Name: Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerden mühendislik sinir dokuları için elektrospun poli(gliserol-dodekanoat) fibröz iskeleleri üretme yöntemini. Bu biyobozunur polimer hücre büyümesini destekler ve doku mühendisliği uygulamaları için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Florida Uluslararası Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü imkanları kullanılarak yapılmıştır.

1.. Elektrospinning Toplayıcı Kur <ol><li> Dikdörtgen bir parça halinde alüminyum folyo kesilir. </li><li> Dikdörtgen bir şerit içine dikdörtgen parça katlayın, ve bant ile düz metal plaka (Şekil 1) dik takın. Not: fiber mat boyutu, şeridin uzunluğu ve genişliğine bağlıdır. Gerektiğinde Bu nedenle, şerit boyutlar ayarlanabilir. </li></ol> 2.. Polimer çözeltisinden Preparasyon <ol><li> PGD ​​polimerin elde edilmesi için 100 saat boyunca 120 ° C de bir çanak içinde 1:1 mol oranında, gliserol ve dodekandioik asit (DDA) karıştırın. </li><li> Bir 15 ml tüp içinde 1.5:3:95.5 bir ağırlık oranında olan etanol içinde% 65 poli (etilen oksit) (PEO) ve jelatin çözülür, kapağını sıkmak ve karıştırma ile 1 saat boyunca 60 ° C&#39;de bir fırın içinde karışımın ısısının Bir homojen çözelti (Basal çözelti) kadar ısıtılır. </li><li> Elektrospinning için, PGD polimer ve 04:06 ağırlık oranında bazal solüsyon karıştırın. Not: PGT konsantrasyonunun bi varg lif çapına etkisi. % 30 -50 oranında% PGD daha artan lif çapları 5 cm&#39;den elyafların üretilmesi için kabul edilebilir. </li><li> Polimer çözeltisine% 0.1 riboflavin ekleyin ve iyice karıştırın. </li></ol> 3. Elektrospinning <ol><li> Bir 18 G ile bir 5 ml şırıngaya standart polimer çözeltisi Besleme paslanmaz çelik bir iğne köreltilmiş. </li><li> Bir şırınga pompası içine şırınga yerleştirin. </li><li> Metal plaka ve iğne için, pozitif yüklü kurşun için yüksek voltajlı güç kaynağının topraklı kurşun takın. </li><li> 15 cm İğne ve alüminyum folyo şeridi arasındaki mesafe ayarlayın. </li><li> Şeridin ön liflerin birarada toplanmasını önlemek üzere yatay ile yaklaşık 15 ° &#39;lik bir açıda şırınga pompası yerleştirin. </li><li> Şırınga pompası açın ve 0.6 ml / saat için pompa akış hızını ayarlayın. </li><li> Yüksek gerilim güç kaynağı açın ve 14.6 kV işletme gerilimi ayarlayın. </li></ol> 4.Fiber İşleme <ol><li> Toplama işlemi tamamlandıktan sonra, çapraz bağlama için 60 dakika boyunca UV ışığına maruz fiber mat. </li><li> Bir 100 mm Petri kabı alüminyum folyo şeritten elyaf mat transferi, ve sterilizasyon için 20 dakika için, UV ışığına maruz kalmaktadır. </li><li> Bir biyo-güvenlik kabini, bir cerrahi bıçak ile aynı büyüklükte yuvarlak parçalar halinde kesilmiş ve fiber mat, bir 24-yuvalı plaka içine parçaları yerleştirin. </li><li> Hücre ön tohum tedavisi için, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 ml fiber örnekleri bırakın ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, aspirat PBS dikkatli bir şekilde, her bir oyuğa (Malzemeler tabloda tarif bakınız) farklılaştırma ortamının 1 ml (DMEM/F12, N2 ve FGF2) ekleyin ve 3 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Aspire farklılaşma ortam dikkatlice, her elyaf numunesi için 0.2 ml Matrigel ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Laminin da elyaf kaplama için kullanılabilir. 20 ug / ml laminin 0.2 ml ilave edilirElyafa ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Dikkatle her kuyudan aşırı Matrigel kaldırın. Bir kez farklılaştırma ortamının 2 ml ile durulayın. Not: Elyaf örnekleri, hücre kültürü için hazırdır. </li></ol> Elyaf üzerinde 5. Hücre Serpilmesi <ol><li> MES hücre kültürü tabağına Accutase 1 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe </li><li> 10 dakika sonra, MES hücreler kültür kaplarına ayrılır. Plakasına farklılaştırma ortamının 4 ml ekleyin. Koloniler (yaklaşık 15x) kırmak için yukarı ve aşağı bir 15 ml tüp ve pipet hücrelerin içine yüzen MES hücreleri toplamak. </li><li> Farklılaştırma ortamının 4 ml 5 dakika ve yeniden askıya hücreleri için 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bir 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu 200 ul ve farklılaşma transfer ortam maddesi ile o 10x seyreltin. Yerine bir kapak-slip ile hemasitometre üzerinde bir bölmeye seyreltilmiş hücre süspansiyonu 15 ul aktarın. Saymak1 mm merkez meydanı ve mikroskop altında hemasitometre dört köşe kareler hücreler. Not: ml seyreltme faktörü x 10 4 x kare başına ortalama sayısı = Hücre başına </li><li> Her bir kuyunun üzerine yaklaşık 5 x 10 4 MES hücreleri yerleştirin. Yavaş yavaş lifli keçe kapalı boşalmasını önlemek için bir çözüm yerine, kuyunun tarafına kapalı kayma, elyaf numunelerinin üzerine orta hücre süspansiyonu bırakın. </li><li> Her bir oyuğa farklılaştırma ortamının 1 ml ilave edilir, ve 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde tutmak ve plaka% 5 CO2 hücreleri bağlanma, büyümesini ve farklılaşmasını sağlamak için. </li><li> Her bir oyuktan aspire edin ve eski orta her gün taze farklılaştırma ortamının 1 ml&#39;si ile değiştirin. </li></ol> 6.. Hücre Canlılık <ol><li> Her kuyudan aspire eski orta. </li><li> Kültür ortamı ile Resazurin floresan reaktifi 1/10 hacim th karıştırın ve de her biri 1 ml. </li><li> Inkubasyon37 ° C ve direkt ışıktan korunan 4 saat için% 5 CO2 yedi. </li><li> 4 saat sonra, 96 oyuklu bir plakaya her bir ikinci reaktifi 100 ul 3x transferi ve daha sonra numuneler 560EX nm/590EM filtre ayarları kullanarak bir floresan spektrofotometre üzerinde ölçüldü hazırdır. </li></ol> 7. Real Time PCR <ol><li> Kültür 14 gün sonra, numunelere lizis tampon eklemek ve elyaf numuneleri üzerinde hücrelerden toplam RNA&#39;nın izole edilmesi. </li><li> Ters transkripsiyon ile 20 ul reaksiyon ölçeklerde cDNA&#39;yı sentezlemek için toplam RNA 4 ul kullanın. </li><li> 10 ul ana karışım (2x), 0.2 ul boya, 8 ul nükleaz içermeyen su, 1 ul cDNA, 1 ul primer (Bu çalışmada kullanılan primerler Tablo 1 &#39;de listelenmiştir): her bir optik tüp içinde PCR reaksiyon karışımı hazırlandı. </li><li> Bir: PCR programı kurmak. 95 ° C 2:20 min, 1 döngüsü b. 95 ° C 3 sn → 60 ° C 1 dakika, 40 döngü, c. 95 ° C 15 sn, 1 döngüsü d. 60 ° C 1dak, 1 döngü e. 95 ° C 15 saniye, 1 döngü. Göreceli gen ekspresyon düzeylerinin karşılaştırmalı C T yöntemi seçin. </li><li> PCR tamamlandıktan sonra, StepOne yazılımı ile gerçek-zamanlı PCR sonuçlarını analiz ve Excel sonuçları ihracat. </li></ol>

