İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, standart laboratuvar ekipmanları kullanarak yüksek miktarda ve kalitede insan makrofajı üretmektir. Bu işlem, öncelikle Buffy coat kanının PBMCs'leri toplamak için bir Ficoll gradyanında santrifüjlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bir Percoll gradyanı üzerinde monositler lenfositlerden ayrıştırılır.

Ardından monositler, Teflon kaplı hücre kültürü torbalarına ekilir ve farklılaştırılır. Altı veya yedi gün sonra, makrofajlar hasat edilir ve sonraki çalışmalar için ekilir. Elde edilen hücreler, olgun makrofajların tipik belirteçlerini eksprese etmeli ve tümör hücreleriyle birlikte kültüre edilme veya LPS ile stimülasyon gibi çeşitli stimülilere yanıt vermelidir. Bu tekniğin karşı akış, santrifüjasyon veya manyetik aktive hücre ayıklama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, insan makrofajlarının pahalı reaktiflere veya cihazlara ihtiyaç duyulmadan standart laboratuvar ekipmanlarıyla üretilebilmesidir.

Bu yöntem uygulaması kolay olsa da, yöntemi ilk kez deneyen kişiler yoğunluk gradyanlarındaki farklı hücre popülasyonlarını görselleştirmekte ve ayırmakta zorlanabilirler. Bu nedenle, bu adımların görsel olarak gösterilmesi, söz konusu zorlukların aşılmasına yardımcı olacaktır. Rotorların dengelenmesini kolaylaştırmak için bu protokol çift örnekle yürütülür.

İşleme, katmanlanmış kandan elde edilen iki adet buffy coat fraksiyonu torbasını dezenfekte ederek başlayın. Ardından, her bir buffy coat için buffy coat'ları iki adet 50 mililitrelik tüpe aktarın. 1,077 gram/mililitre yoğunluğundaki oda sıcaklığındaki FI call çözeltisinden 15 mililitre içeren üç adet 50 mililitrelik tüp hazırlayın.

Şimdi yavaşça ve dikkatlice, her bir FI call tüpünün üzerine 30 ila 35 mililitre puffy coat tabakası ekleyin. Tabakalar birbirine karışmamalıdır; bu tüpleri, bozmadan 400 G'de yarım saat boyunca santrifüj edin. Oda sıcaklığında, iki faz arasında, periferik kan mononükleer hücrelerinden oluşan beyaz bir halka meydana gelecektir.

Bu katmanları plastik bir pipetle uzaklaştırın. Her donörden gelen üç tüpteki katmanları, donör başına iki adet 50 mililitrelik tüpte birleştirin. Toplanan hücreleri, 40 mililitre çizgisine kadar bir milimolar P-B-S-E-D-T-A ekleyerek yıkayın ve ardından oda sıcaklığında, frenlemeden 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.

Şimdi süpernatanları aspire edin ve atın. Ardından yıkama işlemini tekrarlayın ve P-B-S-C-D-T-A ile her donörden elde edilen peletleri yeniden süspande edip birleştirin ve 20 milliliters fenol kırmızısı içermeyen FCS eklenmiş RPMI ile karıştırın. Artık her donör için bir tüp hücre bulunmalıdır.

Şimdi ikinci yoğunluk gradyanı karışımını hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüp içerisinde oda sıcaklığındaki 23,13 mL Percoll çözeltisini 1,87 mL 10X PBS ile karıştırın. Her iki örnek için bir tüp karışım hazırlayın. Ardından, karışımın 23 mL'sini yeni bir 50 mL'lik tüpe aktarın.

Ardından, fenol kırmızılı FCS içeren 27 mililitre RPMI ekleyin. Sonuç, hücre başına %46'lık bir ISO ozmotik çözeltidir. Şimdi, her bir donör transferi için, %46'lık çözeltiden 25 mililitreyi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücre karışımının üzerine dikkatlice tabaka halinde ekleyin.

İki faz, aralarında bir kesinti olmaksızın renklerinden ayırt edilebilmelidir. Hücreleri oda sıcaklığında ve 550 G'de yarım saat boyunca santrifüjleyin. İki faz arasında monositlerden oluşan beyaz bir halka toplanacaktır. Bu hücreleri plastik bir pipet yardımıyla 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Monositleri, 50 mililitre çizgisine kadar doldurulmuş bir milimolar P-B-S-E-D-T-A ile yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında, ara vermeden 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin, süpernatantı atın ve çöken monositleri 20 mililitre besiyerinde yeniden süspanse edin. Daha sonra bir sonraki bölüme geçin.

