Name: İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Öğrenin, çift yoğunluklu santrifüjle monosit izolasyonu ve teflon kaplı kültür torbalarında farklılaştırma yöntemiyle insan makrofajları üretmeyi. Bu protokol, standart laboratuvar ekipmanlarıyla yüksek verimli hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar son birkaç yıl boyunca onun her zaman mükemmel teknik yardım için Bayan Meike Schaffrinski teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma ortak araştırma grubu 942 (FOR942) içinde Alman Araştırma Kurumu (DFG) aracılığıyla ve Tıp Fakültesi, Georg-August Üniversitesi Göttingen Araştırma Programı tarafından finanse edildi.

Steril insan AB serumu hazırlanması 1. <ol><li> Taze donmuş plazma (TDP) 4-5 çanta toplayın. -20 ° C&#39;de saklayın torbaları yeterince çanta toplanıncaya kadar. </li><li> Çanta çözülme ve tamamlayıcıyı inaktive ve fibrin çıkarmak için bir su banyosu içinde 56 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> İyice torbaların dış dezenfekte ve 50 ml&#39;lik tüplere için plazma aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüje çökeltilerin ve artık trombositlerin kurtulmak için. </li><li> Tüm Süpernatantlar havuzu ve pelet atın. </li><li> Serum kısım 15 ml tüpler içinde, örnekler ve mağaza -20 ° C&#39;de ilave edildi. Not: Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen ısı ile inaktive edilmiş normal insan AB serumu kullanılabilir. </li></ol> Monositler 2. izolasyonu Santrifüj dengelenmesini sağlamak için, iki paralel ince beyaz kat işleme sokulması tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte, ca almakhücrelerin karışımı her donör için farklı malzemeler kullanmak olup yeniden. Durumda, ince beyaz kat kolayca elde edilemez, heparinize edilmiş periferal kan 400 mi yerine kullanılabilir. <ol><li> Dikkatle buffy kat içeren plastik torba dezenfekte ve iki 50 ml&#39;lik tüplere her buffy coat içeriğini aktarmak. </li><li> Her buffy coat boyunca 15 ml Ficoll çözeltisi (1.077 g / ml) ile üç adet 50 ml tüpler doldurun. Ficoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> Katman ilk yoğunluk gradyanı için Ficoll çözeltisinin üzerinde çok ince beyaz tabaka kan 30-35 mi. Her iki katmanları karıştırma önlemek için yavaş ve dikkatli bunu yapmak için dikkatli olun. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), beyaz halka toplar. </li><li> Toplam 40 ml&#39;ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun. </li><li> Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatant aspire ve 40 ml PBS-EDTA (1 mM) ile, tekrar pelet yıkayın. </li><li> Her bir vericinin bir havuz için, fenol kırmızı +% 10 FCS olmaksızın, 20 ml RPMI-1640 içinde peletler. </li><li> İkinci yoğunluk gradyanı için izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi hazırlayın: iki donör 23.13 mi Percoll çözeltisi karışımı için (yoğunluk: 1.131 g / ml), 50 ml bir tüp içinde 10 ml ile 1.87-kat PBS ile yıkandı. Sonra yeni bir 50 ml&#39;lik tüpe Bu çözeltinin 23 ml sevk ve% 46 izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi elde etmek üzere fenol kırmızı +% 10 FCS ile 27 mi RPMI-1640 ekleyin. Percoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe hazırlanan Percoll çözeltisi her defasında 25 mi verici transferi için ve Percoll çözeltisi üzerine 2.9 hazırlanan çözelti PBMC) tabakası. Çok yavaş bir bunu yapmak için dikkatli olund dikkatle, her iki tabaka kolayca karıştırmak için eğilimindedir. Eğer doğru yapılırsa iki faz nedeniyle renk onların farkı ayırt edilebilir. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 550 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan monositlerin beyaz halka toplar. </li><li> Toplam 50 ml&#39;ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun. </li><li> Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatan aspire ve fenol kırmızı +% 10 FCS, 20 ml RPMI-1640 içinde tekrar süspansiyon pelet. </li></ol> Makrofajlar monositlerin 3. Farklılaşma <ol><li> Tripan mavisi 1:10 seyreltme izole monosit sayısını belirler. Sadece monositlerdir büyük, genellikle düzensiz şekilli hücreler, saymak. Lebfositleridir küçük, yuvarlak şekilli hücreler sayılmaz. NOT: Monosit sayılar sadece hücrelerin farklılaşması için kullanılacak kaç FEP Teflon kaplı olan (küçük veya büyük) çantalar hakkında bir ipucu verir, çünkü çok doğru bir tespit gerekmez. </li><li> Bir donörden 1,0-1,5 8 x 10 monositler için, büyük bir FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba malzeme için 174 ml RPMI 1640 (Bölüm 1&#39;deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (180 mL toplam hacim) &#39;den oluşan bir kültür ortamı hazırlar. <ol><li> Bir donörden 3.0-5.0 x 10 7 monositler için, küçük bir Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba için kültür ortamı, 28.5 mi RPMI-1640 (Bölüm 1&#39;deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (30 ml toplam hacim) &#39;den oluşan hazırlar. NOT: örneğin, 8.0 x 10 7 monositler elde edilirse, biz tw onları tohum tavsiye4.0 x 10 7 hücreleri her biri O küçük hacimli torba. Bunun yerine M-CSF, monositler alternatif olarak aynı konsantrasyonda (2.5 ng / ml), granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile ayırt edilebilir. </li></ol></li><li> Hazırlanmış ortamın hücre süspansiyonu (20 