<ol><li>Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28glycerol-dodecanoate%29%2C+a+biodegradable+polyester+for+medical+devices+and+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tough+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A tough biodegradable elastomer.</a> Nature biotechnology. 20, 602-606 (2002).</li>
<li>Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approximate+linear+confidence+and+curvature+of+a+kinetic+model+of+dodecanedioic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+And+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+preparing+electrospun+nanofibers%3A+designing+an+electrospinning+process+for+nanofiber+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Internationa+l%22%5BJournal%5D)">Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication.</a> Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).</li>
<li>Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+technology%3A+designing+the+next+generation+of+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds.</a> Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).</li>
<li>Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+scaffolds%3A+production%2C+characterization%2C+and+applications+for+tissue+engineering+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review.</a> Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).</li>
<li>Lim, S. H., Mao, H. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for stem cell engineering.</a> Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).</li>
<li>Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter%2C+pore+size+and+seeding+method+on+growth+of+human+dermal+fibroblasts+in+electrospun+poly+%28epsilon-caprolactone%29+fibrous+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats.</a> Biomaterials. 31, 491-504 (2010).</li>
<li>Tillman, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+stability+of+electrospun+polycaprolactone-collagen+scaffolds+in+vascular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction.</a> Biomaterials. 30, 583-588 (2009).</li>
<li>Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayered+scaffold+for+engineering+cellularized+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels.</a> Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).</li>
<li>McCullen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+collagen+polymerization+of+layered+cell-seeded+electrospun+scaffolds+for+bone+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Basit koleksiyoncular veya şu anda bazı uygulamalar için istenilen uzunluğa ve fiber mat boyutunu elde kısıtlamayı arttırır elektroeğirme için kullanılan toplayıcıları dönen karmaşıklığı sınırlamalar. Buna ek olarak, kültür çanağı ya da başka alt-tabakalar için, zemin toplayıcı elyafların aktarımı bir meydan okuma 5&#39;tir. Bu raporda, topraklı toplayıcı bir alüminyum folyo şeridi takılarak sadece yapılan yeni tasarlanmış koleksiyoncu, bir defada 20 cm 10 cm büyük boy fiber paspaslar kadar almayı başardı. <s...

