Name: QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Öğrenin, formalinle sabit parafin-gömülü gastrointestinal biyopsi dokularından sitomegalovirüs DNA'sını qPCR ile hassas bir şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, belirsiz boyama sonuçlarında güvenilir tanı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz rakamlar hazırlanmasında emekleri için bu yazının hazırlanması ile ona yardım için Amy Thomasson ve Fredrik Skarstedt ve Ryan Christy kabul.

Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, elektronik laboratuvar veritabanı arama gastrointestinal (CMV) enfeksiyonu vakalarının histopatolojik tanı (GI) biyopsiler (hematoksilen temsil eden (FFPE) bloklar ve gömülü formalin fikse, parafin belirlemek için yapıldı eozin (H &amp; E) ve / veya immünohistokimya (IHC)). FFPE GI Biyopsi Doku 1. Doku İşleme <ol><li> Sitomegalovirüs (CMV) için FFPE GI biyopsi doku blokları toplayın kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR). Bu bloklar, oda sıcaklığında saklanır. </li><li> Bloğun benzersiz kimlik numarası ile Pre-etiket 1.7 ml mikrofuj tüpler. </li><li> Mikrotom çarkını kilitleyin. </li><li> Kaset kıskaç içine doku blok koltuk. </li><li> Taze, kullanılmamış bir bıçak kullanarak, mikrotom üzerinde bıçak açısına blok hizalayın. </li><li> 10 mikron kalınlığında bölümleri kesmek için mikrotomu ayarlayın. </li><li> Th kilidinie çarkı ve avans bıçağın doğru bloğu. </li><li> Her kesim bir doku kaydırma içine rulo sağlayan, 10 mikron kalınlığında aralıklarla bloğunun 5 bölümleri kesmek. Her kaydırma istenen biyopsi dokularının yeterli gösterimini içeren emin olun. </li><li> Mikrotom çarkını kilitleyin. </li><li> Forseps ile, sadece çapraz kirlenme riskini azaltmak amacıyla, parafin ile kaydırma işlemek için dikkatli olmak, önceden etiketlenmiş bir santrifüj tüpü içine doku tüm 5 kayar yerleştirin. Tüp kapağı ek ve rafa geri yerleştirin. </li><li> Mikrotom gelen doku bloğu çıkarın. </li><li> Çıkarın ve bıçak atın. </li><li> Önceki doku ile temas etmiş olabilecek yüzeyleri veya araçları dekontamine. </li><li> Bıçak tutucu içine taze, kullanılmamış bıçağı yerleştirin. </li><li> Tekrar işlenecek her bir ek blok için 1,4-1,14 adımları tekrarlayın. Doku kayar ihtiva mikrofüj tüpler tim kadar oda sıcaklığında saklanabilirDNA ekstraksiyon e. </li></ol> FFPE GI Biyopsi Doku Scrolls 2. DNA Ekstraksiyon NOT: Bu protokol FFPE doku DNA ekstraksiyon kiti (: Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) bakın DİKKAT) ve prospektüste uyarlanmıştır. <ol><li> Her bir numune, bir mikrofüj tüpüne 1 ml ksilen (MGVS&#39;de Bakınız DİKKAT) ekleyin. Kuvvetli bir şekilde 10 saniye için kapak ve girdap kapatın. </li><li> Spesifik olarak şu değişiklikler ile üreticinin ürün ekin özetlenen DNA ekstraksiyonu ile devam edin. </li><li> İlk olarak, her bir mikrofüj tüpüne, dahili kontrol (IC) 6 ul ekleyin. <ol><li> 1 saat boyunca 56 ° C&#39;de ATL / proteinaz K liziz inkübasyondan sonra, 1 saat süre ile, 30 dakika boyunca 99 ° C &#39;de yerine, 90 ° C inkübe edin. </li><li> Nihai DNA elüsyon adımı sırasında dikkatli bir DNA saflaştırma kolonunun kapağı açın ve oldukça Buffe göre, zarın merkezi 50 ul damıtılmış DNAse / RNAse içermeyen su uygulamakr ATE. NOT: Uygun depolama ve reaktiflerin hazırlanması için paket içeriğine bakınız. DNA Tüm 5 FFPE verilirse elde edilmelidir. Oda sıcaklığında (15-25 ° C) tüm santrifüj adımları uygulayın. </li></ol></li></ol> CMV 3. QPCR <ol><li> Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Prosedür <ol><li> CMV tahlil çalıştırmak için bir Excel çalışma sayfası PCR oluşturun. Bu Excel çalışma sayfası Mg ile ana karışımı telafi etmek için gerekli her reaktif toplam miktarını hesaplar. Bu örnek başına ihtiyaç duyulan her reaktif miktarını (aşağıda listelenen) kez örneklerin ve kontrollerin sayısı artı çarpar biri (nedeniyle pipetle için kaybını telafi etmek için). <ol><li> Miktarında, her PCR reaksiyonunda aşağıdaki reaktifler belirtilen şunlardır: Reaktif0; Örnek başına miktar CMV LC usta karışımı flakon 12.5 ul Mg Çözüm sarı flakon 2.5 ul Toplam hacmi 15.0 ul </li></ol></li><li> , Bir su ya da hedefsiz kontrol (NTC), negatif kontrol, düşük bir pozitif kontrol, yüksek bir pozitif kontrol ve QS3 veya QS4 ya da, ve hasta numuneleri, her deneyde dahil çalıştırın. Kapilerler bu sırayla kurmak olmalıdır. </li><li> 4 ° C&#39;de saklanan gerçek zamanlı PCR alet için soğutma bloğu spesifik elde edilir Soğutma bloğu içinde uygun kılcal tüpler yerleştirin. Kılcal tüplerin yüzeyine dokunmayın. Kılcal damarları tutarken daima eldiven kullanın. </li><li> Amplifikasyon üretimi ile kontamine olmayan temiz bir başlık tüm polimeraz zincir reaksiyonları kurmakts. <ol><li> Tüm hasta örnekleri, artı 5 kontrolleri test etmek için PCR kiti usta şişeleri doğru sayısını çıkarın. Let ana flakon, Mg çözüm ve soğutma bloğuna PCR sınıf su çözülme. Her bir ana şişe 12 testler için yeterince reaktif madde içerir. </li><li> Yavaşça ana şişeleri vorteks ve hızlı maksimum hızda santrifüj bunları dönerler. </li><li> Bir şişenin içine her ana flakon içeriğini birleştirin ve yavaşça tekrar vorteks. </li><li> Tek bir steril mikrofüj tüpü içine PCR çalışma sayfasına belirtilen miktarlarda ana karışımı ve Mg solüsyonu birleştirin. </li><li> Kantitasyonu standart (QS) için olan konum 5 kılcal dışında, her bir kılcal tüp içine yavaşça ve kısım Mg ile ana karışımı 15 ul karıştırın. </li></ol></li><li> Temiz başlık bir işleme kaput Mg ile kılcal boru ve ana karışımı içeren soğutma bloğunu taşımak. </li><li> Master kalan 30 ul iç kontrolün 2 ul (IC) EkleMg ile karıştırın. 5. pozisyondaki kılcal (QS için konum) içine yavaşça ve 15 ul alikot karıştırın. </li><li> Su pipetle 10 ul, uygun bir kılcal tüp içine DNA, ya da örnek DNA kontrol eder. Kapatma aracını kullanarak kılcal tüpler Cap. </li><li> Real-time PCR enstrüman blok / örnekleri soğutma atın. </li></ol></li><li> Real-time PCR enstrüman programı (bkz. Tablo 1) </li><li> Amplifikasyonu ve saptanması, gerçek zamanlı PCR cihazı üzerinde gerçekleştirilen <ol><li> Bilgisayarda oturum </li><li> Çift alet simgesine tıklayın ve yazılımı içine giriş. </li><li> Real-time PCR aleti açın </li><li> Ön ekrandan &quot;CMV / EBV&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Makro Sihirbazın istemleri izleyin. </li><li> Yazılımı tarafından istendiğinde bir self-test çalıştırmak için kutusunu seçin. A self-test Cihaz kullanımdayken her gün bir defa yapılmalıdır. </li><li> Run Ad. </li><li> Üst LEF bulunan örnek sayısını ayarlayınkontrol ve hasta toplamına sayfanın t köşe vadede dahildir ve her hasta numunesi kimlik numarasını girin. </li><li> &quot;Abs Quant&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Numune türü&quot; altında, standart için uygun örnek türü atayabilirsiniz. </li><li> Sayımıdır standart (QS) için beklenen konsantrasyonlarda yazın. </li><li> Soğutucu bloğundan kılcal tüpleri çıkarın ve (blok örnek # 1 soğutma, vb atlıkarınca pozisyon # 1 yerleştirilmelidir) atlıkarınca karşılık gelen konuma