD, SLS) ve Institut Pasteur, Paris. Ayrıca, yazarlar reaktifler için, José Bengoechea ve Herbert Schweizer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, yazarlar antikorları oluşturulan Cindy FEVRE teşekkür etmek istiyorum.

1.. Reaktifler <ol><li> Satın alma ya da lux ABCDE 21 ifade değiştirilmiş Escherichia coli gibi ışıldayan bakteri ve uygun kültür ortamı geliştirmek, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.. </li><li> Standart tariflere göre, fizyolojik tuzlu su (% 0.9 NaCl) ve kültür ortamı çözelti hazırlayın. E. coli ve K. pneumoniae 37 ° C arasında ve V&#39;de Luria Bertani (LB) içinde büyütülmüştür fischeri ve LB içinde Photobacterium sp 22 ° C &#39;de 0.5 M NaCI ile takviye edilmiş </li><li> Satın alma veya Q-izci 705 floresan probları kazanmak, (40 nm çapında, QD705 olarak anılacaktır) Q-800 izci (40 nm çapında, QD800 olarak anılacaktır), floresan (40 nm çapında) ve floresan olmayan bir polistiren mikro-küreler ( 48 nm çapında) ve geleneksel floresan boyalar. </li><li> Bakteriyel etiketleme için gerekli reaktifleri hazırlayın. </li><li> Erişimlerini sağlamakBöyle bir IVIS Spektrumu olarak bir bütün hayvan biyoışıldama görüntüleme, bu emisyon dalga boyları ve pozlama süresi geniş bir yelpazede altında sinyalini saptayabilir. Biyoışıldama ölçümleri edebilen bir levha okuyucu, burada açıklanan deneylerin çoğu için yeterli olacaktır. </li></ol> YAKIT 2. Temel Rekapütülasyon <ol><li> Standart kültür plakaları üzerinde tek koloniler başlayarak, luminesan bakteri kültürleri, gece boyunca başlar. Burada, V. fischeri kullanılmıştır. </li><li> Deney günü taze altkültürler başlatmak ve OD 1-1,5 600 sağlanana kadar onları ilerleme sağlar. Karşılaştırılabilir sonuçlar üretmek için onlar yoğun sinyalleri üretmek olduğu benzer büyüme eyalette bakteri kullanmak en iyisidir. Bu OD 600 sabit tutarak emin olabilirsiniz. </li><li> QD705 ya da fizyolojik tuzlu su (PS) 5 ul ya da her bir 100 ul alikotları birleştirin ve daha sonra Standa içine PS 895 ul eklerd spektroskopik küvetler. IVIS Spectrum içine doldurulan küvetler yerleştirin ve uygun filtre setleri altında ölçümler almak. Burada, 710-730 nm emisyon filtresi kullanılmıştır. </li></ol> 3.. YAKIT fazla Değişen Mesafeler <ol><li> Iki düşük hacmi (1 mi) doldurun QD705 50 ul ya da 1 ml PS bir toplam hacim içinde floresan olmayan 48 nm polistiren mikro 97,2 ul ya da plastik fotometrik küvetleri. Bu iki taraf arasındaki toplam hacmi başına benzer katı bir yüzey alanı sağlamaktadır. </li><li> Standart siyah bant veya ışığı bloke edebilen diğer bazı opak malzeme ile üçüncü bir küvet kaplayarak bir ışık kaynağı küvet hazırlayın. Dikkatlice küvet ters tarafta iki özdeş optik pencere hazırlar. </li><li> Doğrudan ışık kaynağı küvet her iki yanı üzerine önceden doldurulmuş küvetler yerleştirin. V&#39;luk bir 1 ml&#39;lik bir şişe ekleme fischeri veya diğer kültür (yani ışıldayan E. coli veya Photobacterium sışık kaynağı küvete taze altkültürlerden p) ve herhangi bir ışık kirliliği azaltmak için böyle siyah kağıt gibi opak bir malzeme ile örtün. </li><li> Sırasıyla maruz kalma süreleri 10, 30, ve 30 saniye ile birlikte, bu tür toplam ışık ve 710-730 nm emisyon filtreleri gibi uygun emisyon filtreleri altında üç küvetler görselleştirmek. </li><li> Merkez küvetten gelen eşdeğer ileri mesafelerde hem dış küvetler yeniden konumlandırmak ve yeniden görselleştirmek. 