Tavuk Embriyolarının In ovo Elektroporasyonu

Elektroporasyon, hücrelere yabancı genetik materyal aktarmak için kullanılan bir tekniktir. Tavuk embriyolarına yumurta içindeyken uygulanan elektroporasyon veya in ovo elektroporasyon, genetik materyal iletiminin belirli dokulara ve belirli gelişimsel zaman noktalarına yerelleştirilebilmesi nedeniyle gelişimsel biyologlar için değerli bir araçtır. Bu video, in ovo elektroporasyonun temel prensiplerini tanıtacak, prosedürün temel adımlarını açıklayacak ve bu tekniğin gelişim sırasındaki biyolojik süreçleri incelemek için nasıl kullanılabileceğini tartışacaktır.

Başlamak için, DNA'nın bir hücreye nasıl aktarılabileceğini anlamak adına elektroporasyonun temel prensiplerini gözden geçirelim.

İlk olarak, DNA'yı hedef hücrenin hemen yakınına iletmek için mikroenjeksiyon kullanılır. Ancak, DNA hücre içine girmek için plazma membranını geçemez.

Bu sorunu çözmek için, membranın stabilitesini bozarak gözenekler oluşturmak amacıyla bir elektrik akımı uygulanır. Bu elektrik alanın ikinci bir sonucu, negatif yüklü DNA'nın pozitif elektroda doğru göç etmesidir. Sonuç olarak, enjeksiyon bölgesinin pozitif elektroda daha yakın olan tarafındaki hücreler DNA ile transfekte olur.

Temel prensipleri öğrendiğinize göre, embriyoların elektroporasyon için nasıl hazırlanacağından bahsedelim. Hamburger Hamilton evre 20'den daha yaşlı embriyolar kullanmanız gerekiyorsa, dokulara daha iyi erişim sağlamak için civcivlerinizi kabuk dışında, yani ex ovo kültüre etmeniz en iyisidir. Bu video, kabuk içinde gelişen erken evre embriyolar üzerinde gerçekleştirilen elektroporasyonlara, yani in ovo uygulamalarına odaklanacaktır.

Başlamak için yumurtalar, istenen gelişim evresine ulaşana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edilmelidir. Yumurtalar inkübe olurken, enjeksiyon ve elektroporasyon araçlarını hazırlayın. İlk olarak, bir pipet çekici ile 0,5 mm'lik bir cam pipeti çekerek kapiler iğneler oluşturun. Pipeti açmak için onu bir mikroskobun altına yerleştirin ve ucundan küçük bir parça kırın. Ardından, konstrüktünüzün uygun bir dilüsyonunun yanı sıra, enjekte edilen solüsyonu görselleştirmenize yardımcı olacak bir boya içeren enjeksiyon solüsyonunu hazırlayın.

İğne içindeki sıvı hareketini kontrol etmek için, iğneyi insan gücüyle çalışan bir ağız pipetine bağlayın. Alternatif olarak iğne, ayarlanabilir hava basınç darbeleri sağlayan bir mikroenjektöre yüklenebilir. İğnenin ucunu enjeksiyon solüsyonuna daldırıp negatif basınç uygulayarak iğneyi doldurun.

İğnelere ek olarak, elektrotlara da ihtiyacınız olacaktır. Bunlar, bir adaptörle birbirine sabitlenmiş iki açık telden oluşur. Bir çift kablo, elektrotları; darbe süresini, frekansını ve voltajını kontrol eden elektrik darbe jeneratörüne veya elektroporatöre bağlar. Ellerin serbest kullanımı için elektroporatör, bir ayak pedalı ile etkinleştirilebilir.

Yumurtalar hazır olduğunda, kabukta bir pencere açın ve embriyonun kurumasını önlemek için Hanks gibi birkaç damla fizyolojik tuz solüsyonu ekleyin. Bir mikroskop altında, yumurtayı ilgilenilen doku iğne ile erişilebilir olacak şekilde konumlandırın. Ardından, kapiler iğne ile embriyoyu delin ve nazikçe basınç uygulayarak solüsyonu iletin.

Konstrükt enjekte edildiğine göre, artık elektroporasyonu gerçekleştirme zamanı geldi. Elektrotları, Hank çözeltisinin içine batacak ve ilgili doku aralarında merkezlenecek şekilde konumlandırın. Elektrik akımını uygulamak için ayak pedalına basın ve elektrotların etrafında kabarcıklar oluşup oluşmadığını kontrol edin.

Elektroporasyon tamamlandığında, elektrotları embriyodan çıkarın ve %70 etanol ile silin. Enfeksiyonu önlemek için antibiyotiklerle takviye edilmiş tuz çözeltisinden birkaç damla ekleyin ve pencereyi bantla kapatın. Son olarak, fenotipik analiz öncesinde gelişimin devam etmesi için yumurtaları tekrar inkübatöre yerleştirin.

in ovo elektroporasyon hakkında her şeyi öğrendiğimize göre, bilim insanlarının bu tekniği gelişimsel araştırmalarda nasıl uyguladıklarına dair bazı örneklere bakalım.

Başlangıç olarak, elektroporasyon, knockdown konstrüktlarının iletilmesi yoluyla gen ekspresyonunu bloke etmek için kullanılabilir. Bu örnekte, gelişmekte olan nöral tüp hücrelerine gen susturma konstrüktları ile elektroporasyon uygulanmıştır. Embriyoların gelişmesine izin verilmiş ve ardından akson yönlemesinin genetik kontrolünü değerlendirmek için normal ve knockdown örnekleri arasında akson trajektörileri karşılaştırılmıştır.

Öte yandan, in ovo elektroporasyon, protein kodlayan bir gen ve transkripsiyonu başlatmak için RNA polimerazı bağlayan bir dizi olan promotör içeren bir plazmidin aktarılmasıyla, hücrelerin bir alt kümesinde bir protein eksprese etmek için de kullanılabilir. Burada bilim insanları, embriyonik beyin hücrelerine tek bir gen iletmişlerdir. Hem bu genin protein ürününü hem de spesifik nöral alt tip belirteçlerini tespit etmeye yönelik doku boyamaları, elektropore edilen genin nöral gelişimi değiştirdiğini göstermektedir.

Gelişim sırasında hücreleri ve yapıları görselleştirmek için floresan proteinleri kodlayan DNA konstrüktleri de elektroporasyon ile aktarılabilir. Bu, omurilik gelişimi gibi karmaşık süreçlerin canlı görüntülenmesine olanak tanıyarak hücre hareketlerinin zaman içindeki dinamikleri hakkında bilgi sağlar.

Genetik materyalin civcivlere aktarılması için yararlı bir teknik olan in ovo elektroporasyona giriş konulu JoVE videosunu izlediniz. Bu videoda elektroporasyonun temel ilkeleri, civcivlere enjeksiyon ve elektroporasyon için gereken adımlar ve bu tekniğin güncel gelişimsel araştırmalardaki uygulamaları ele alınmıştır. İzlediğiniz için teşekkürler!