yerleştirin. </li><li> Cihazın santrifüj ve basın başlangıç ​​içine atlıkarınca yerleştirin. </li><li> Santrifüj açın ve atlıkarınca çıkarın. </li><li> Real-time PCR aracı haline atlıkarınca yerleştirin. Kapağı kapatın. </li><li> Basın &quot;Başlat Çalıştır&quot;. </li><li> Gerçek-zamanlı PCR cihazı, bir numune için her pozisyonunu kontrol eder. Bu onay tamamlanana kadar uzak cihazdan değil yürümek, ESPEkılcalların bir atlıkarınca değilse likle. Cihaz, bu not ve çalışma devam edecek olup olmadığını soracaktır. Ayrılmadan önce evet cevabı. </li><li> Çalışma tamamlandıktan sonra, oluşturulan raporu kapatın. </li><li> &quot;Mutlak Nicel&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Sonraki Color Tazminat için oka tıklayın. </li><li> Açılan kutudan &quot;Renk Seç Tazminat&quot; tıklayın. </li><li> Vadede uygulamak için en güncel renk telafisi dosyayı seçin. </li><li> Kutusu açılır, Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Standart Eğrisi tarafından oka tıklayın. </li><li> Açılan menüden &quot;dış kullanın&quot; seçeneğini seçin. </li><li> En güncel dış standart eğri dosyayı seçin, ardından Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Bir konsantrasyon atanırsa eğrileri, mevcut ve düz değil çizgi emin olmak için mutlak miktarının menüsü altında her eğri bak. 705/Back 530 Mutlak miktarının otomatik olarak analiz edilir. </li></ol></li><li> Quality kontrolü <ol><li> Daha sık hangisi belirteçlerin yeni bir lot numarası alındığında, yeni bir standart eğri, ya da her altı ayda bir, üretir. </li><li> Mg ile ana karıştırmak için her bir standart 10 ul ekleyin. Daha önce çıkarılan DNA gibi kiti ile birlikte standartları düşünün. </li><li> Mg doğru sayılmasını sağlamak için standart bir eğri oluşturmak için kullanılan ile ana karışımı, her bir standart için iç kontrol 1 ul ekle. Hayır Şablon Kontrolü (NTC) için Mg ile ana karışımı IC katmayın. </li><li> 16 veri noktası olarak toplam bir NTC ve kantitasyonu Standartlar QS 4, 3, 2, 1 ve standart eğri oluşturmak üzere çalıştırmak için QS4 bir 1:10 seyreltme üç suret hazırlayın. </li><li> Tekrarlanan standartları için açılır menüden of &quot;tekerrür&quot; seçiniz </li><li> Kanal 530/back hiçbiri seçin ve çalıştırmak analiz ederken renk tazminat açmak, </li><li> &quot;(Run) Standart Eğri&quot; altında &quot;seçeneğini ex olarak kaydetmekdahili &quot;ve eğri isim. Kaydederken &quot;standart eğri olarak uygulanır&quot; açıklama girin. </li><li> Sonuçlarını grafik. Elde edilen doğrusallık katsayısı 0,81 ≥ gerekir. </li><li> Günlük ishal için, vadede bir kontrol olarak QS3 veya QS4 bir kopyasını içerir. Mevcut dış standart eğri analiz aşamasında vadede ithal edilebilir. </li><li> Run Kontroller: hayır DNA kontrol, negatif kontrol, düşük ve yüksek pozitif kontroller. Beklenen viral yük belirlenir ve her satıcı ve çok sayıda ayarlanır. </li><li> Her bir örnek için bir IC ekleyin ve DNA ekstraksiyon sırasında kontrol eder. </li><li> Denetimlerden herhangi aralığının dışında düşersen, kabul edilemez sonuçları kaydetmek ve sorun giderme için tahlil bakın. </li></ol></li><li> Kontrol sıklığı <ol><li> Bir NTC, negatif, düşük pozitif, pozitif, yüksek ve standart kontrol: Her vadede içerir. </li></ol></li></ol> NOT: kontroller için kabul edilebilir sınırlar. Resim tepe noktaları dikkat edilmelidirherhangi bir şablon (NTC) ve negatif kontroller için d. Peaks 530 kanalda bulunması gereken ve beklenen viral yükler belirlenir ve düşük ve yüksek pozitif kontroller için her satıcı ve çok sayıda ayarlanır.