3cm son yüz-yüze (azaltılmış hacmi küvete merkezi) mesafe elde edilinceye kadar tekrarlayın. Her adımda, QD705 yerini doğrulamak için bir floresan görüntü (450-480 nm uyarma, 710-730 nm emisyon) kazanır. </li></ol> 4. Potansiyel YAKIT Çiftleri Araştırılması <ol><li> Diğer negatif kontrol olarak floresan olmayan nanopartiküller ile bir flüorofor ya da ilgi konusu bir floresan nanoparçacık birinde ve PS veya PS birini içeren 1 ml çözümler ile iki azaltılmış hacimli küvetler doldurun. The çalışma Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi potansiyel ticari olarak temin edilebilen YAKIT florofor ve floresan nanopartiküllerin çeşitli incelenmiştir, burada gösterdi. </li><li> Taze V&#39;luk bir 1 ml&#39;lik bir şişe ekleme fischeri veya ters tarafta bulunan iki fiziksel olarak eşit optik pencerelerini içeren bir karartılmış üçüncü küvete diğer ışıldayan bakteri. Bu siyah bir kağıt parçası gibi bir opak madde ile küvet örtün. </li><li> Kısa ama eşit mesafe yerde iki hacminde karartılmış küvetin iki tarafında küvetler ve uygun filtrelerin altında görselleştirmek. Burada, 0.7 cm&#39;lik bir mesafe kullanılmıştır. Diğer fluoroforlar tekrarlayın. </li></ol> 5.. Hedeflenen YAKIT <ol><li> , Işık yayan bakterilerin özgü biyotinlenmiş antikorlar hazırlayın. K. Örneğin, burada birincil antikorlar spesifik pneumoniae (α-Kp) EZ-link Sülfo-NHS-LC-Biotin ihtiva eden bir çözelti kullanılarak biyotinile edilmiştir. </li&gt; <li> 2 dakika boyunca santrifüje (1,500 x g) altında tuz giderme sütunları kullanılarak antikorlardan fazla reaktif çıkarın. </li><li> Protein konsantrasyonunu belirlemek ve HABA tahlili ile antikor biyotinilasyon derecesini belirlemek için standart Bradford tahlili kullanarak. </li><li> 16 biotin Ab başına artıkları ve nihai bir ikame son derece ile sonuçlanan, 40 ul α-Kp antikor ile 100 ul (1 x PBS içinde çözülmüş 10 mM,) karıştırılarak α-Kp-biot biyotinile antikor (Ab) toplu halde elde edilir 10 mg ml -1 protein konsantrasyonu. </li><li> Birden kullanılarak gece boyunca kültürler çoğaltmak uygun protokol aşağıdaki belirtilen antikorlar ile yıkandı bakterileri. <ol><li> Özel olarak, yıkama K. 1x PBS pneumoniae ve 4 OD&#39;ye 1x PBS içinde tekrar süspansiyon (yaklaşık 4 x 10 ml 8 CFU -1 OD -1). </li><li> Her çoğaltmak için, 100 ul PBS inkübe, α -Kp antikorları (kontrol için 10 ul α-Kp-biotB ya da 10 | il PBS) ile 30 ° C&#39;de 90 dakika boyunca 100 ul hücre 196 ul PBS 1x PBS içinde hücreleri üç kez yıkayın ve tekrar süspansiyon. </li></ol></li><li> QD705 streptavidin bağı ile hücreleri etiketlemek ve iki eşdeğer ciltlik bölün. </li><li> Bir çözüm üç kez yıkayın ve sonra uygun hacim içine tekrar süspansiyon. </li><li> , Siyah 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğine içine yıkanmış ve yıkanmamış çözümler 100 ul dağıtın. Çıkan toplam Işığında ışıldama, 490-510 nm ve 710-730 nm filtreler ölçün. Florofor konsantrasyon 450-480 nm eksitasyon ve 710-730 nm emisyon kullanılarak belirlenebilir. </li></ol>