mi) ilave edin ve iyice karıştırın. Iki torba tek bir donörden alınmış ise, hücre süspansiyonu, 20 ml RPMI-1640 ekleyin ve daha sonra her bir orta hazırlanması süspansiyonun yansının eklenmesi. </li><li> İsteğe bağlı: monosit preparasyonu, steril kalırsa, belirlemek için, kan agar plakası üzerine, hücre süspansiyonunun bir damla gözyaşı ve 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe etmek. </li><li> FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbanın tıpası üzerine şırınga Perfüzör 50 ml kılıfı Sıkma ve hazırlanan hücre süspansiyonu ile doldurun. </li><li> Şırınga çıkarın ve çanta dışarı kalan havayı itin. Bir kapanış koni ile çanta kapatın. </li><li> 37 ° C&#39;de 6-7 gün boyunca çanta inkübe76,% 5 CO2 ile soğutuldu. </li></ol> 4. Makrofaj Hasat <ol><li> Hücrelerin ayrılmasına (en fazla 3 saat mümkün bir enkübasyon) sağlamak için en az 1 saat boyunca buz üzerinde farklı makrofajları ile FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba yerleştirin. Torbanın bütün yüzeyi buzla kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Bir masa / kurulu kenarına minimal basınç 10x ile çanta çekin. </li><li> Dikkatlice torbanın dışında dezenfekte ve kapanış koni çıkarın. </li><li> Torbanın tıpa üzerindeki bir 50 ml şırınga Sıkma, hücre süspansiyonu çıkarın ve 50 ml&#39;lik tüplere aktarın. </li><li> Hücreleri yavaşlamalarını, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatan aspire ve toplam 10 ml RPMI-1640 +% 10 FCS içinde bir torba elde edilen taneler bir araya getirirler. </li><li> Bir hemositometrede hücre sayısını belirlemek (1: 4-1: tripan mavisi 10 seyreltme). Sadece büyük yuvarlak hücreleri saymak. Not: FEP teflonlanmış torbalarda makrofajları ayırt edilmesinden sonra, artık hücreler verici ve monosit izolasyon kalitesine bağlı olarak, lemfositler, örneğin olabilir. </li><li> FEP Teflon kaplı bir çanta tekrar kullanmak için, kalan hücrelerin çıkarılması için% 70 etanol ile iki kere yıkayın. 50 mL% 70 etanol ile doldurun ve bir gece boyunca inkübe edilir. Çanta, steril PBS ile 3 kez sterilizasyon kağıdı sarılmasıdır, ve standart prosedürler kullanılarak bir otoklav içinde sterilize yıkayın. NOT: Hücre kültürü çanta makrofaj verimlerinde herhangi bir kayıp olmadan birkaç kez tekrar edilebilir. Ancak, biz onlar sızıntı başlamadan önce 10 kullandıktan sonra çanta atmak için karar verdi. </li><li> RPMI-1640 +% 10 FCS ve sonraki deneyler için kültür makrofajlar. Daha düşük serum konsantrasyonları gerekli olması halinde,% 1 FCS ile RPMI-1640 içinde kültür da mümkündür. Tohum ve 3-4 saat inkübe hücreleri. Bu dönemden sonra, hücre kültürü makrofajlar çanağının yüzeyine bağlamak dikkatHerhangi bir bulaşık hücreleri (örneğin eritrosit, lenfositler ve dendritik hücreler) süspansiyonu kalır. Yapışmayan hücreleri çıkarmak için PBS ile en az iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Daha fazla deneyler için hücre kültürü çanak kültüre makrofajlar ayırmak için, yüzeyi dikkatlice onları kazıyın. Alternatif olarak, buz üzerinde 20 dakika süre ile inkübe yemekler kültür ortamı aspire, ve 1 ml enzimsiz hücre ayrışma tamponunu ilave edin. 37 ° C de 5 dakika inkübasyondan sonra, aşağı doğru en az 3 dakika boyunca 4 mL PBS ekleyin ve pipetleme hücreleri ayırmak ve. </li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
<li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX%283%29CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li>
<li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wingless+homolog%2C+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li>
<li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li>
<li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+inflammation%2C+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nestle+Nutrition+workshop+series.+Paediatric+programme%22%5BJournal%5D)">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li>
<li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+atherosclerosis%3A+a+dynamic+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li>
<li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li>
<li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li>
<li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li>
<li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag%3A+identification+of+the+human+monoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Reticuloendothelial+Society%22%5BJournal%5D)">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li>
<li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li>
<li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+acid+inhibits+macrophage%2Fmicroglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li>
<li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes%2C+Macrophages%2C+and+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475(2009).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages%3A+potential+candidates+for+CNS+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Ther+Transplant%22%5BJournal%5D)">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li>
<li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li>
<li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5A%2FCaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var gibi ifşa hiçbir şey yok.