Elektrospinning mikro-to-nanometre boyutlu yapı iskelesi fiber üretmek için etkili bir işlem yöntemlerden biridir. Elektrospinning temel prensibi iğnenin ucu ve bir kolektörü topraklanmış arasında yüksek voltaj uygulayarak bir iğne deliğinin tutulduğu bir solüsyon Taylor koni içerir. Çözelti içindeki elektrostatik itme yüzey gerilimini aştığında, yüklü bir sıvı jet iğne ucu dışarı atılır, çözücü buharlaştırma ile havada hareket ve son olarak topraklı toplayıcı üzerine yatırılır. Şırınga pompası, püskürtme memesinden çıkan sürekli bir solüsyon akışı sağlar ve electrospun elyafların bu şekilde birden fazla kopyası kısa bir süre içinde imal edilebilir. Toplayıcı varmak için meme çıkış seyri sırasında yüklü jet polimer çözeltisinin viskozite ve yüzey gerilimi içerir parametreleri, electrostati bir dizi uygun olarak uzanan ve çırpma uğrayacakc çözelti içinde kuvvet ve dış elektrik alanının etkileşimi, vb 2.. Elektro işleminde, toplayıcı mikro-to-nanometre lifler biriktirilen bir iletken alt-tabaka olarak hizmet eder. Bu çalışmada, fiber toplayıcı yeni bir tür arzu edilen boyutu (uzunluk x genişlik) olan bir lif elde etmek için paspaslar tasarlanmıştır. Geleneksel olarak, alüminyum folyo, bir toplayıcı olarak kullanılan ama başka bir alt-tabaka için, düz bir yüzeye lifleri transfer etmek güçtür. Geleneksel toplayıcı sağlam bir fiber mat hasat zorluğu nedeniyle electrospun lifler toplayıcı yüzeyine güçlü bir şekilde bağlamak olmasından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, dikdörtgen bir şerit halinde bir alüminyum folyo parçası katlanır ve düz metal plakasına dikey takarak toplayıcı değiştirilebilir. Electrospun lifler şeridin ucu ve kolay bir substratı transfer edilebilir metal plaka arasındaki alanı boyunca gerilire. Termal çapraz elastomerik polimerlerde ilgi hızla çünkü poli (gliserol sebasat) (PGS), 2002 3 vulkanize kauçuk benzer. PGS benzer bir polyester tanıttı Robert Langer grubunun öncü çalışmalar büyüyen, başarıyla geliştirdik edilir poli (gliserol-dodekanoat) (PGD) gliserol ve dodekandioik asitin termal yoğunlaşması ile ve eşsiz şekil hafıza özelliğine 1. gösterdi. Sert sentetik malzemeler, poli (hidroksi bütirat) ya da poli (L-laktid) (sırasıyla, 250 Mpa ve 660 MPa arasında Young modülleri) farklı olarak, PGD, sıcaklık 37 ° üzerinde 1.08 MPa arasında bir Young modülüne sahip, kauçuk gibi elastomer cinsi bir özellik arzetmektedir in-situ periferik sinir (0.45 MPa) yakın bir maç olduğunu C,. Ek olarak, PGD biyolojik olarak parçalanabilir ve bozunma süresi gliserol ve dodekandioik asit oranının değiştirilmesiyle ince ayarlı olabilir. Dodekandioik asit oniki-karbon subiki terminal karboksilik gruplar, HOOC (CH2) 10 COOH ile duruş. Sebasik asit ve dodekandioik asit gibi dikarbonik asitler, çift sayılı bir asetil CoA-ve trikarboksilik asit (TCA) / (sitrik asit) döngüsü girmek için metabolize edilebilir. Dikarboksilik asitlerin metabolik ürünü, süksinil-CoA, bir ön-madde gluconeogenetic ve TCA döngüsü 4 arasında bir ara üründür. Bu nedenle, bazı çalışmalar özellikle patolojik koşullarda enteral ve parenteral beslenme için bir alternatif yakıt alt-tabaka olarak kullanılabilir önerdi. Cam geçiş sıcaklığı 31 ° C olduğu için ek olarak, PGD, böylece oda ısısında ve vücut ısısında farklı mekanik özelliklerini göstermektedir, benzersiz şekil bellek sergiler. Sonuç olarak, PGD sinir dokuları benzer mekanik özelliklere sahip eşsiz bir elastik özellikleri sergileyen, biyo-bozunabilir ve biyo-uyumlu; Bu nedenle, bu sinir doku mühendisliği uygulamaları için uygun bir malzemedir. Bu protokolde, electrospunbüyük bir mevduat alanı kapsayan uzun elyaf PGD gelen yeni tasarlanmış toplayıcı ile imal edilmiştir. Lif iskeleleri fare pluripotent kök hücreler büyüme ve farklılaşma destekleyebilir.