<ol><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li>
<li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%3A+progress+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li>
<li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%3A+Official+Journal+of+the+Society+for+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li>
<li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li>
<li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262(2012).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li>
<li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li>
<li>So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li>
<li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li>
<li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence%3A+Broadening+the+scope+of+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li>
<li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+local+Ca2%2B+dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li>
<li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li>
<li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria%3A+general+cell+morphology+and+envelope+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li>
<li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+gel%3A+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li>
</ol>

Yazarlar mali çıkarlarının rekabet beyan. JD, SB, KLR ve SLS Avrupa Patent EP10290158.4 katkıda ve Dünya Fikri Mülkiyet Örgütü Patent Başvurusu WO/2011/117847.

Yakıtın temel gösterilmesi sadece flüoresan nanopartiküller ya da QDS ile lüminesan bakteri karıştırılarak elde edilebilir. İki kişiler fiziksel olarak ayrılmış ve herhangi bir etkili RET mesafe ötesinde kalır edilecektir. Daha zor in vitro ve in vivo hem de YAKIT sinyal iyileştirmedir. In vitro koşullar altında, ve bir optik absorber mevcut olmadan, hem de genellikle aşırı fluorofor eklenmesinin YAKIT tepkisini maksimuma çıkarmak için yeterli olacaktır. Ancak, bu tür statik veya çarpışma su verme gibi yüksek konsantrasyonlarda olgulara floresan sinyalinin bir kaybına yol açabilir. Bağımsız bir şekilde, ışık yayan kaynağı ve fluorofor konsantrasyonu değiştirilerek bir seyreltme serisi yapılması istenen konsantrasyonları optimize etmek için yardımcı olacaktır. Vivo konsantrasyonlarda altında kurulması ve yakıt optimizasyonu çok daha zordur ve bir vaka-by-case bazında ele alınması gerekiyor. Bir co oluşturmak zor olabilirndition floresan varlık ışıldayan kaynağı tarafından optik ulaşılabilir nerede. Bu nedenle, her iki kısımların doğrudan eş enjeksiyonu ile başlayan ve optimal koşullar altında YAKIT başarısı ile ilgili bilgiler sağlayabilir. Standart protokoller örneğin Alexa serisi ve QDS gibi floresan elemanlar ile etiketleme bakteri ve ökaryotik hücreler için vardır. Genellikle bu azalması hücre canlılığı veya değiştirilmiş metabolik aktivite gibi istenmeyen etkilere yol açabilir antikorlarla yüzey işlevselleştirilmesini veya aktivasyon gerektirir. Bunun üstesinden gelmek için, bu antikor veya aktivasyon maddesinin optimal miktarı flüoresan etiketleme maksimize ederken, hücresel bozulmaları en aza indirir gerekli belirlemek için önemlidir. QDS kullanılması nedeniyle tipik olarak geniş uyarma spektrumları, dar ve ayarlanabilir emisyon spektrumları ve büyük bir Stokes kayması olasılığı avantajlıdır. Bununla birlikte, QDS sitotoksik olabilir ve bazı durumlarda arzu edilir olmayabilir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; YAKIT birçok Bret deneylerde 13 bulunur ve Işıklı ve floresan çeşitli kaynaklardan için geçerli bir olgudur. Şimdiye kadar, yakıt edilen fotonlar, spesifik olmayan etkileşimleri ya da kötü tasarlanmış deneylerden elde edilen BRET talihsiz bir arka plan sinyalinin ürün olarak kabul edildi. Biz bu istenmeyen sinyalin programını belirlemek mümkün Burada gösterilen deney türü ile sadece. Gösterilen örneklerde, ışık yayan bakteriler floresan birimlerinin çeşitli standart bir floresan tepkisi ortaya çıkarma yeteneğine sahip bir yaygın uyarım kaynağı olarak hareket ederler. Üstelik, önemli bir çalışma mesafesine, bu YAKIT BRET oluşumu olmadan inşa edilebilir olsa da, genel olarak BRET yakıt katkısı olmadan gözlemlenemeyen sonucuna güvenlidir. Önemli bir şekilde, bir hedef ihtiyacının olmaması nedeniyle, yakıt BRET ve c arasında bulunan uzaysal açığı için kullanılabilironventional bütün hayvan görüntüleme teknikleri.