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir efektör hücrelerdir ve immün, antijen sunumu ve doku homeostazında önemli fonksiyonları gösterir. Nedeniyle olağanüstü plastiklikleri, onların fenotip değişiklikleri ile farklı uyaranlara yanıt edebiliyoruz. Makrofaj markerlerinin polarizasyon sadece yaklaşık% 50 doğrudan insan 16 fareden tercüme edilmesi için kullanıldığını gösteren raporlar mevcuttur Ancak, her ne makrofaj polarizasyon ilişkin verilerin kadar çok, fare sisteminde elde edilmiştir. Bu nedenle, pahalı bir malzeme, örneğin, MACS manyetik boncuk ya da karşı akım santrifüj sivili ayrıştırma cihazına gerek olmadan burada, yeterli sayıda ve saflıkta primer insan makrofajlarını elde etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Önerilen yöntem, PBMC monositlerin izolasyonu ve FEP-makrofajlar için kendi sonra gelen değişim göre, düşük Conce varlığında, hücre kültürü çanta Teflon kaplıM-CSF 11-13 ntrations. Monositler uyarılması üzerine, insanlarda en az 5, periferik kan lökosit% 10&#39;a kadar yapmak da onlar vücut dokularında makrofajlar ve dendritik hücreler 17 için ayırt periferik bölgelerine kişi etüde dahil edilir. Sitokin M-CSF monosit hayatta kalması için önemli olduğu ve makrofajlar 18,19 kendi farklılaşma sürer. Şimdiye kadar, monosit farklılaşması için seçilen M-CSF konsantrasyonu ancak, protokolde sadece 2.5 ng / ml bir 12 M-CSF konsantrasyonu ile olgun makrofajlara yeterli sayıda elde edilmesi mümkün, 100 ng / ml kadar olan erim , 20. Buna ek olarak, hücreler, makrofajların dekolmanı ve belirli hücre sayıları ve bunların daha sonradan ekim kolaylaştırmak FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba kültürlenmiştir. Çanta birkaç kez tekrar edilebilir için bu daha da izolasyon işlemi için maliyetlerini azaltmaktadır. Bu prosedür ile elde edilen makrofajlarCD45, CD14, CD11b, CD11c&#39;nin için son derece olumlu ve saf, olgun makrofaj 21,22 nüfus için savunuyor mannoz reseptör CD206 ifadesini göstermektedir. Özellikle yüksek bir CD14 ekspresyonu M-CSF 23 varlığında farklılık makrofajlar için tipiktir. Diğer bir kızarmış yumurta fenotip sergileyen ise, hücrelerin, tohumlamadan sonra, bunlar tipik bir mil benzeri morfoloji gösteren bazı hücrelerde, plastik yüzeyler için hızlı bir yapışma göstermezler. Bu Diğer yazarlar 18,22,24 gelen gözlemlerle uyumludur. Daha sonra M-CSF varlığında monosit farklılaşma, M2-polarize makrofajlar 16,25 neden olduğu bildirilmiştir. Ancak, protokol ile izole edilmiş makrofajlar oldukları programlarını ve indüksiyon ile tepkimeye yine tümör hücreleri 26,27 veya LPS&#39;ye maruz kalan tümör hücresi türevli microvesicles ve ko-kültür maruz de dahil olmak üzere çok geniş bir uyarı aralığına cevap verebilmektedir , IL-1 &amp; gibi inflamatuar genlerin946. ;, TNFa, Wnt5a, veya M1-polarize makrofajlar 3,5,28 için tipik sayılan çeşitli matris metaloproteinaz. Sonuç olarak, teknik olarak zor veya pahalı prosedürler için gerek kalmadan çifte yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme ve makrofaj yüksek sayıda FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba sonuçlar makrofaj yönelik sonra gelen değişim ile monositlerin izolasyonu. Elde edilen makrofajlar tümör hücreleri ile birlikte-kültür, LPS birlikte klasik aktivasyonu arasında değişen bir sonraki analiz için kullanılabilir.