<table><tbody><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Dodekandioik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilen oksit) (PEO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>132350250</td><td>% 0.10</td></tr> <tr><td>Fare embriyonik kök hücreleri</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>% 1</td></tr> <tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ng / ml</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin floresan boya</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV Toplam RNA İzolasyon Sistemi</td><td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript Ters Transkripsiyon Sistemi</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek voltajlı güç kaynağı&nbsp;</td><td>Spellman High Voltage Electronics Corporation</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>UV ışığı</td><td>Philips</td><td>308643</td><td>15W/G15T8</td></tr><tr><td>Synergy HT Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer GeneAmp PCR Sistemi 9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

fare embriyonik kök hücrelerden mühendislik sinir dokular için poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Doku mühendisliği uygulamaları için, biyo-bozunabilir ve biyo-uyumlu iskeleleri hazırlanması en çok arzu edilen, ancak zor bir iştir. Çeşitli üretim yöntemleri arasında elektro sadeliği ve çok yönlülüğü dolayı en ilgi çekici biridir. Buna ek olarak, electrospun nanolifler hücre hayatta kalması ve büyümesi için ek destek sağlanması doğal hücre-dışı matrisin boyutu taklit. Bu çalışma Elektrospinning için, yeni tasarlanmış toplayıcı kullanılarak poli (gliserol-dodekanoat) adlı yeni bir biyo-bozunabilir ve biyo-uyumlu polimer için daha büyük bir alan depozito (PGD) 1 yayılan uzun liflerin üretim canlılığı gösterdi. PGD ​​böylece sinir doku mühendisliği uygulamaları için uygun olan, sinir dokularının benzer mekanik özelliklere sahip eşsiz bir elastik özellikleri sergiler. Lifli iskele malzemeleri yapmak için sentez ve üretim set-up, basit ve yüksek tekrarlanabilir ve ucuz. Biyouyumluluktakitest, fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen hücreler uygun ve electrospun PGD lifleri üzerinde artabilir. Özet olarak, bu protokol, fare embriyonik kök hücre kaynaklı sinir soy hücrelerinin gelişimini desteklemek için PGD electrospun liflerin imalatı için çok yönlü bir üretim yöntemi sağlanmaktadır.

