İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, standart laboratuvar ekipmanı ile yüksek miktar ve kalitede insan makrofajları üretmektir. Bu, ilk olarak P BMC'lerin cs'lerini toplamak için Buffy kaplamalarından alınan kanın bir FI çağrı gradyanı üzerinde santrifüjlenmesiyle elde edilir. Daha sonra, çağrı başına gradyanda, monositler lenfositlerden ayrılır.

Daha sonra monositler Teflon kaplı hücre kültürü torbalarına ekilir ve farklılaştırılır. Altı veya yedi gün sonra, makrofajlar hasat edilir ve sonraki çalışmalar için tohumlanır. Elde edilen hücreler, olgun makrofajların tipik belirteçlerini ifade etmeli ve tümör hücreleri ile birlikte yetiştirme veya LPS ile stimülasyon gibi çeşitli uyaranlara yanıt vermelidir, Bu tekniğin ters akış, santrifüjleme veya manyetik aktif hücre sıralama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, insan makrofajlarının pahalı reaktiflere veya aletlere ihtiyaç duymadan standart dudak ekipmanı ile üretilebilmesidir.

Bu yöntemin gerçekleştirilmesi kolay olsa da, bu yönteme yeni olan kişiler, yoğunluk gradyanlarındaki farklı hücre popülasyonlarını görselleştirmek ve ayırmakla mücadele edebilir. Bu nedenle, bu adımların görsel olarak gösterilmesi bu zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olacaktır. Bu protokol, rotorların balanmasını kolaylaştırmak için çift olarak gerçekleştirilir.

Katmanlı kandan buffy coat fraksiyonunun iki torbasını dezenfekte ederek başlayın. Daha sonra Buffy kaplamalarını her bir kabarık ceket için iki adet 50 mililitrelik tüpe aktarın. Mililitre başına 1.077 gramda 15 mililitre oda sıcaklığında FI çağrı çözeltisi ile üç adet 50 mililitrelik tüp hazırlayın.

Şimdi yavaş ve dikkatli bir şekilde, FI çağrısının her tüpüne 30 ila 35 mililitre kabarık kat koyun. Katmanlar bu tüpleri yarım saat boyunca 400 G'de kırılmadan santrifüj etmemelidir. İki faz arasındaki oda sıcaklığında, periferik kan mononükleer hücrelerinden oluşan beyaz bir halka oluşacaktır.

Bu katmanları plastik bir pipetle çıkarın. Her donörden alınan üç tüpün katmanlarını, donör başına iki adet 50 mililitrelik tüpte birleştirin. Toplanan hücreleri 40 mililitre çizgisine kadar bir milimolar P-B-S-E-D-T-A ekleyerek yıkayın ve ardından 300 G'de oda sıcaklığında kırılmadan 10 dakika

Şimdi süpernatantları aspire edin ve atın. Ardından yıkamayı tekrarlayın ve P-B-S-C-D-T-A, her bir donörden gelen peletleri ve fenol kırmızısı içermeyen 20 mililitre RPMI artı FCS'yi yeniden askıya alın ve havuzlayın. Artık donör başına bir tüp hücre olmalıdır.

Şimdi ikinci yoğunluk gradyanını hazırlayın: 50 mililitrelik bir tüpte 1.87 mililitre 10 XPBS ile çağrı çözeltisi başına 23.13 mililitre oda sıcaklığını karıştırın. Her iki numune için bir tüp karışım hazırlayın. Daha sonra, karışımın 23 mililitresini 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Ardından fenol kırmızısı ile 27 mililitre RPMI artı FCS ekleyin. Sonuç, çağrı başına %46 ISO ozmotik çözümdür. Şimdi her donör transferi için,% 46'lık çözeltinin 25 mililitresini 50 mililitrelik bir tüpe koyun ve hücre karışımının üzerine dikkatlice katmanlayın.

İki faz, ara vermeden renklerine göre ayırt edilebilir olmalıdır. Hücreleri oda sıcaklığında yarım saat santrifüjleyin ve 550 G'de beyaz bir monosit halkası iki yüz arasında toplanacaktır. Bu hücreleri plastik bir pipetle 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Monositleri, 50 mililitre işaretine kadar doldurulmuş bir milimolar P-B-S-E-D-T-A ile yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kırılmadan 400 G'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peletlenmiş monositleri 20 mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Ardından bir sonraki bölüme geçin.

Bu protokol, kültür odası olarak FEP Teflon kaplı kültür torbalarını kullanır. Toplanan monositlerin sayısını tahmin ederek başlayın. Monositler büyüktür ve genellikle düzensiz şekillidir.

