Name: Dinamik Ca Otomatik Analizi 2 + Sinyaller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Öğrenin, domuz koroner arterlerinde endotel kalsiyum aktivitesini otomatik ROI analizi ile incelemeyi. Bu yöntem, kullanıcı hatasını azaltarak kardiyovasküler fizyoloji araştırmalarında güvenilir veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen Sağlık Hibeler HL-085.887, HL-092.992, S10RR027535 ve MOP-93.676.

1.. Gemi Diseksiyon ve Görüntüleme <ol><li> Martens ve diğ 27 de tarif edildiği gibi iç çocuk domuz Hasat doku. Bir polidimetilsiloksanın (PDMS) HEPES fizyolojik tuzlu su solüsyonu (PSS) tamponlu içeren alt diseksiyon çanak içine hasat domuz sağ ventrikülleri yerleştirin. <ol><li> Bir stereomikroskopta yardımıyla, incelemek ve çevre kardiyak doku katmanlarından damar segmentini kaldırarak forseps ve yaylı makas kullanılarak çevreleyen dokudan koroner arter (~ 8 mm uzunluk, 0.5 mm çap) sol ön inen bir bölümünü kaldırın. NOT: damar duvarı delmek değil dikkat edin. </li><li> Diseksiyon çanak içine PDMS bloğu (1 x 0.5 x 0.5 cm) yerleştirin, ve alt iğnelemekle bir iğne kullanın. Mikro iğnelerin şekillendirme, oniki ~ 0.3 cm uzunluk kesimleri içine yaklaşık 40 mikron çaplı tungsten tel kesme ve çanak bu yerleştirin. Forseps kullanılarak, bir micropi ile blok damar segmentinin bir ucunu güvenlin. </li><li> Dikkatle damar lümenine küçük yaylı makas yerleştirin ve tamamen açmak için geminin bir tarafında aşağı uzunlamasına kesilir. Endotel yukarıya açılan damar segmentini yönlendirin. </li><li> Damar düz bir dikdörtgen oluşturur, öyle ki engellemek için açılan damar segmentinin sınırları güvence altına almak için, geri kalan mikro iğnelerin kullanın. NOT: Micropin üstleri 90 ° eğildi ve blok yüzeyi ile aynı hizada kadar takılmalıdır. Care gerilmeden olmadan damar hazırlık uzatmak için alınmalıdır; Nihai genişliği ~ başlangıç ​​esnetilmemiş genişliğini 1.5x edilmelidir. </li><li> 134 NaCl, KCl 6: a HEPES içinde pluronik (% 0.03) ile DMSO içinde çözülmüş Fluo-04:00 (10 uM) karıştırılarak Fluo-04:00 yükleme çözeltisi küçük bir hacmi (~ 1 ml) hazırlayın mM ihtiva eden PSS (tamponlu , 1 MgCİ, 10 HEPES, 10 glukoz) ve karanlıkta oda sıcaklığında yaklaşık 40 dakika boyunca yükleme çözeltisi içine bütün bir blok yerleştirin. </li><li> Yükleme işleminden sonra, HEPES tamponlu blok yıkayın5-10 dakika için PSS. </li><li> HEPES PSS&#39;ye tamponlu içeren bir coverglass alt odasına 50-100 mikron kalınlığında ayırıcılar üzerine bloğunu monte edin. NOT: Metal pimler ayırıcılar olarak kullanılan ve damar segment aşağı bakacak ve aralıklarına değmiyor emin olabilir. </li><li> Konfokal görüntüleme için donatılmış bir inverted mikroskop sahnede odasına yerleştirin ve endotel hücre tabakası üzerine odaklanır. </li><li> ~ 3 20X büyütme dakika ve konfokal görüntü sırası aquisition yazılımını kullanarak saniyede ~ 8 kare hızı için bazal göreceli floresan yakalama zaman atlamalı görüntü dizileri. </li><li> Bazal floresans kayıt ~ 3 dakika sonra, bir HEPES addtional 3 dakika için aynı tampon HEPES içinde PSS çözündürüldü, Madde P (100 pM) hacimle (~ 1 ml), ve bir kayıt ile PSS tamponlu çözelti değiştirin. </li></ol></li></ol> 2.. Otomatik Analizi <ol><li> 8 bit, g konfokal toplama yazılımı floresan kalsiyum aktivitesinin görüntü dizisi (ler) RenderHiçbir ölçekli bilgi rayscale &#39;. tif&#39; formatındaki dosyalar. </li><li> Açık ImageJ, dosya menüsünde &#39;açık&#39; tıklayın ve ImageJ görüntü dizisi (ler) görüntülemek için explorer penceresinde uygun görüntü dizisini seçin. </li><li> Görüntü sekans (lar) içinde faaliyet mekansal yayılma üst ve alt sınırları tahmin etmek için dikdörtgen ROI aracını kullanarak, uygun bir ROI çapı belirler. NOT: ortalama dikdörtgen çapı ROI çapı için uygun bir seçimdir. </li><li> Bilgisayarın sabit sürücüsünde yeni bir klasör oluşturun ve klasörü dizine görüntü dizisi (s) ekleyebilirsiniz. </li><li> ImageJ, &#39;Eklentiler&#39; penceresini tıklayın, ardından analizi başlatmak için &#39;LC_Pro tıklayın. </li><li> ROI çap değerini girin ve filtre eşik değerini (0.05 veya 0.01) seçin. </li><li> &#39;Ilaç tedavisi&#39; onay kutusunu tıklayın ve hemen önce ve sonra ilaç ilave edildi (saniye) zaman noktası değerleri girin. </li><li> &#39;Tamam&#39; düğmesini tıklayın vedosya gezgini penceresine görüntü dizisi dizini girin. </li></ol> 3.. Grafik Çıktı <ol><li> Den R sürüm 3.0.2 indir <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> R. 32 bit sürümünü açın </li><li> &quot;Dosya&quot;, daha sonra &#39;açık komut tıklayın ve grafiksel deney raporları oluşturmak için&#39; traceplot.R &#39;R komut seçin. </li><li> &#39;Paketler&#39; seçerek kalibre ve gplots paketleri yüklemek, &#39;paketleri yüklemek&#39;, ve uygun sistemlerin paketleri seçerek. </li><li> &#39;Change directory&#39; komutu ardından, &#39;dosya&#39; tıklayın ve LC_Pro analiz çıkışına karşılık dizini seçmek için kaşif penceresini kullanın. </li><li> Komut penceresinde tıklatın ve sonra da &#39;çalışan tüm&#39; komut dosyasını çalıştırmak için komut. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Hücresel ve çok hücreli düzeyde karmaşık Ca 2 + sinyalleri çözme titiz deneysel ve analitik yaklaşımlar gerektirir. Burada, bir yaklaşım Ca 2 + bağımlı floresans çözülmesi konfokal resim dizileri sunulan spesifik durumda sağlam hücre alanları içinde istatistiksel olarak ilgili Ca 2 + sinyalleri tespit eder ve miktarını belirler otomatik analizine tabi tutulur ve bu süre de açıklanan, bir arter kademeli bir izole edildi domuz kalbinden, tutturulmuş konfokal görüntüleme tabi Ca 2 +</s...