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
<li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+%28CMV%29+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li>
<li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+%3A+the+journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li>
<li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li>
<li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded%2C+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li>
<li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li>
<li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li>
<li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li>
<li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li>
<li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection%3A+prognostic+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li>
<li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Pek çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü, moleküler viremi deneyleri, biyopsi histolojisi ve, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi son gösterildiği gibi, moleküler deneyleri de dahil olmak üzere sitomegalovirüs tanısında (CMV) enfeksiyonu için kullanılabilir doku 5,6. Seroloji, tanı bir dayanak kez, sadece güvenilir bir pozlama belirler ve akut CMV enfeksiyonu 7 ile iyi bir korelasyon yoktur. Geleneksel ve erken antijene kabuk şişe hem de Viral kültür, ikinci ...

Klinik örneklerde sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu yorumlanması önem taşımaktadır. CMV herpesvirüslerinin betaherpesvirinae alt familyasının bir üyesidir. Diğer herpes virüsleri benzer şekilde, CMV, aktif viral replikasyon 1 eksikliği ile karakterize edilen bir biçimde ya da latent enfeksiyon kurma yeteneğine sahiptir. Virüsün reaktivasyonu hastalık belirtileri 2-4 eşlik edilebilir virionu salınımıyla karakterize aktif viral replikasyon, yol, stres veya diğer immünosupresyonun dönemlerinde oluşabilir. Gastrointestinal (GI) CMV hastalığı belirtileri sık sık karın ağrısı ve / veya kanlı dışkı 1 içerir. Histoloji CMV gastroenterit tanısı hematoksilen ve CMV viral kapanımlar tespit etmek eozin (H &amp; E) kullanır. Klinik şüphe yüksek henüz belirgin kalıntılar görülmektedir durumlarda, immünhistokimyasal (İHK) sık sık bir yardımcı bir test yöntemi olarak kullanılmaktadır. Ancak, İHKAyrıca yorumlanması zor (Şekil 2) 5 yapma, nadir klasik olmayan görünen hücresel boyanma (şüpheli) engel olabilir. Bu formalin fikse, parafine gömülü (FFPE) GI biyopsi dokusu ve GI biyopsi CMV&#39;nin algılamak için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) çıkarılan DNA kullanmak için aranan oldu. Bu teknik, GI biyopsilerinde CMV saptanmasında önemli olduğu gösterilmiştir ve şüpheli IHC boyama durumlarda 5,6 özellikle yararlıdır edilmiştir. Ayrıca, qPCR da 6 uygun olduğunda ek klinik CMV test verileri ile iyi bir korelasyon olduğu gösterilmiştir. CMV tespit QPCR kullanımı CMV için klinik şüphe yüksek olduğu durumlarda erken tanı ve tedaviye yol açabilir, fakat H &amp; E ve CMV İHK olumsuzdur.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml Mikrofüj tüpleri</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Tırtıklı forseps</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>62086-1S</td><td>Mikro Forseps MF-1</td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüjler (mikrofüj)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 galon</td></tr><tr><td>Etanol Fisher</td><td>Fisher</td><td>Scientific: ET108</td><td>%96-100 </td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Doku Kiti</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR Takviye Kiti</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler santrifüj</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Soğutma Bloğu</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>LightCycler Kapatma Aleti</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>Renk Dengeleme Kiti</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l Kılcal</td><td>damarlar Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Bıçaklar</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge düşük profilli</td></tr></tbody></table>

qpcr formalinle sabit, parafin-gömülü biyopsi doku sitomegaloviral dna tespiti için bir hassas ve hızlı yöntem mi