Bu tür virüsler, 1, 2, 3 bakteri ya da küçük memeliler gibi organizmaların genetik modifikasyon 4 neden olan veya yapısal olarak ifade biyoluminesans ya da, son derece başarılı olmuştur ve yaygın olarak 5-7 göstermiştir. Bio-ışıldama, doğal olarak meydana gelen reaktif içeren bir in vivo kemilüminesan reaksiyon, harici bir ışık kaynağı için gerek kalmadan ışık üretme avantajına sahiptir. Bu nedenle, biyolojik olarak ışık veren görüntüleme flüoresan görüntüleme 8 mesafede oto-ve spesifik olmayan sinyalin ortak sakıncaları muzdarip değildir. Tespit edilen bir sinyal amaçlanan kaynağından kaynaklanan sadece tarihi Sonuç olarak, biyoışıldama önemli bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Birçok model in vitro ve in vivo uygulamaları için 9&#39;da Photorhabdus luminescens, lux operon&#39;u (480 ve 490 nm arasında ortalanmış emisyon maksimum) yararlanan da, küçük bir memeli konakçının olarak kullanımıals nedeniyle görüntüleme koşulların doğası sorunlu olmuştur; optik hemoglobin gibi emiciler, ve bu doku ve kemik gibi saçılma ajanların pervading varlığı, güçlü sarı dalga boylarındaki 3 mavi etkiler. Işlenmiş bir ateşböceği lusiferaz (617nm emisyon en az) ait ekspresyon son zamanlarda büyük ölçüde optik absorpsiyon 10 üstesinden gelir, ama yine de etkiler saçılma tabi olan bir araç sağlayan, geliştirilmiş ve dahil edilmiştir. Buna karşılık, kırmızı-shift biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) 11-13 kullanılarak, 650-900 nm, minimize emilim ve dağılım bir bölgenin istenilen optik penceresinin içine yayılan sinyal birden girişimleri olmuştur. Sinyal algılama geliştirmek için bir araç olarak, alıcı olarak donör ve ilave floroforun olarak biyolüminesens kaynağını kullanan Bret, sınırlı başarı buldu. Bu olayın bir seminal örneği, &quot;kendini aydınlatıcı kuantum noktalar olarak4; (SIQDs) 14 oluşur Renilla dış polimer-lizin tabakaya bağlanmış lusiferazlar reniformis modifiye piyasada mevcut kuantum noktaları (QDS). Ayrıca alt-tabaka üzerine, sonuçtaki biyolüminesans reaksiyon kırmızı bir foton önemli üretim üreten, QDS gelen floresan emisyon neden olur. Bununla birlikte, bu SIQDs fizyolojik olarak ilgili olayların vivo görselleştirme için uygulanabilirliği sınırlıdır. Bu sınırlı uygulanabilirlik nedeniyle SIQDs genetik olarak kodlanmış edilemez ve bu nedenle polimer kabuğun ikinci bir değişiklik gerektirir, çünkü, organ, hücre veya ilgi duyulan gen için çift sonda bağlama zorluğu muhtemeldir. Bunların uygulanabilirliğini geliştirmek için, lusiferazların parlak iç ye direkt olarak bağlı olan alternatif SIQDs, yakın zamanda 15, kullanılmıştır. SIQD kavramının kapalı bina, bir daha uygulanabilir Bret sistem bir in&#39;e Cypridina lüsiferoz ekleyerek elde edildi675 nm ile 460 nm arasında önemli bir kırmızı bir değişim üretirken özellikle farelerde tümörler hedefleme yeteneğine sahip olduğunu boya 16, docyanine. -Olmayan ışıma enerji transferi geçmesi, Bret onun floresan muadili olarak aynı birincil kısıtlamaları aşağıdaki gibidir: donör emisyon ve alıcı uyarım spektrumları ve iki yarımlar arasında çalışma mesafesi arasında güçlü bir spektral örtüşme olmalıdır sırasına olmalıdır Förster yarıçapı (5-14 nm iki Förster yarıçapı 17 etkili bir maksimum mesafe ile, verici-alıcı çifti bağlı olarak). Bu mesafe bağımlılık büyük ölçüde artırmak için bir algılama aracı olarak Bret kullanılarak gözlemlenebilir olay türlerini kısıtlar. Son zamanlarda yeni bir yaklaşım, in