Ca 2 + molekülü ve sitozolik Ca 2 + düzeyleri yüksek regüle edilen sinyalizasyon bir yerde ikinci bir elçisidir. Hücre içi Ca 2 + sinyalleri karmaşık ve izole geçişlerini, salınımlar ve dalgalar 1 çoğaltım dahil - 4. Ca 2 + mekansal ve zamansal kontrol Fizyolojik sinyal özgüllüğünü altında yatan düşünce, ve bu nedenle Ca 2 + sinyal şekillerinin analizi birden fazla alanlarda 5 araştırmacılara büyük ilgi olduğunu. Bu tür Flu-4 ve Fura-2 ile Ca 2 + göstergesi boyalar genel olarak 5-12 floresan mikroskobu ile hücre içi Ca2 + sinyalleri ölçmek için kullanılır. 16 - Genellikle, geçici Ca 2 + sinyalleri zamana bağımlı kullanıcı tanımlı bir alanda ortalama floresan değişiklikler, ya da ilgi bölgesi (ROI) 5,6,13 olarak değerlendirilir. Şu anda, manuel ROI analizi zaman alıcı ve emek hem de bir19 - birçok İB&#39;leri belirlemek ve tekrarlayan hesaplamaları 17 gerçekleştirmek için kullanıcılar gerektirir çünkü da oldukça kapsamlıdır. Bu teknikler aynı zamanda yapay sinyal modları ve düşük genlikli veya yaygın sinyallerinin 18,20 dışlanma tanıtımı dahil olmak üzere, önemli kullanıcı hatası tabi olabilir. , Otomatik ROI algılama algoritmaları önceden optimum ROI yerleşimi belirlemek için istatistiksel yaklaşımlar çeşitli kullanarak uygulanan olmuştur, ama genellikle çizgi tarama ya da sözde-line zaman 17 tek bir mekansal boyut analizi kısıtlar tarama görüntüleri analiz sınırlı olmuştur 19-22. Ayrıca, birçok mevcut algoritmaları Ca periyodik, lokalize transientler dan yayılan dalgalar 23,24 aralığında 2 + serbest olaylar çeşitliliğini kapsayacak şekilde yeterli değildir. Fizyolojik Ca 2 + sinyalleri kapsamlı değerlendirme genellikle daha önemli görüntü artif varlığı ile komplikebirçok deneysel sistemlerde gürültü ayrımcılığa sinyalini karıştıran hareket. Daha önce, Ca otomatik ROI algılama algoritması çözüm 2 + (Sağlık, Bethesda, MD National Institutes), gelişmiş ve 25,26 valide NIH ImageJ yazılım için bir eklenti olarak uygulanan geçici algılama sinyal. LC_Pro denilen Bu algoritma, iki-boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri Ca 2 + sinyal geçişlerini kapsayan İB&#39;leri tanımlamak ve analiz etmek için tasarlanmıştır. İşte pratik bir deneysel protokol ve domuz koroner arter endotelyumda algoritmanın bir uygulama temsili gösteri kullanılabilir grafik çıktısı oluşturmak için açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar kullanarak ek komutlar ile sağlanır.