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Bu şiddetli enfeksiyon geliştirmek için onların daha fazla risk göz önüne alındığında, gastrointestinal (Gİ) bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda yolu sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu tespit etmek çok önemlidir. CMV enfeksiyonu tespiti için çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü ve moleküler yöntemler de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Genellikle, bu yöntemler CMV ile sistemik ilişkisini yansıtır ve özellikle lokal doku tutulumu tespit yok. Bu nedenle, GI bölgesindeki CMV enfeksiyonu tespiti sıklıkla biyopsi dokusu, geleneksel histoloji ile yapılır. Immünohistokimyasal (İHK) ile birlikte hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyama Bu biyopsilerin incelenmesi dayanaklarını kalmıştır. H &amp; E ve İHK bazen yorumlama zorlaştırır, atipik (şüpheli) boyanma sonuçlanabilir. Bu CMV kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) başarılı bir şekilde çok için formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi dokusu üzerinde gerçekleştirilebilir gösterilmiştiryüksek duyarlılık ve özgüllük. Bu protokolün amacı, bir klinik laboratuvar ortamında FFPE biyopsi dokusunda CMV tespiti için qPCR testleri gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. Bu yöntem, GI biyopsilerinde CMV için belirsiz boyanma durumlarda hastalar için büyük bir fayda olması muhtemeldir.

228 doku blok toplam şüpheli CMV İHK ile histoloji ve pozitif immünohistokimyasal (İHK), 18 dayanan 91 sitomegalovirüs (CMV) pozitif olgu oluşuyordu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ve 79 negatif kontroller ile test edildi. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, CMV pozitif vaka tipik viral CMV kusurları (A) ve / veya pozitif boyanma IHC (B) göstermiştir olacaktır. Negatif kontroller hiçbir şüpheli histoloji veya İHK lekeleme 5 göstermiştir olurdu oy...