Elektrospinning en önemli bileşenleri, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bir büyük boyutlu elyaf mat, genellikle dikey olarak bağlanmış alüminyum folyo şerit ve metal bir plaka elde edilmiştir. Şekil 2, bu kollektör tasarım ve elektro Fiber mat gösterir. Genişliği ve uzunluğu, farklı uygulamalar için ayarlanabilir. PGD ​​polimer ve bazal solüsyon karışımı ile yapılan elyafın uzunluğu 10 cm&#39;dir. Electrospun Elyafların morfolojisi, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir.% 40 PG...

Poli (gliserol-dodekanoat) adında yeni bir biyolojik polimerden bir yeni tasarlanmış toplayıcı aracılığıyla daha geniş bir alanı kapsayan mevduat electrospun uzun liflerin (PGD) Sentezi ve fabrikasyon bildirildi. Lifler fare pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücrelerin büyümesini desteklemek mümkün.

Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Bu prosedür, Electros'un poli gliserol Dote Cano eight adlı yeni bir biyolojik olarak parçalanabilen polimerden eğrilmiş uzun lifleri üretir. Önce yeni tasarlanan kollektörü kurun ve bir şırınga ve pompa kullanarak elektro eğirme için polimerik çözeltiyi hazırlayın, çözeltiyi kollektöre verin. Daha sonra elde edilen fiber matı çapraz bağlama için bir kültür kabına aktarın.Daha sonraki tohum, kesilen lifler üzerinde fare embriyonik kök hücreleri. Sonuç olarak, sonuçlar, fare embriyonik kök hücrelerinin hayatta kalabileceğini ve lif iskeleleri üzerindeki nöral hücrelere farklılaşabileceğini gösterebilir. Bugünkü videoda, syn hücrelerinin üretiminden biyomateryalin nasıl hazırlanacağını ve son olarak bu elektro açıklıklı fiberin hücre kültürü için nasıl kullanılacağını gösterdik.Özellikle poli ve leke hücresinden türetilen hücre ile birleştiğimizde. Gelecekte hücre iletimi ve fonksiyonel bir doku oluşturma için çok önemli uygulamalara sahip olabilirler. Tissue invis bugün sizin için korkunç bir prosedür gösterecek.Laboratuvarımdaki en büyük şey o. Alüminyum folyoyu dikdörtgen bir parça halinde kesin. Dikdörtgen parçayı dikdörtgen bir şerit halinde katlayın ve bantla düz bir metal plakaya dik olarak tutturun.Şeridin uzunluğu, polimerik çözelti için gerekli olan fiber matın boyutuna bağlıdır. 100 saat boyunca 120 santigrat derecede bire bir molar oranda karışık gliserol ve dekan diik asit yapın. Bir poli gliserol elde etmek için, dekanoik polimer, polietilen oksit ve jelatini 15 mililitrelik bir tüpte 1.5 ila üç ila 95.5 ağırlık oranıyla% 65 Etanol içinde çözer.Kapağı sıkın ve karışımı bir saat boyunca 60 santigrat derecede bir fırında ısıtın, bazal çözelti homojen olana kadar her 15 dakikada bir karıştırın. Elektro eğirme için PGD polimerini ve bazal çözeltiyi karıştırın. Dört ila altı ağırlık oranında, karışıma% 0.1 riboflavin ekleyin ve iyice karıştırın.Polimerik çözeltiyi, 18 gauge körelmiş paslanmaz çelik iğne ile beş mililitrelik standart bir şırıngaya besleyin. Ardından şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin. Yüksek voltajlı bir güç kaynağının topraklanmış ucunu metal plakaya ve pozitif yüklü ucu iğneye takın.Ayrıca, iğne ile alüminyum folyo arasındaki mesafeyi ayarlayın. 15 santimetreye kadar soyun. Şimdi şırınga pompasını şeridin ön tarafında liflerin toplanmasını önlemek için yatay olarak yaklaşık 15 derecelik bir açıyla yerleştirin.