vitro ve in vivo koşullarında hem de tanımlanmış ve altında gösterilmiştir. Bret, Lüminesans (yakıt) 18, 19, bağlanmamış Uyarma tarafından Floresans temel kapalı Binası </sup&gt; Ayrıca, ışık veren ve floresan bileşenler arasında kuvvetli bir örtüşme spektral gerektirir. Bununla birlikte, farklı BRET, yakıt parlak kaynağından yayılan foton sonradan flüorofor kuantum verimi göre kırmızı kaydırılmış foton yayan bir optik olarak erişilebilir bir florofor, tarafından emilir ve böylece tamamen ışınımsal bir süreçtir. BRET benzeyen, bu yaklaşım aynı zamanda optik emicilerin mevcudiyetinde görüntüleme kısıtların üstesinden gelmek için kullanılabilir. Elde edilen kırmızı kayma zayıflama nedeniyle bir azalma ve optik saçılma etkilerin azalmasına bulgulanan sinyal içinde genel bir artış ve özgüllük sağlar. YAKIT lux operon ve QDS 18, 19 ifade eden biyolüminesans Escherichia coli arasında meydana bildirilmiştir. SIQDs deneysel benzer olsa da, temel bir fark var: Işıklı kaynak fo sağlar florofora, fiziksel sınır olduğu için YAKIT, bu gerekli değildirparlak prob genetik kodlama r. Nedeniyle, ışık yayan bakterilerin ve QDS arasında yakıtın başarılı tespiti için, bu teknik, yüzeysel (deri) ve derin doku (akciğer, karaciğer), örneğin Staphylococcus aureus ve Klebsiellia pneumoniae gibi enfeksiyonlar hem de uygulanabilir mümkündür. Deneysel önemi rapordan bu yana, YAKIT kabul Işıklı ve floresan çiftleri tahmin etmek için kullanılır olabilir sağlam bir matematiksel model 20 içerecek şekilde gelişti ve uygulamaları gibi kuantum verimi gibi fotofiziksel özelliklerinin belirlenmesinde kullanımını kapsayacak şekilde genişlettik. Biz YAKIT temel bazı teknikler aşağıda açıklanmaktadır. Öncelikle, kısa (um) ve uzun (cm) hem de üzerinde temelden Bret YAKIT ayıran çalışma mesafeleri, bu olay için kanıt gösterebilir. İkincisi, biz floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede inceleyerek olası YAKIT çiftleri üzerine genişletmek. Third, YAKIT uygulamaları hedefli ve hedefli olmayan YAKIT çiftleri karşılaştırılarak incelenmiştir.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli luxABCDE operonunu ifade eder&nbsp;</td><td></td><td></td><td>nazikçe Jos&eacute tarafından sağlanmıştır; A. Bengoechea, Herbert P. Schweizer'in izniyle</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae 52145&nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145 bir serotip K2 referans suşu</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>standart büyüme medyası</td></tr><tr><td>Q-Tracker 705&nbsp;</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>Q21061MP</td><td></td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>Q21071MP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>Yaşam</td><td>Bilimleri S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>Floresan olmayan mikro küreler</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>Pembe mikro küreler</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>F8887</td><td>40 nm çap</td></tr><tr><td>Sarı mikro küreler</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>F8888</td><td>40 nm çap</td></tr><tr><td>Ivis Spektrumu</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Tuz Giderme Sütunları 7K MWCO</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABA test kiti ve nbsp;</td><td>Termo Bilimsel Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford testi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