Bu protokolde kültür odası olarak FEP Teflon kaplı kültür torbaları kullanılmaktadır. Toplanan monositlerin sayısını tahmin ederek işleme başlayın. Monositler büyüktür ve genellikle düzensiz şekillidir.

Daha küçük lenfositleri saymayın. Tek bir donörden 100 ila 150 milyon hücre mevcutsa, 180 mililitre takviyeli RPMI hazırlayın. Hücre sayısı daha azsa, her 30 ila 50 milyon hücre için 30 mililitre hacminde besiyeri hazırlayın.

20 mililitrelik bir alikotta, hücreleri dikkatlice 180 mililitre hazırlanmış besiyeri ile karıştırın. Ardından, kültür torbasındaki tıpaya takılı bir 50 mililitrelik perfü şırınga yardımıyla hücreleri kültür torbasına yükleyin. Şırıngayı çıkarın, kalan havayı dışarı itin ve tıpayı bir kon ile kapatın.

Şimdi torbaları %5 karbon dioksit ile altı ila yedi gün boyunca inkübe edin. Altı ila yedi günlük inkübasyonun ardından, hücreleri hasat etmek için kültür torbalarını buza aktarın; hücrelerin ayrılması için torbaları tamamen buza gömün ve bir ila üç saat boyunca soğumaya bırakın. Ardından, torbaları bir kenardan yaklaşık 10 kez nazikçe çekin.

Ardından torbaların dış kısmını iyice dezenfekte edin. Tıpa konisini 50 mililitrelik bir şırınga ile değiştirin. Sonra hücre süspansiyonunu çekip 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Tüm tüpler toplandığında, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin; ardından süpernatanı aspire edin ve tüm hücreleri 10 mililitre FCS eklenmiş RPMI içerisinde birleştirin. Daha sonra hücreleri önceden yaptığınız gibi sayın. Kalıntı lenfositler bulunabileceği için sadece makrofajları sayın.

Ardından, kültür torbalarını yeniden kullanmak için ilgili uygulama için hücreleri kullanın. Torbaları %70 etanol ile iki kez yıkayın. Daha sonra torbaları 50 mililitre %70 etanol ile doldurun ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin; ertesi gün torbaları steril PBS ile üç kez durulayın.

Ardından bunları sterilizasyon kağıdına sarın ve otoklavlayın. Bir torba, yoğunluk gradyanı için kolayca 10 kez yeniden kullanılabilir. Santrifüj işlemleri, lenfosit ve monositler içeren beyaz bir ara yüzey oluşturur.

Burada ilk yoğunluk gradyanını inceliyoruz. May Grunwald. Bu hücrelerin boyanması, lenfositler için tipik olan yüksek bir çekirdek sitoplazma oranının yanı sıra monositler için tipik olan fasulye veya halka şeklinde çekirdekleri göstermektedir.

Bu boyamalar ikinci gradyanın sonuçlarını göstermektedir. Her bir buffy coat yaklaşık 150 milyon monosit sağlar ve bunlar yaklaşık 70 milyon makrofaga farklılaştırılabilir. 20 preparasyonda, monositlerin %47'si makrofaga dönüşmüştür.

Saflaştırılmış makrofajlar, kontamine hücrelerin sahip olmadığı bir özellik olan plastik yüzeylere yapışma yoluyla daha da zenginleştirilebilir. Ekildikten sonra, çoğu makrofaj sahan yumurta morfolojisi sergilerken diğerleri uzamış iğsi bir fenotipe sahiptir. Hücreler, birkaç belirtecin ekspresyonu ile karakterize edilir.

Olgun makrofajlar için tipiktir. CD 11 B ekspresyonu, CD 2 0 9 ekspresyonunun yokluğuyla birlikte, dendritik farklılaşmaya karşı bir kanıt teşkil eder. Farklılaşmadan sonra hücreler, beş ila yedi gün boyunca fonksiyonel ve metabolik olarak aktif kalır.

Canlı hücrelerin kalsiyum boyaması, tümör hücrelerinden salınan kırmızı etiketli hücre dışı vezikülleri alma yeteneklerini göstermektedir. Ayrıca, makrofajlar aktive edilebilir; örneğin, lipopolisakkarit ile stimülasyon, çeşitli pro-inflamatuar genlerin ekspresyonu ile sonuçlanır. Bu prosedürün ardından, izole edilen makrofajlar, sağlık ve hastalık durumlarında makrofaj biyolojisine ilişkin temel soruları yanıtlamak amacıyla çok geniş bir yelpazedeki fonksiyonel analizlere tabi tutulabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek sayıda insan makrofajının nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ancak, potansiyel olarak enfeksiyöz olabilecek insan kan örnekleriyle çalıştığınızı hatırlamanız önemlidir.