<table><tbody><tr><td>Diseksiyon kabı</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>elastomer kiti, tabaklara kalıplanmalıdır</td></tr><tr><td>HEPES tamponlu PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES asit</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td> <td># 11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Bahar makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten tel</td><td>Bilimsel Inst Svcs</td> <td># 406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Yaşam Teknolojisi.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Metal pimler</td><td>Güzel Bilim Araçları</td> <td># 26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı cam alt hazne</td><td></td><td></td><td>Özel tasarlanmış</td></tr><tr><td>Eğirme diski konfokal mikroskop</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html" için LC_Pro eklentisi>şu adresten indirin: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">download: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">download: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

dinamik ca otomatik analizi<sup&gt; 2 +</supgörüntü dizilerinde&gt; sinyaller

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Hücre içi Ca 2 + sinyalleri sık floresan Ca 2 + göstergesi boyalar ve mikroskopi teknikleri ile incelenmiştir. Bununla birlikte, Ca 2 + görüntüleme de niceliksel veri analizi, zaman alıcı ve önyargı tabidir. Ilgi (ROI) algılama bölgeye dayalı otomatik sinyal analizi algoritmaları tek boyutlu çizgi tarama ölçümleri için uygulanan olmuştur, ama iki-boyutlu görüntü dizilerinin optimize kimlik ve İB&#39;nin analizini entegre hiçbir geçerli algoritma yoktur. Burada, resim dizilerinin hızlı elde edilmesi ve ROI analizi için bir algoritma tarif edilmektedir. Bu elips optimum ROI yerleşimini belirlemek amacıyla gürültü filtre sinyallerine uygun kullanır, ve genlik, süre ve mekansal yayılma Ca 2 + sinyal parametrelerini hesaplar. Bu algoritma ImageJ (NIH) bir yazılım için serbestçe kullanılabilir eklenti olarak hayata geçirildi. Birlikte açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar için yazılmış analizi komut ile,Bu yaklaşım, deneysel çıktı hızlı istatistiksel analiz yapmak için yüksek kapasiteli bir boru hattı sağlar. Yazarlar bu analiz protokolün kullanımı fizyolojik Ca 2 + sinyal bir daha tam ve tarafsız karakterizasyonu yol açacağını göstermektedir.

Özel bir algoritma, LC_Pro, gelişmiş ve Ca otomatik analizini gerçekleştirmek amacıyla hayata geçirildi konfokal görüntü dizileri üzerinde 2 + dinamikleri. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, algoritma A) algılar ve dinamik Ca parça siteleri ardışık işleme modülleri kullanır 2 + &lt;0.01), gürültü, B) aktif bölge merkezlerinde otomatik olarak (ROI) bölgeleri tanımlar ve istatistiksel (p yukarıda değiştirmek C) Belirli bir olay parametreleri belirlemek için ROI&#39;ler ortalama flore...