bret Ötesinde bir adım: sınırsız uyarma tarafından flüoresan lüminesans dan (yakit)

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Lüminesans (yakıt) ikinci, bağlanmamış Uyarma floresans in vitro ve in vivo olarak artan bir sinyal ve kontrast üreten bir ışıma uyarma emisyonu bir süreçtir. Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (Bret), henüz aynı temel ilkeleri birçok YAKIT hisseleri büyük ölçüde Işıklı kaynağı ve floresan varlık arasında kabul edilebilir çalışma mesafeleri farklıdır. BRET etkili bir şekilde 2 kez Förster yarıçapı, genel olarak en az 14 nm&#39;lik bir maksimum sınırlı olsa da, yakıt bir optik emme yokluğunda um kadar mesafelerde cm ya da oluşabilir. Burada fenomen arkasındaki ilgili ilkeleri gözden YAKIT temeli ve uygulanabilirliği üzerine genişletmek ve floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede ile uyumluluğunu göstermek. Ayrıca, antikor hedefli YAKIT yarar keşfedilmeden. Burada gösterilen örnek YAKIT Appl için kullanılabilir olduğunu kanıtlarBRET BRET ve geleneksel bütün hayvan görüntüleme arasında bulunan uzaysal boşluğu doldurmak mümkün değildir ications.

Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi.

BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yakıtın basitliğini göstermek ve radyatif uyarılma emisyon olayları nedeniyle kırmızı fotonların oluşumunu gözlemlemektir. Bu, yakıt üretimi için biyolüminesans bakterilerin ve lüminesans nanopartiküllerin birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, yakıt sonuçlarından kaynaklanan kırmızı fotonları gözlemlemek için bir biyolüminesans plaka okuyucu kullanılır; elde edilen sonuçlar, biyolüminesans bakteriler ve kuantum noktaları aynı çözelti içinde tutulduğunda önemli miktarda kırmızı foton üretilebileceğini göstermektedir.Gözlemlenen kırmızı foton akısı artışına dayanarak, bu tekniğin çıkarımları, literatürde bireysel kolonilerden başlandığı sıklıkla rapor edilen NCE konut giriş transferi veya Brett paradigmasının sorgulanmasına yöneliktir. Standart kültür plakalarında lüminesans bakterilerin gece boyu sürecek kültürlerini başlatın.Burada, deney gününde Vibrio Fisher Eye kullanılmıştır. Taze alt kültürleri başlatın ve 600 nanometrede bir ila 1,5 optik yoğunluğa (OD) ulaşana kadar büyümelerine izin verin. Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, bakterileri yoğun sinyaller ürettikleri benzer büyüme aşamalarında kullanın.Her birinden alınan 100 µL'lik alikotları beş µL floresan prob QD 7 0 5 veya fizyolojik salin ile birleştirin. Ardından karışımı 895 µL fizyolojik salin ile birlikte standart spektroskobik küvetlere ekleyin. Doldurulan küvetleri tüm hayvan biyolüminesans görüntüleme cihazına yerleştirin ve uygun filtre setleri altında ölçümleri gerçekleştirin.Burada, farklı mesafeler üzerinden yakıt testi gerçekleştirmek için 710 ila 730 nanometre emisyon filtresi kullanılmıştır. İki adet düşük hacimli plastik fotometrik küveti, toplam bir mililitre fizyolojik salin içerisinde ya 50 mikrolitre QD 7 0 5 veya 97,2 mikrolitre floresan özelliği olmayan 48 nanometre polistiren mikroküreler ile doldurun. Bu işlem, iki varlık arasında toplam hacim başına benzer katı yüzey alanı sağlanmasını sağlar.Bir üçüncü qve'yi standart siyah bantla veya ışığı engelleyebilecek başka bir opak materyalle kaplayarak bir ışık kaynağı qve hazırlayın. Vete'nin karşıt yanlarında iki adet özdeş optik pencereyi dikkatlice hazırlayın. Taze bir alt kültürden 1 mL Vibrio fii veya başka bir kültür alikotunu ışık kaynağı vete'ye ekleyin ve herhangi bir ışık kontaminasyonunu azaltmak için siyah kağıt gibi opak bir materyalle kapatın.Ardından, önceden doldurulmuş küvetleri görüntüleyici içindeki ışık kaynağının her iki yanına yerleştirin. Üç küveti, sırasıyla 10, 30 ve 30 saniyelik pozlama süreleri kullanarak toplam ışık ve 710 ila 730 nanometre emisyon filtreleri gibi uygun emisyon filtreleri altında görüntüleyin. QD 705 konumunu doğrulamak için 450 ila 480 nanometre eksitasyon ve 710 ila 730 nanometre emisyon değerlerinde bir floresan görüntü alın.Her iki harici Q vet'i, Merkezi Q Vet'ten eşit mesafelerde daha uzağa yeniden konumlandırın. Ardından, yüz yüze nihai üç santimetre mesafe elde edilene kadar bu işlemi tekrarlamadan önce bir floresan görüntü oluşturun ve görüntü alın. İki adet düşük hacimli küvetten birini fluoro four veya ilgilenilen bir floresan nanoparçacık içeren bir mililitrelik çözeltiyle, diğerini ise negatif kontrol olarak floresan olmayan nanoparçacıklar içeren fizyolojik tuzlu su ile doldurun.Siyahla kapatılmış, karşılıklı taraflarında fiziksel olarak eşit iki optik pencere bulunan üçüncü vete'ye bir mililitre taze Vibrio FII veya diğer lüminesans bakterilerden oluşan bir alikot ekleyin; vete'yi siyah kâğıt parçası gibi opak bir maddeyle kısa ancak eşit bir mesafede örtün. İki düşük hacimli küveti, siyahla kapatılmış Q vete'nin her iki yanına yerleştirin ve uygun filtreler altında görüntüleyin; burada 0,7 santimetre mesafe kullanılmıştır. İşlemi, QD 705'in diğer floroforları ile bakteriler için tekrarlayın.Yalnızca bakterilerin olduğu duruma kıyasla kırmızı foton sayısında önemli bir artış gözlemlenir. Kontrol yakıtı, herhangi bir absorbe edici yokken uzun mesafeler boyunca gerçekleşebilir. Bu mesafe bağımlılığı, ters kare yasası ile karakterize edilebilir.Noktasal kaynaklar için. Flora fours'un bakteriyel membrana hedeflenmesinin, üretilen toplam yakıt sinyali miktarı üzerinde çok az etkisi olduğu veya hiç etkisi olmadığı görülmektedir. Bu bağlamda, hedefli yakıta birkaç yıkama adımından sonra bile korunmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, radyatif eksitasyon emisyon olaylarından kırmızı fotonlar üretmenin bir yolu olarak, yakıtın birden fazla modalite altında nasıl yeniden konstitüe edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz ultrafast tüm optik anahtarlama floresan sinyallerine karşı Raman izole etmek için kullanan bir karmaşık doğrusal olmayan optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama yetkileri kullanan, Raman ve floresan sinyalleri ayrı edebiliyoruz.