Makrofajlar - - monositik soy ve terminal olarak farklılaşmış hücreler türevi, gelişme, doku tamiri ve bağışıklık 1 gibi çeşitli süreçlerinde yer yol biyolojik işlevi açısından çarpıcı bir plastisite sergiler. Ikincisi kendi fagositik ve doğal ve adaptif immün yanıtı 2 arasındaki kavşakta makrofajlar yerleştirir antijen sunan yeteneği nedeniyle. Ancak, özelliği sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, diğer sinyal molekülleri ve salgılamak için 1, bağışıklık-modüle edici bir fonksiyonu artmakta, fakat aynı zamanda ek işlevler için bir temel olarak hizmet etmekle kalmamakta,. M1 ve M2 kategoride 3 sonuçlanmıştır non-mikrobiyal kaynaklı durumların bağlamında, bu çeşitli etkinleştirme adımlarını ayna dener. Bu sınıflandırma tam değil iken, makrofaj biyolojisinde temel bir anlaşılmasına olanak vermektedir. Bu çok yönlü yetenekleri nedeniyle bu makrofajlar bir şekilde doku değişiklikleri veya inflamasyon dahil pek çok koşul ile ilişkili olması sürpriz olarak gelir. Işgalci patojenlere 4-6 tanınması ve temizlik onların temel rolünün yanında, makrofajlar giderek ateroskleroz, fibrozis, obezite ve kanser 7-10 odak haline gelmiş. Insan makrofaj üretimi için bir yöntem, yeniden üretilebilir, bu patolojilerin anlaşılması için çok önemlidir. Burada, daha önce tarif edildiği gibi 11, çift yoğunluk gradyan santrifüj yöntemi ile sağlıklı donörün periferal kanından insan monositlerinde izolasyonu dayanan bir yöntem sunulmaktadır. Makrofaj farklılaşması doğru kolaylaştırmak için, izole edilmiş monositik hücreler, M-CSF ve 12 normal insan serumu düşük konsantrasyonlarının varlığında inkübe edilir. Kullanımı daha da kolaylaştırmak ve hücre hasat etmek için, gaz geçirgen bir farklılaşma FEP içinde gerçekleştirilmektedirHidrofobik bir yüzeyde 12-15 teflonlanmış hücre kültürü torba. Yine de ya bir M1 veya M2-benzeri bir şekilde yanıt yeteneğine sahip olarak elde edilen dinlenme makrofajlar deneyleri geniş tabi tutulabilir. Manyetik aktive hücre sıralama (MACS) veya santrifüj elutrasyonun (CCE) karşı akışlı olarak monosit izolasyonu ve sonraki farklılaşma alternatif yöntemler gerekli verimi, maliyet ve zaman açısından bazı sınırlamalar var. Burada tarif edilen protokolü özel reaktifler (örneğin, manyetik boncuklar Mac) ya da aygıtları (örneğin, CCE cihazı) için gerek kalmadan standart laboratuar ekipmanı ile gerçekleştirilir ve hücrelerin büyük miktarlarda işleme izin verir edilebilmesi avantajını sunar.

<table><tbody><tr><td>İmmünofenotipleme için antikorlar</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>örneğin: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE izotip kontrolü (A07796), IgG1-FITC izotip kontrolü (A07795)</td></tr><tr><td></td><td>BioLegends</td><td></td><td>örneğin: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td></tr><tr><td>Axiovert 200M mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>AnaSpec</td><td>89201</td><td></td></tr><tr><td>Kombi durdurucu kapatma konileri</td><td>Braun</td><td>4495101</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, Ca ve Mg olmadan</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td>PBS-EDTA (1 mM) için 500 ml PBS başına 1 ml 0,5 M EDTA ekleyin</td></tr><tr><td>10x PBS, Ca ve Mg</td><td>Invitrojen</td><td>olmadan 14200-067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1084211000</td><td>H2O'da 0,5 M'lik bir çözelti hazırlayın, steril bir filtre kullanın</td></tr><tr><td>Hücre ayrışma tamponu (enzim içermeyen, PBS bazlı)</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu (FCS)</td><td>İnvitrojen</td><td>10091148</td><td>ısıyla inaktive edilmiş</td></tr><tr><td>Ficoll (yoğunluk 1.077 g/ml)</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences Keçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-fare FITC</td><td>santa cruz</td><td>sc-2010</td><td></td></tr><tr><td>E.coli</td><td>Sigma</td><td>L8274'ten</td><td>LPS son konsantrasyon: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Multifuge 3 LR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/streptomisin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (yoğunluk 1.131 g/ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzör şırınga 50 ml</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>metanol içinde yeniden süspansiyon (c = 0.1 mg / ml)</td></tr><tr><td colspan="4">[başlık]</td></tr><tr><td>Plastik tek kullanımlık Pasteur pipetleri</td><td>LVL teknolojileri</td><td>2655181</td><td></td></tr><tr><td>rh M-CSF</td><td>ImmunoTools</td><td>11343117</td><td>500 & mikroda yeniden süspansiyon; l steril H2O (c = 100 ng/&mikro; l), aliquot</td></tr><tr><td>RPMI-1640 fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 fenol kırmızısı olmadan</td><td>Gibco</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizasyon kağıdı</td><td>VP grubu</td><td>3KFKFS230116</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi leke (% 0.4 w / h)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflon kaplı hücre kültürü torbası, küçük</td><td>CellGenix</td><td>72-C</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflon kaplı hücre kültürü torbası, büyük</td><td>CellGenix</td><td>197-C</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan Çift gradient santrifüj ile monositlerinde ve teflon kaplı hücre kültürü Çantalar makrofagların onların farklılaşma İzolasyonu