Burada iki boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri içinde olumlu sinyal bölgelerine atanan en uygun elips sıralama dayanan faiz analiz protokolünün yeni bir bölge gösterilmiştir. Bu algoritma kapsamlı az kullanıcı girişi ve önyargı ile fizyolojik Ca 2 + sinyalleri analiz müfettişleri sağlayabilir.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, otomatik ROI analizi kullanarak domuz koroner arterlerindeki endotelyal kalsiyum aktivitesini analiz etmektir. Bu, ikinci bir adım olarak endotelyal kalsiyum aktivitesini ölçmek amacıyla domuz koroner arterlerinin diseke edilmesi ve açılmasıyla gerçekleştirilir. Elde edilen kalsiyum ölçümleri üzerinde otomatik ROI analizi uygulanır ve bu işlem, kalsiyum aktivitesinin özetlenmiş çıktısıyla sonuçlanır.Kalsiyum aktivite analizi sonuçlarını istatistiksel olarak analiz etmek ve grafiksel olarak sunmak amacıyla çıktı üzerinde sonraki yazılım scriptleri çalıştırılır; böylece otomatik ROI analizi ve istatistiksel işlemeye dayalı kalsiyum sinyal geçiş parametrelerini gösteren kalsiyum aktivite analizi sonuçları elde edilir. Bu tekniğin manuel ROI analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, otomatik analizlerin daha hızlı, daha kapsamlı ve kullanıcı hatasına daha az açık olmasıdır. Bu prosedürde, hasat edilen domuz sağ ventriküllerini, HEPES tamponlu fizyolojik salin solüsyonu içeren A-P-D-M-S alt diseksiyon kabına yerleştirin.Stereo mikroskop altında, sol ön inen koroner arterin bir segmentini çevredeki kalp dokusu tabakalarından diseke ederek çıkarın. Damar duvarını delmemeye dikkat edin. Ardından, PDMS bloğu diseksiyon kabına yerleştirin ve onu tabana sabitlemek için bir iğne kullanın.Kaba tampon ekleyin. Ardından, yaklaşık 40 mikron çapındaki bir tungsten teli, mikro pinler oluşturacak şekilde 0,3 santimetre uzunluğunda 12 segmente bölün ve bunları kaba yerleştirin. Damar segmentinin bir ucunu bir mikro pin ile bloğa sabitlemek için pens kullanın.Küçük yaylı makası damar lümenine dikkatlice yerleştirin ve damarı tamamen açmak için bir kenarından boyuna doğru kesin. Ardından, açık damar segmentini endotelyum yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Açık damar segmentinin kenarlarını, damar düz bir dikdörtgen oluşturacak şekilde bloğa sabitlemek için geri kalan mikro pinleri kullanın.Ardından bir mililitre flu oh 4:00 AM yükleme çözeltisi hazırlayın. Tüm bloğu, oda sıcaklığında ve karanlıkta yaklaşık 40 dakika boyunca yükleme çözeltisi içinde bekletin; yüklemeden sonra bloğu beş ila 10 dakika boyunca heaps buffered PSS ile yıkayın. Sonrasında, bloğu heaps buffered PSS içeren bir lam tabanlı hazne içinde 50 ila 100 mikron kalınlığındaki ara parçalar üzerine monte edin.Hazneyi konfokal görüntüleme için donatılmış bir ters mikroskobun tablasına yerleştirin ve konfokal görüntü dizisi edinme yazılımını kullanarak endotel hücre tabakasına odaklayın; 20x büyütmede ve saniyede sekiz kare hızında üç dakika boyunca bazal bağıl floresan zaman ayarlı görüntü