Rezonans ve spontan Raman Microspectroscopy Floresan Arkaplan reddi

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bu protokol, kemilüminesan ışık emisyonu kaynağı olarak bir rutenyum kompleksi kullanan ve böylece in vivo görüntüleme sırasında yüksek sinyal-gürültü oranları üreten yeni bir intraoperatif görüntüleme tekniğini tanımlar. İntraoperatif görüntüleme, cerrahi prosedürlerin gerçekleştirilme biçiminde devrim yaratabilecek genişleyen bir alandır.

Biyolojik ortamda oluşturuluyor ve Gözlem Kemilüminesans için Yeni Bir Teknik

Bu makalede, açık kaynaklı, ucuz smfBox'ı kullanarak biyomolekülleri serbestçe dağıtarak, açmadan hizalamaya ve odaklanmaya, veri toplama ve analize kadar, bireysel olarak tam olarak düzeltilmiş doğru FRET ölçümleri yapmak için adım adım yönergeler sağlanır.

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

In vivo Förster rezonans enerji transferi ölçümleri için standart bir konfokal lazer tarama mikroskobu kurmak ve ardından veri değerlendirmesi için bir protokol sağlanmıştır.

Yaşayan Bitki Hücrelerinde Förster Rezonans Enerji Transferi Ölçümleri

Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.

Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test

Keşfedin FUEL tekniğini, biyolüminesan bakteriler ve lüminesan nanopartiküller kullanarak kırmızı foton üretimi için. Bu yöntem, floresans araştırmalarında mevcut paradigmaları sorgulamaya yardımcı olur.

BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT)

Daha fazla video keşfet