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

İnsan makrofajlar bulaşıcı hastalıklardan kansere kadar değişen patolojik süreçlerin bir bolluk katılmaktadırlar. Böylece bu hastalıkların altında yatan mekanizmaları anlamak için değerli bir araç oluşturmaktadır. Bu nedenle, yüksek makrofaj ürün veren bir farklılaşma olarak hazırlandı buffy kat insan monositleri, izolasyonu için basit bir protokol mevcut. Tekniği yaygın olarak bulunan laboratuar ekipmanları çoğunlukla dayanır ve böylece insan makrofaj büyük miktarlarda elde etmek için bir maliyet ve zaman etkin bir yol sağlar. Kısaca, sağlıklı kan vericilerden ince beyaz kat periferal kandan hasat monositleri bir çifte yoğunluk dereceli bir santrifüj işlemine tabi tutulur. Bu monositler, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) varlığında, flor ile birleştirilmiş etilen propilen (FEP), teflonlanmış hücre kültürü poşetlerde kültürlenir. Farklılaşmış makrofajlar kolaylıkla hasat ve ileri çalışmalar ve fonksiyonel için kullanılabilirdiyor. Kalite kontrol ve izolasyon ve farklılaşma adımları doğrulama için önemli yöntemler protokol çerçevesinde vurgulanır. Özet olarak, burada açıklanan protokol rutin ve tekrar edilebilir maliyet yoğun bir araca ihtiyaç olmaksızın, insan makrofajlarını izole etmek için bilim adamları sağlar. Ayrıca, hastalık modelleri sıçangil makrofaj kullanımını engellemeyi genden insan sistemi içinde ileri incelenebilir.