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü biyopsi dokusunda sitomegalovirüsün qPCR tespitini tanımlar, bu da hızlı, hassas, spesifik ve belirsiz hematoksilen ve eozin veya immünohistokimyasal boyama paternlerini yorumlamak için yararlıdır.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, gastrointestinal biyopsilerde, özellikle geleneksel boyama yöntemleriyle şüpheli sonuç veren biyopsilerde, sitomegalovirüs DNA'sının tespit hassasiyetini artırmaktır. Bu işlem, öncelikle formalinle tespit edilmiş ve parafine gömülmüş gastrointestinal biyopsi dokusunun kesilip rulo şeklinde toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, amplifikasyon için doku rulolarından DNA ekstre edilir.Kullanılan spesifik primerler, sitomegalovirüs DNA'sını seçici olarak amplifiye eder. Gastrointestinal biyopsi dokusu üzerinde uygulanan konvansiyonel yöntemlerin şüpheli sonuçlar verdiği durumlarda, bu hassas yöntem sitomegalovirüs DNA'sını tespit edebilir. Bu tekniğin hematoksilin, gümüş boyama ve immünohistokimya gibi alandaki diğer yöntemlere göre temel avantajı, lam üzerindeki sınıflandırılamayan boyanma paternlerinin yorumlanmasını gerektirmemesidir. Gastrointestinal biyopsi dokusunun kesimini gösterecek olan kişi laboratuvarda bir histoteknoloji uzmanı olan Zainab van Horn olacak; ayrıca laboratuvardaki nükleik asit ekstraksiyonu ve RT-PCR kurulumu da gösterilecektir.Rebecca Jocelyn Bu protokol için, kırık buz üzerinde bekletilen FFPE GI biyopsi doku bloklarını hazır bulundurun. İlk olarak, mikrotom başında her bir örnek blok için, doku bloğunun tanımlama numarasıyla bir mikro santrifüj tüpünü etiketleyin.El çarkının kilitli olduğundan emin olun ve doku bloğunu kaset kelepçesine yerleştirin. Örnekler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir bıçak kullandığınızdan emin olun. İlk örneğiniz için kullanılmamış bir bıçak kullanmanız büyük önem taşımaktadır.Örnekler arasında başka bir bıçağa geçiş yapın ve örnekler arasında mikrotomu dekontamine edin. Ardından, bloğu bıçak açısına göre hizalayın ve kesit kalınlığını 10 mikron olarak ayarlayın. Şimdi el çarkının kilidini açın ve bloğu bıçağa doğru ilerletin.Her bir kesitin bir doku rulosu şeklinde sarılmasına izin vererek, bloktan 10 micron aralıklarla beş kesit alın. Her bir rulonun, istenen biyopsi dokusunun yeterli bir temsilini içerdiğinden emin olun. Beş rulonun kesimi tamamlandığında, el çarkını kilitleyin.Beş rulo örneği etiketli santrifüj tüpüne aktarırken, pensetin dokuya değil, hızlıca sadece parafine değdiğinden emin olun. Tüpün kapağını kapatın, ardından bir sonraki örnekten ruloları toplamak için bloğu kaset tutucudan çıkarın. İlk olarak, bıçağı çıkarıp atın.Yeni ve kullanılmamış bir bıçak yerleştirmeden önce, önceki örnekle temas etmiş olabilecek tüm yüzeyleri dekontamine edin. Örnekler daha ileri düzeyde işlenene kadar oda sıcaklığında saklanabilir. Aşağıdaki protokol, FFPE doku DNA ekstraksiyon kitinden uyarlanmıştır.İşleme başlamadan önce malzeme güvenlik bilgi formuna danıştığınızdan emin olun. Her bir örnek tüpüne 1 mL ksilen ekleyerek ve ardından bunları 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyerek başlayın. Sonrasında, üretici talimatlarını aşağıdaki modifikasyonlarla uygulayın.İlk olarak, her tüpe altı µL internal kontrol ekleyin. İkinci olarak, 56 °C'de bir saat boyunca gerçekleştirilen proteinaz K lizis inkübasyonunun ardından, örnekleri bir saat boyunca 90 °C'de inkübe etmek yerine 30 dakika boyunca 99 °C'de inkübe edin.Üçüncü olarak, elüsyon adımı tamamlanırken, TE tamponu yerine Elüsyon kolonunun membranının merkezine dikkatlice 50 µL distile DNS ve RNA içermeyen su uygulayın. Son olarak, tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Reaksiyonları, kit kaynaklı amplifikasyon ürünü kontaminasyonlarının bulunmadığı temiz bir çeker ocakta hazırlayın.Örnekler ve beş kontrol için yeterli miktarda ana tüp ve magnezyum çözeltisi çıkarın. Her bir ana tüp, 12 test için yeterli reaktif içerir. Çözündürme işleminin ardından, ana tüpleri vorteksleyin ve maksimum hızda kısa süreliğine santrifüjleyin.Ardından, PCR çalışma sayfasını takip ederek magnezyum çözeltisi ile master mix'i birleştirin. Çözeltileri soğutma bloğuna yerleştirerek pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın. Beşinci konum hariç, soğutma bloğundaki test kapilerlerine karışımdan 15 µL ekleyin.Bu kılcal boru, kantitasyon standardı için ayrılır. Kılcal boruları ve magnezyumlu master mix'i içeren soğutma bloğunu temiz kabinden ayrı bir işlem kabinine taşıyın. Burada, kalan 30 µL master mix'e iki µL iç kontrol ekleyin.Çözeltiyi pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın ve bu karışımdan 15 µL'yi beşinci konumdaki kapilere aktarın. Ardından, uygun bölmeye 10 µL su kontrol DNA'sı veya örnek DNA ekleyin. Yükleme tamamlandığında, kapiler santrifüjdeki kapama aracını kullanarak kapillerin kapaklarını kapatın.Kılcalları soğutma bloğundan döner rafın ilgili konumuna aktarın. Ardından döner rafı santrifüje yerleştirin ve santrifüj döngüsünü çalıştırın. Döner rafı gerçek zamanlı PCR cihazına aktarın ve reaksiyonu daha sonra analiz sırasında gerçekleştirin.Kantifikasyonlar yapabilmek için bir eğrinin mevcut olduğundan emin olmak adına verileri mutlak kantifikasyon kullanarak görüntüleyin; toplam 228 doku bloğu qPCR ile test edilmiştir. Bloklar, histoloji ve pozitif immünohistokimyaya dayanarak CMV pozitif vakalardır.18 blok şüpheli C-M-V-I-H-C sonucuna sahipti. Diğer 79 blok ise negatif kontrollerdi. CMV pozitif vakalar gösterilmiştir.Tipik CMV viral inklüzyonları ve pozitif IHC boyanması veya bu ikisinden en az biri. Şüpheli vakalar nadir, sınıf dışı boyanma paternleri sergilerken, negatif kontrollerde şüpheli bir histoloji veya IHC boyanması görülmemiştir; CMV için pozitif olan 88 dokunun 91'i test edilmiştir. Negatif kontrol olan 71 örneğin bir tanesi, QPCR ile CMV için pozitif test edilmiştir.A. Şüpheli C-M-V-I-H-C boyamalarına sahip biyopsilerle ilgili tartışma metin protokolünde sunulmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, formaline sabitlenmiş parafin gömülü Gİ biyopsi dokusundan DNA ekstraksiyonunun nasıl gerçekleştirileceği ve ardından gerçek zamanlı PCR ile sitomegalovirüs DNA'sının nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, MCPyV viryonları ile enfekte olmuş hücreler, MCPyV'ye özgü genomları tespit etmek için in situ hibridizasyon zincir reaksiyonuna tabi tutuldu. Ayrıca, DNA-HCR tekniği, enfekte insan derisi hücrelerinde MCPyV DNA'sını görselleştirmek için FISH ile birleştirildi.