Şırınga pompasını açın ve pompanın akış hızını saatte 0,6 mililitre olarak ayarlayın. Yüksek voltajlı güç kaynağını açın ve çalışma voltajını 14,6 kilovolta ayarlayın. Toplama işlemi tamamlandıktan sonra, fiber matı 60 dakikalık çapraz bağlama için UV ışığına maruz bırakın.Fiber matı alüminyum folyo şeridinden 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Fiber matı cerrahi bıçakla aynı boyutta yuvarlak parçalar halinde kesin ve parçaları 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Ardından, hücre öncesi tedavi için 20 dakikalık bir sterilizasyon için plakayı UV ışığına maruz bırakın.Lif örneklerini bir mililitre fosfat tamponlu tuzlu suya batırın ve ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derece inkübe edin. PBS'yi dikkatli bir şekilde aspire edin. Her oyuğa bir mililitre farklılaşma ortamı ekleyin ve üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Farklılaşma ortamını dikkatlice aspire ettikten sonra, her bir lif örneğine 0.2 mililitre matri jel ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Fazla matri jelini her birinden dikkatlice çıkarın. İki mililitre farklılaşma ortamı ile bir kez durulayın.10 dakika sonra, 37 santigrat derece olan fare embriyonik kök hücre kültürü kabına bir mililitre taz ekleyin. MES hücreleri ayrıldığında, dört mililitre farklılaşma ortamı ekleyin. Yüzen MES hücrelerini beş dakika boyunca 400 Gs'de 15 mililitrelik bir tüp santrifüjüne toplayın.Peletlenmiş hücreleri dört mililitre farklılaşmada yeniden askıya alın. Orta. 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 hacim farklılaşma ekleyin. Orta. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 15 mikrolitresini hemo sitometre üzerindeki bir odaya aktarın.Bir kapak kayması yerindeyken, hemo sitometrenin bir milimetre merkez karesindeki ve dört köşe karesindeki hücreleri sayın. Şimdi beş kere 10'u dördüncüye bırakın. Fare ES hücreleri yavaşça lif örneklerinin ortasına gelir.Her oyuğa bir mililitre farklılaşma ortamı ekleyin ve hücre bağlanması için 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Büyüme ve farklılaşma. Bir mililitre farklılaşma ortamını her gün yenileyin.Hücre canlılığını ölçmek için, eski ortamı her bir oyuktan aspire edin ve kültüre 10'da bir seyreltme abresinden bir mililitre ve floresan reaktifi ekleyin. Medium, doğrudan ışıktan korunarak dört saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edilir. Daha sonra, her bir oyuktan 100 mikrolitrelik üçlü numuneleri 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve floresan taramalı elektron mikroskobu görüntüleri, elektros eğrilmiş liflerin morfolojisini değerlendirmek için kullanıldı.%40 PGD konsantrasyonundan yapılan bu liflerin çapları burada mikrometre aralığındadır. Diferansiye fare embriyonik kök hücreleri lifler üzerinde üç gün boyunca kültürlendi ve eksprese edilen yeşil floresan proteini görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanıldı. Altıncı günde artan yeşil floresan hücre sayısı, lif iskelelerinin hem hücre yapışmasını hem de hücre çoğalmasını destekleyebileceğini gösterir.Zu ve floresan ölçümleri, matrigel ve laminin ile kaplamanın eşdeğer hücre canlılığı ve nispeten daha yüksek proliferasyon ile sonuçlandığını gösterdi. Flury potens ve nöral hücre belirteçleri, birinci gün gerçek zamanlı PCR ile ölçüldü. Lifler üzerinde kültürlenen MES hücrelerinin çoğunluğu pluripotens belirteçlerini eksprese etti.Ekim dört nano ve SOX iki. Küçük bir alt küme, nöral kök hücre belirteçleri PAC six ve neston'u eksprese etti. Kültürde iki hafta sonra, harita iki ve DCX gibi bazı nöral hücre belirteçlerinin yanı sıra oligodendrosit belirteci oligo bir ve astrosit belirtecinin ekspresyon seviyeleri artmıştır.GFAP Bir kez ustalaştı. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa iki ila üç saat içinde yapılabilir.

electrospun-fibrous-scaffolds-poly-glycerol-dodecanedioate-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Polimerlerin doku mühendisliği ve hücre kültürü için elektrospinning süreci, bu makalede ele alınmaktadır. Özellikle multi-polimer elektrospinning photopatterning ve ek işleme yetenekleri ile photoreactive macromers elektrospinning açıklanmıştır.