Ficoll kullanılarak birinci yoğunluk gradyan santrifüj PBMC (Şekil 1A), yani lenfositler ve monositler içeren beyaz interfazda verir. Bu, Mayıs Gruenwald boyama (lenfosit tipik) yüksek bir çekirdek / sitoplazma oranı, her iki gösterir toplanan hücreleri (Şekil 1B, C) ​​yoluyla teyit (monositler, tipik özelliği) fasulyesi ya da halka biçimli çekirdekler edilebilir. Bu hücreler daha sonra Percoll kullanarak ikinci bir yoğunluk gradyanı üzerine yüklendiğinde, monositler lemfositler daha ileri ölçüde ayrılabilir ve yeniden beyaz ara faz (Şekil 1D-F) gibi görünebilir. Her Buffy kat için tanımlanan çift yoğunluklu gradyan santrifüj rutin Buffy kat başına 70 ± 30 x 10 6 makrofajlar (Şekil 2) ayırt edilebilir 150 ± 40 x 10 6 monositlere verir. Gelen ortalama makrofaj verim20 bağımsız hazırlıkları toplam izole monositlerin 47 ±% 14 idi. Percoll Santrifüjle çevrilmenin ardından yine kan verici hem de izolasyon işleminin doğruluğu bağlıdır hazırlanması için mevcut bir miktar artık olmayan monositik hücreler olabilir. Bununla birlikte, 6-7 günlük farklılaşma aşamasından sonra, preparat esas olarak daha nedeniyle plastik yüzeylere bir biçimde bağlı, rasgele kirletici hücreleri tarafından paylaşılmayan bir özellik (Şekil 4A ile zenginleştirilebilir olgun makrofajları (Şekil 3) oluşmaktadır ve B). Bir gergin iğ benzeri fenotip (Şekil 4C ve D) ile hücreleri de varken kez makrofajların çoğunluğu klasik bir &quot;kızarmış yumurta&quot; morfolojisini, kaplama. Bu sitoplazma ve yapışma kümeler içindeki F-aktin dağılımı ile yansıtılır. Farklılaşmış hücrelerolgun makrofajları (Şekil 5) için tipik işaretleri olan CD45, CD14, CD16, CD206 (mannoz reseptörü), CD11b, CD11c ifadesi ve karakterize edilir. CD11b varlığı hücreleri, dendritik hücre işaretleyici CD209 (DC-SIGN) için negatif olduğu gerçeğiyle desteklenmektedir, ağırlıklı olarak dendritik farklılaşma karşı çıkar. Farklılaşma, sonra, hücreler fonksiyonel ve PM boyama ve tümör hücrelerine dökülen hücre dışı veziküller almak yetilerini kalsein ile görülebilir olarak yaklaşık 5-7 gün (Şekil 6), metabolik olarak aktif kalır. Ek olarak, hücreler hala çeşitli pro-enflamatuar genin (Şekil 7) &#39;nin sentezlenmesi ile sonuçlanmaktadır lipopolisakarit (LPS) ile uyarılması için, örneğin, gösterildiği gibi aktive edilebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Çifte yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme sonrası Şekil 1. Görüntü ve PBMC- bileşimi ve monosit-tabakası. Izo-ozmotik bir Percoll santrifüje edilmesinden sonra Ficoll gradyan ve (D) monosit-aşamasından sonra, (A), PBMC bant gösteren fotoğrafını çekin. Sitospin (B, C) ​​PBMC fraksiyonu hazırlıkları ve kalan (E, F) monositler içinde Mayıs-Gruenwald boyamaları. 200 B ve E mikron, C ve F 50 mikron = = Ölçek çubuğu <img alt="Şekil 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Monositler ve makrofajlar Şekil 2. Verim. Temsilcisi hücre izole monositlerin sayım ve 20 beyaz tabaka pr makrofajlareparations. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3. ve Mikrograflan (A) ve (B) görünüşü makrofaj farklılaşması önce monositler ve makrofajlar. Monositik hücre süspansiyonu, faz kontrast mikroskopisi hücre boyutu ölçümleri. Monositler (C) ve makrofajlar (D) hücre boyutuna histogramlarını gelir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4. Morfoloji ve yapışık makrofajlar iskeletinin organizasyonu. (A) önce yapışık makrofajlar Faz kontrast mikroskobu ve non-adheren sonrası (B) çıkarmaT hücreleri. Yapışkan, uyarılmamış makrofajlar içinde filamentli aktin&#39;in (C, D) Phalloidin-TRITC boyama. Ölçek çubuğu AC = 100 mikron, D. 20 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil farklılaştırılmış makrofaj 5. immunfenotipine. FEP Teflon kaplı hücre kültür çantaları farklılaşma 6 gün sonra makrofaj Flow sitometri analizi (kırmızı ile gösterilmiştir). İlgili izotip kontrolleri gri gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Makrofajlar tarafından tümör hücresi microvesicles Şekil 6. Alımı. PKH26-etiketli (kırmızı flüoresan) Tümör hücre türevli microvesicles maruz bıraktıktan sonra yapışkan makrofaj Mikrografikleridir. Görüntüler canlılığı boya kalsein AM ile ilgili (A), aydınlık veya (B) sitosolik lekelenmeye karşı yerleştirilmiştir edilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7, IL-1 β upregülasyonu, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7 ve MT1-MMP stimu sonra24 sa. Gen ekspresyonu için LPS&#39;nin (100 ng / ml) ile makrofaj lasyon toplam RNA örnekleri (A) ve HPRT1 ve GNB2L1 ifade normalize kantitatif RT-PCR ile ölçülmüştür. Belirtilen değerler muamele edilmemiş kontrol ile karşılaştırıldığında kat değişiklikler (n, ortalama ± SD = 5 * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** P &lt;0.001). LPS stimülasyon altında TNFa ve IL-6 indüksiyon ayrıca (SD ± yollarla * p &lt;0.05) ELISA (B) tarafından teyit edildi.