Daha küçük lenfositleri saymayın. Bir donörün 100 ila 150 milyon hücresi mevcutsa, 180 mililitre takviye RPMI hazırlayın. Daha az hücre varsa, her 30 ila 50 milyon hücre için 30 mililitre hacimde ortam hazırlayın.

20 mililitrelik bir alikotta, hücreleri 180 mililitre hazırlanmış ortama dikkatlice karıştırın. Daha sonra kültür torbasını, kültür torbasındaki tapaya bağlı 50 mililitrelik bir perfu şırınga ile hücrelerle doldurun. Şırıngayı çıkarın, kalan havayı dışarı itin ve tapayı bir koni ile kapatın.

Şimdi torbaları% 5 karbondioksit ile altı ila yedi gün boyunca inkübe edin. Altı ila yedi günlük inkübasyondan sonra, hücreleri hasat etmek için kültür torbalarını buza aktarın, torbaları tamamen buza batırın ve hücreleri ayırmak için bir saat ila üç saat soğumaya bırakın. Ardından, torbaları yaklaşık 10 kez yavaşça bir kenardan çekin.

Ardından torbaların dışını iyice dezenfekte edin. Fiş konisini 50 mililitrelik bir şırınga ile değiştirin. Daha sonra hücre süspansiyonunu çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Tüm tüpler toplandığında, 10 dakika boyunca 400 G'de döndürün Oda sıcaklığında, şimdi süpernatanı aspire edin ve tüm hücreleri 10 mililitre RPMI artı FCS'ye toplayın. Ardından hücreleri daha önce olduğu gibi sayın. Sadece makrofajları sayın, çünkü rezidüel lenfositler mevcut olabilir.

Daha sonra, kültür torbalarını yeniden kullanmak için ilgilenilen uygulama için hücreleri kullanın. Onları iki kez% 70 etanol ile yıkayın. Daha sonra bunları 50 mililitre% 70 etanol ile doldurun ve ertesi gün gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, torbaları steril PBS ile üç kez durulayın.

Daha sonra sterilizasyon kağıdına sarın ve otoklavlayın. Bir çanta, yoğunluk gradyanının 10 katı kadar kolayca yeniden kullanılabilir. Santrifüjlemeler, lenfositler ve monositler içeren beyaz bir arayüz verir.

Burada ilk yoğunluk gradyanını inceliyoruz. Grunwald olabilir. Bu hücrelerin boyanması, hem lenfositlere özgü yüksek çekirdek sitoplazma oranını hem de monositlere özgü fasulye veya halka şeklindeki çekirdekleri gösterir.

Bu lekeler ikinci gradyanın sonuçlarını gösterir. Her bir buffy ceket yaklaşık 150 milyon monosit verir, bu da yaklaşık 70 milyon makrofaj olarak farklılaşabilir. 20 preparatta monositlerin %47'si makrofaj haline geldi.

Saflaştırılmış makrofajlar, kirletici hücreler tarafından paylaşılmayan bir özellik olan plastik yüzeylere yapışarak daha da zenginleştirilebilir. Bir kez kaplandıktan sonra, çoğu makrofaj kızarmış yumurta morfolojisi gösterirken, diğerleri fenotip gibi gerilmiş bir iğ gösterir. Hücreler, birkaç işaretleyicinin ifadesi ile karakterize edilir.

Olgun makrofajlar için tipiktir. CD 11 B'nin ekspresyonu, CD 2 0 9 ekspresyonunun eksikliğinde olduğu gibi dendritik bir farklılaşmaya karşı çıkar. Farklılaşmadan sonra, hücreler beş ila yedi gün boyunca fonksiyonel ve metabolik olarak aktif kalır.

Canlı hücrelerin kalsiyum boyaması, tümör hücrelerinden dökülen kırmızı etiketli hücre dışı vezikülleri alma yeteneklerini gösterir. Ek olarak, makrofajlar aktive edilebilir, örneğin, lipopolisakkarit ile stimülasyon, birkaç pro-inflamatuar genin ekspresyonu ile sonuçlanır. Bu prosedürü takiben, izole edilen makrofajlar, sağlık ve hastalıkta makrofaj biyolojisi ile ilgili temel soruları yanıtlamak için çok çeşitli fonksiyonel analizlere tabi tutulabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek sayıda insan makrofajının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bununla birlikte, potansiyel olarak bulaşıcı olabilecek insan kan örnekleriyle çalıştığınızı hatırlamak önemlidir.