dizilerini kaydedin. Bazal floresan kayıt işleminin üç dakikalık süresi dolduktan sonra, HEPES tamponlu PSS çözeltisini, HEPES tamponlu PSS içinde çözünmüş 100 picomolar substans P ile aynı hacimde değiştirin ve üç dakika daha kayıt yapın. Bu prosedürde, konfokal edinme yazılımındaki floresan kalsiyum aktivitesi görüntü dizisini, ölçek bilgisi içermeyen sekiz bitlik gri tonlamalı TIFF formatında bir dosya olarak dışa aktarın.Ardından ImageJ programını açın. Dosya menüsünden "aç" (open) seçeneğine tıklayın ve gezgin penceresinden uygun görüntü dizisini seçin. Görüntü dizisini ImageJ'de görüntülemek için, görüntü dizisindeki aktivitenin uzaysal yayılımının üst ve alt sınırlarını tahmin etmek amacıyla dikdörtgen ROI aracını kullanarak uygun bir ROI belirleyin. Daha sonra, bilgisayarın sabit sürücüsünde yeni bir klasör oluşturun ve görüntü dizisini bu klasör dizinine ekleyin.Image J'de, eklentiler penceresine tıklayın. Ardından lc pro'ya tıklayın. Analizi başlatmak için ROI çap değerini girin ve ardından filtre eşik değerini seçin.İlaç uygulaması onay kutusuna tıklayın ve ilacın eklenmesinden hemen önceki ve sonraki zaman noktası değerlerini girin. Ardından tamam düğmesine tıklayın ve dosya gezgini penceresine görüntü dizini dizinini girin. Bu adımda, R versiyon 3.0 0.2'yi indirin ve kurun.Ardından R'ın 32 bit sürümünü açın. Sonra dosya seçeneğine tıklayın. Daha sonra betik aç seçeneğine gidin ve grafiksel deneysel raporlar oluşturmak için trace plot RR betiğini seçin. Paketler seçeneğini kullanarak calibrate ve gpls paketlerini yükleyin.Paketleri yükleyin ve ardından uygun paketleri seçin. Dosya (file) sekmesine tıklayın, ardından dizini değiştir (change directory) komutuna tıklayarak explorer penceresini kullanarak lc pro analiz çıktısına karşılık gelen dizini seçin. Ardından betik (script) penceresine tıklayın ve betiği burada çalıştırmak için tümünü çalıştır (run all) komutuna tıklayın.Bir bazal örnekleme aralığını ve ardından gelen substans P stimüle edilmiş örnekleme aralığını içeren giriş görüntü dizisinin zaman atımlı görüntüleri gri tonlamalı zaman atımlı görüntü dizileri şeklinde gösterilmiştir; bazal ve stimüle edilmiş aralıklar için en iyi lizler lc Pro tarafından oluşturulmuş olup, otomatik olarak konumlandırılmış her bir ROI'den elde edilen zamana bağlı ölçeklendirilmiş yoğunluk eğrileri burada sunulmuştur. Temsili bir deneyden elde edilen hem kontrol hem de substans P stimüle edilmiş olaylar için pik genliği, yarı maksimum süresi ve maksimum uzamsal yayılım histogramları, lc Pro'dan gelen çıktıyı grafiksel olarak işlemek için R kullanılarak oluşturulmuştur.Özellikle substans P stimülasyonu olay sayısını artırmış ve Mann-Whitney U testi ile medyan amplitüd ve sürede anlamlı bir sağa kaymaya neden olmuştur. Bu prosedür uygulanırken, odak düzlemi hareketi veya yanlış kontrast ayarları nedeniyle oluşabilecek görüntü artefaktlarını en aza indirgemek önemlidir; çünkü bu durum analiz çıktılarını önemli ölçüde etkileyebilir.