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Bu prosedürün genel amacı, standart laboratuvar ekipmanları kullanarak yüksek miktarda ve kalitede insan makrofajı üretmektir. Bu işlem, öncelikle Buffy coat kanının PBMCs'leri toplamak için bir Ficoll gradyanında santrifüjlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bir Percoll gradyanı üzerinde monositler lenfositlerden ayrıştırılır.Ardından monositler, Teflon kaplı hücre kültürü torbalarına ekilir ve farklılaştırılır. Altı veya yedi gün sonra, makrofajlar hasat edilir ve sonraki çalışmalar için ekilir. Elde edilen hücreler, olgun makrofajların tipik belirteçlerini eksprese etmeli ve tümör hücreleriyle birlikte kültüre edilme veya LPS ile stimülasyon gibi çeşitli stimülilere yanıt vermelidir. Bu tekniğin karşı akış, santrifüjasyon veya manyetik aktive hücre ayıklama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, insan makrofajlarının pahalı reaktiflere veya cihazlara ihtiyaç duyulmadan standart laboratuvar ekipmanlarıyla üretilebilmesidir.Bu yöntem uygulaması kolay olsa da, yöntemi ilk kez deneyen kişiler yoğunluk gradyanlarındaki farklı hücre popülasyonlarını görselleştirmekte ve ayırmakta zorlanabilirler. Bu nedenle, bu adımların görsel olarak gösterilmesi, söz konusu zorlukların aşılmasına yardımcı olacaktır. Rotorların dengelenmesini kolaylaştırmak için bu protokol çift örnekle yürütülür.İşleme, katmanlanmış kandan elde edilen iki adet buffy coat fraksiyonu torbasını dezenfekte ederek başlayın. Ardından, her bir buffy coat için buffy coat'ları iki adet 50 mililitrelik tüpe aktarın. 1,077 gram/mililitre yoğunluğundaki oda sıcaklığındaki FI call çözeltisinden 15 mililitre içeren üç adet 50 mililitrelik tüp hazırlayın.Şimdi yavaşça ve dikkatlice, her bir FI call tüpünün üzerine 30 ila 35 mililitre puffy coat tabakası ekleyin. Tabakalar birbirine karışmamalıdır; bu tüpleri, bozmadan 400 G'de yarım saat boyunca santrifüj edin. Oda sıcaklığında, iki faz arasında, periferik kan mononükleer hücrelerinden oluşan beyaz bir halka meydana gelecektir.Bu katmanları plastik bir pipetle uzaklaştırın. Her donörden gelen üç tüpteki katmanları, donör başına iki adet 50 mililitrelik tüpte birleştirin. Toplanan hücreleri, 40 mililitre çizgisine kadar bir milimolar P-B-S-E-D-T-A ekleyerek yıkayın ve ardından oda sıcaklığında, frenlemeden 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.Şimdi süpernatanları aspire edin ve atın. Ardından yıkama işlemini tekrarlayın ve P-B-S-C-D-T-A ile her donörden elde edilen peletleri yeniden süspande edip birleştirin ve 20 milliliters fenol kırmızısı içermeyen FCS eklenmiş RPMI ile karıştırın. Artık her donör için bir tüp hücre bulunmalıdır.Şimdi ikinci yoğunluk gradyanı karışımını hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüp içerisinde oda sıcaklığındaki 23,13 mL Percoll çözeltisini 1,87 mL 10X PBS ile karıştırın. Her iki örnek için bir tüp karışım hazırlayın. Ardından, karışımın 23 mL'sini yeni bir 50 mL'lik tüpe aktarın.Ardından, fenol kırmızılı FCS içeren 27 mililitre RPMI ekleyin. Sonuç, hücre başına %46'lık bir ISO ozmotik çözeltidir. Şimdi, her bir donör transferi için, %46'lık çözeltiden 25 mililitreyi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücre karışımının üzerine dikkatlice tabaka halinde ekleyin.İki faz, aralarında bir kesinti olmaksızın renklerinden ayırt edilebilmelidir. Hücreleri oda sıcaklığında ve 550 G'de yarım saat boyunca santrifüjleyin. İki faz arasında monositlerden oluşan beyaz bir halka toplanacaktır. Bu hücreleri plastik bir pipet yardımıyla 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.Monositleri, 50 mililitre çizgisine kadar doldurulmuş bir milimolar P-B-S-E-D-T-A ile yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında, ara vermeden 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin, süpernatantı atın ve çöken monositleri 20 mililitre besiyerinde yeniden süspanse edin. Daha sonra bir sonraki bölüme geçin.Bu protokolde kültür odası olarak FEP Teflon kaplı kültür torbaları kullanılmaktadır. Toplanan monositlerin sayısını tahmin ederek işleme başlayın. Monositler büyüktür ve genellikle düzensiz şekillidir.Daha küçük lenfositleri saymayın. Tek bir donörden 100 ila 150 milyon hücre mevcutsa, 180 mililitre takviyeli RPMI hazırlayın. Hücre sayısı daha azsa, her 30 ila 50 milyon hücre için 30 mililitre hacminde besiyeri hazırlayın.20 mililitrelik bir alikotta, hücreleri dikkatlice 180 mililitre hazırlanmış besiyeri ile karıştırın. Ardından, kültür torbasındaki tıpaya takılı bir 50 mililitrelik perfü şırınga yardımıyla hücreleri kültür torbasına yükleyin. Şırıngayı çıkarın, kalan havayı dışarı itin ve tıpayı bir kon ile kapatın.Şimdi torbaları %5 karbon dioksit ile altı ila yedi gün boyunca inkübe edin. Altı ila yedi günlük inkübasyonun ardından, hücreleri hasat etmek için kültür torbalarını buza aktarın; hücrelerin ayrılması için torbaları tamamen buza gömün ve bir ila üç saat boyunca soğumaya bırakın. Ardından, torbaları bir kenardan yaklaşık 10 kez nazikçe çekin.Ardından torbaların dış kısmını iyice dezenfekte edin. Tıpa konisini 50 mililitrelik bir şırınga ile değiştirin. Sonra hücre süspansiyonunu çekip 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tüm tüpler toplandığında, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin; ardından süpernatanı aspire edin ve tüm hücreleri 10 mililitre FCS eklenmiş RPMI içerisinde birleştirin. Daha sonra hücreleri önceden yaptığınız gibi sayın. Kalıntı lenfositler bulunabileceği için sadece makrofajları sayın.Ardından, kültür torbalarını yeniden kullanmak için ilgili uygulama için hücreleri kullanın. Torbaları %70 etanol ile iki kez yıkayın. Daha sonra torbaları 50 mililitre %70 etanol ile doldurun ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin; ertesi gün torbaları steril PBS ile üç kez durulayın.Ardından bunları sterilizasyon kağıdına sarın ve otoklavlayın. Bir torba, yoğunluk gradyanı için kolayca 10 kez yeniden kullanılabilir. Santrifüj işlemleri, lenfosit ve monositler içeren beyaz bir ara yüzey oluşturur.Burada ilk yoğunluk gradyanını inceliyoruz. May Grunwald. Bu hücrelerin boyanması, lenfositler için tipik olan yüksek bir çekirdek sitoplazma oranının yanı sıra monositler için tipik olan fasulye veya halka şeklinde çekirdekleri göstermektedir.Bu boyamalar ikinci gradyanın sonuçlarını göstermektedir. Her bir buffy coat yaklaşık 150 milyon monosit sağlar ve bunlar yaklaşık 70 milyon makrofaga farklılaştırılabilir. 20 preparasyonda, monositlerin %47'si makrofaga dönüşmüştür.Saflaştırılmış makrofajlar, kontamine hücrelerin sahip olmadığı bir özellik olan plastik yüzeylere yapışma yoluyla daha da zenginleştirilebilir. Ekildikten sonra, çoğu makrofaj sahan yumurta morfolojisi sergilerken diğerleri uzamış iğsi bir fenotipe sahiptir. Hücreler, birkaç belirtecin ekspresyonu ile karakterize edilir.Olgun makrofajlar için tipiktir. CD 11 B ekspresyonu, CD 2 0 9 ekspresyonunun yokluğuyla birlikte, dendritik farklılaşmaya karşı bir kanıt teşkil eder. Farklılaşmadan sonra hücreler, beş ila yedi gün boyunca fonksiyonel ve metabolik olarak aktif kalır.Canlı hücrelerin kalsiyum boyaması, tümör hücrelerinden salınan kırmızı etiketli hücre dışı vezikülleri alma yeteneklerini göstermektedir. Ayrıca, makrofajlar aktive edilebilir; örneğin, lipopolisakkarit ile stimülasyon, çeşitli pro-inflamatuar genlerin ekspresyonu ile sonuçlanır. Bu prosedürün ardından, izole edilen makrofajlar, sağlık ve hastalık durumlarında makrofaj biyolojisine ilişkin temel soruları yanıtlamak amacıyla çok geniş bir yelpazedeki fonksiyonel analizlere tabi tutulabilir.Bu videoyu izledikten sonra, yüksek sayıda insan makrofajının nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ancak, potansiyel olarak enfeksiyöz olabilecek insan kan örnekleriyle çalıştığınızı hatırlamanız önemlidir.