HCR-DNA FISH: Enfekte Hücrelerde Viral DNA'yı Tespit Etmek için Bir Floresan In Situ Hibridizasyon Tekniği

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Sentetik Maya Genom projesi, Sc2.0'ın tasarımcı kromozomları, varlık/yokluk uç noktasına sahip PCRTagging adı verilen PCR tabanlı bir genotipleme testi kullanılarak doğal muadillerinden ayırt edilebilir. Burada, PCRTag genotiplemesi için yüksek verimli bir gerçek zamanlı PCR tespit yöntemini açıklıyoruz.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

Dijital polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Tek nükleotid türevleri ve DNA kopyalama numara türevleri yüksek-duyarlı tespiti için yararlı bir araçtır. Burada, biz insan genomu digital PCR ile tüp içinde çip biçimini kullanarak nadir versiyonlarında ölçmek için kritik noktalar göstermek.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile birlikte gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu analiz RNA virüs enfeksiyonları düzeyini ölçmek için yaygın olarak kullanılmış. Burada dang virüs dahil olmak üzere birkaç RNA virüsleri miktar için geliştirilen bir RNA arıtma adım gerekli değildir doğrudan bir RT-qPCR tahlil mevcut.

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Kas hasarı altta yatan mekanizmaların belirlenmesi çok önemlidir. Burada parafine gömülü ve Drosophila torasik kasları bölümleri dondurulmuş hazırlamak için histolojik teknik sunuyoruz. Bu kas morfoloji ve protein ve diğer kas hücre bileşenleri lokalizasyonu analizi sağlar.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

Öğrenin, formalinle sabit parafin-gömülü gastrointestinal biyopsi dokularından sitomegalovirüs DNA'sını qPCR ile hassas bir şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, belirsiz boyama sonuçlarında güvenilir tanı sağlar.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

Daha fazla video keşfet