automated-analysis-of-dynamic-ca2-signals-in-image-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yüksek çözünürlüklü Ca Detayları...

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Kardiyak miyozitlerde, boru şeklindeki zar yapıları hücre içi ağları oluştururlar. Biz kalite kontrol, devlet-sanat-floresan mikroskop için ii) canlı hücre boyama dahil fare kalbinden miyositlerin i) izolasyonu için protokolleri optimize tanımlıyor, ve iii) doğrudan görüntü analizi bileşen karmaşıklığı ve hücre içi membran plastisite ölçmek için ağlar.

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Onlar yaşayan hücrelerden salgılanan gibi biz tek etiketlenmemiş proteinler gerçek zamanlı Optik algılama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çeşitli farklı biyolojik sistemleri ve yapılandırmaları için uygulanabilir dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi dayanmaktadır.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri2 + yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Bu protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Bu teknikler duvar hücresi fizyolojisi çalışmaları için yararlıdır ve herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini araştırmak için uyarlanabilir.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

TrackMate Kalsiyum Görüntüleme Analizi (TACI), z eksenindeki hareketi inceleyen ve bir hücrenin yoğunluğunu karşılık gelen zaman noktasında temsil etmek için her z-yığınının maksimum değerini tanımlayan 3D kalsiyum görüntüleme analizi için açık kaynaklı bir ImageJ eklentisidir. Yanal (x / y) yönde üst üste binen nöronları, ancak farklı z-düzlemlerinde ayırabilir.

TACI: 3D Kalsiyum Görüntüleme Analizi için Bir ImageJ Eklentisi

Bu protokolde, intrapulmoner venlerde (küçük pulmoner venler veya PV'ler) fizyolojik intraluminal basınçlarda Ca2+ sinyallerinin kaydedilmesi ve analiz edilmesi için yeni bir teknik sunuyoruz. Teknik, küçük PV'lerin izole edilmesini, bunların bir Ca2+ göstergesi ile inkübe edilmesini, kanüle edilmesini ve basınçlandırılmasını, Ca2 + sinyallerinin konfokal görüntülemesini ve veri analizini içerir.

Fizyolojik intraluminal basınçlarda küçük pulmoner venlerde Ca2+ sinyallerinin görüntülenmesi

Bu raporda, ışıkla sertleşen diş reçine elektrotlar veya kronik deneylerde mikrodiyaliz probları montaj tabanı için yeni bir uygulama öneriyorum. Bu malzeme, kafatası doğrudan yapıştırma sağlar.

Kronik Deneyleri Montaj Elektrotlar veya mikrodiyaliz Problar Işık tedavi Diş Yapıştırıcı Reçine Uygulama

Öğrenin, domuz koroner arterlerinde endotel kalsiyum aktivitesini otomatik ROI analizi ile incelemeyi. Bu yöntem, kullanıcı hatasını azaltarak kardiyovasküler fizyoloji araştırmalarında güvenilir veri sağlar.

Dinamik Ca Otomatik Analizi

Daha fazla video keşfet