Doku Mühendisliği ve Hücre Kültürü için Lifli Polimer Yapı iskeleleri elektrospinning

Bağlantısızlar electrospun lifler in vitro nöron büyüme doğrudan ve sinir rejenerasyonu iskeleleri potansiyel bir bileşenidir. Biz electrospun elyaf yüzeyleri ve birincil sıçan E15 duyusal (DRG) ve motor nöronların serum serbest kültür hazırlanması için bir prosedür açıklanmaktadır. Immünsitokimya tarafından nöronların Görselleştirme de dahildir.

Kültür İlköğretim Motor ve Electrospun Poli-L-lactide Nanofiber Yapı iskeleleri Tanımlı Medya Duyu Nöronlar

Bu çalışma detayları 3D fibrin hazırlanması kültür ve plutipotent kök hücrelerin ayrıştırılması için iskeleleri. Bu tür iskelesi sıra ilaç verme sistemleri içeren değiştirilmiş olarak kök hücre davranışı üzerindeki çeşitli biyolojik etkiler bileşiklerin taranması için kullanılabilir.

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

Elektrospinning iskelelerinin doku mühendisliği uygulamaları için post prodüksiyon işlenebilir. Burada kısırlık (aseptik üretim veya sterilizasyon post prodüksiyon) ulaşmak için ve uygun biyomekanik özellikleri elde etmek için, daha kalın iskeleleri (çoklu katman ısı kullanarak veya buhar tavlama ile) yapmak için, karmaşık iskeleleri (ardışık eğirme) eğirme yöntemleri açıklanmaktadır.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Bu protokol, nöronları yönlendirmek için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmek için elektrospinning ve mikroküreleri birleştirir. Sinir büyüme faktörü PLGA mikroküreleri içinde kapsüllendi ve Hyaluronik Asit (HA) fibröz iskelelere elektrospre edildi.  Protein biyoaktivitesi, iskelelerin birincil civciv Dorsal Kök Gangliyonları ile tohumlanması ve 4-6 gün boyunca kültürlenmesi ile test edildi.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

Burada, biz liflerin Basamaklandırılmış organizasyonu ile electrospun nanolif iskeleleri imal ve hücre morfolojisi / yönünü düzenleyen kendi uygulamalarını keşfetmek için bir protokol mevcut. Nanolif iskelelerinin fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından Degrade'ler biyomedikal alanındaki uygulamalar geniş bir yelpazede sunuyoruz.

Fiber Teşkilatı geçişleri ile electrospun Nanolif iskeleleri

Beynin karmaşık eylemlerine ilişkin içgörü, gelişmiş araştırma araçları gerektirir. Burada, beyin benzeri mimariye benzeyen yeni bir ipek kollajen bazlı 3D mühendislik nöral doku modelini gösteriyoruz. Model, nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktiviteyi incelemek için kullanılabilir.

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Burada, biz fare 3D kültür için bir protokol beyin kaynaklı glia hücreleri, astrocytes, microglia ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere mevcut. Biz birincil hücre kültürü, methacrylated hyaluronik asit (HAMA) hidrojel sentezi, HAMAphoto polimerizasyon ve hücre saklamasını ve confocal ve tarama elektron mikroskobik görüntüleme için işleme örnek göstermektedir.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

Bu iletişim kuralı bir iletken polimer iskele vitro elektriksel stimülasyon ve kök hücre numaralı seribaşı iskele kullanarak sonraki vivo içinde implantasyon için üzerinde kök hücrelerin tohum izin vermek için bir hücre kültür sistemi imalatı açıklar bir minimal invaziv tekniği.

Modüle ve kök hücre sunmak için elektriksel olarak iletken iskele

Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerden mühendislik sinir dokuları için elektrospun poli(gliserol-dodekanoat) fibröz iskeleleri üretme yöntemini. Bu biyobozunur polimer hücre büyümesini destekler ve doku mühendisliği uygulamaları için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

Daha fazla video keşfet