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, monositlerin tam insan kanından immünmanyetik negatif ayırma ile izolasyonunu gösteriyoruz. İzole edilmiş monositler, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Monositlerin Tam Kandan İmmünomanyetik Negatif Seleksiyon ile İzolasyonu

Bu video, birincil monositlerin makrofajlara hazırlanmasını göstermektedir. Birincil insan monositleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak M1 benzeri bir pro-inflamatuar fenotipe veya makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanılarak M2 benzeri bir anti-inflamatuar fenotipe izole edilebilir ve farklılaştırılabilir.

İn Vitro Kültür ve Primer Monositlerin Makrofajlara Farklılaşması

Bu videoda, periferik kandan türetilmiş monositlerin M1 veya M2 makrofajlarına farklılaşmasını ve polarizasyonunu indüklemek için bir prosedür gösteriyoruz. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, lipopolisakkarit ve interferon-gama ile inkübasyon, pro-inflamatuar M1 makrofajları verirken, makrofaj koloni uyarıcı faktör ve interlökin-4 ile inkübasyon, anti-inflamatuar M2 makrofaj üretimini indükler.

Monosit Kaynaklı Hücrelerin Makrofaj Benzeri Hücrelere Farklılaşması ve Polarizasyonu

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Bu çalışma, in vitro dendritik hücreler (DC'ler) elde etmek için iki farklı insan monosit izolasyonu yöntemini karşılaştırmaktadır. Monositler yapışma ile seçilir veya manyetik ayırma ile negatif olarak zenginleştirilir. Monosit verimi ve canlılığı ile MDDC canlılığı, proliferasyonu ve CD11c/CD14 yüzey marker ekspresyonu her iki yöntem arasında karşılaştırılacaktır.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

makrofaj Farklılaşması ve Polarizasyonu, İnsan Monosit Benzeri THP-1 Lösemi Hücre Hattı Kullanarak M2 Benzeri Bir Fenotipe Dönüştür

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Öğrenin, çift yoğunluklu santrifüjle monosit izolasyonu ve teflon kaplı kültür torbalarında farklılaştırma yöntemiyle insan makrofajları üretmeyi. Bu protokol, standart laboratuvar ekipmanlarıyla yüksek verimli hücre elde edilmesini sağlar.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu (Video) | JoVE Journal

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Daha fazla video keşfet