İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

Bu prosedürün genel amacı, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerdeki mikro RNA ekspresyonunu karşılaştırmaktır. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen retinal pigment epiteli hücreleri ve fetal retinal pigment epiteli hücreleri karşılaştırılır. Bu işlem, öncelikle iPS hücrelerinin ve fetal RPE'nin kültüre edilmesi ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım, iPS hücrelerini RPE'ye farklılaştırmaktır. Ardından, iPS hücrelerinden, iPS-RPE hücrelerinden ve fetal RPE hücrelerinden RNA ekstre edilir. Son adım ise RNA örnekleri üzerinde mikro RNA mikroarray analizi gerçekleştirmek ve verileri analiz etmektir.

Nihayetinde, yolak ve ağ analizi; proliferasyon ve hücre döngüsü ilerlemesi dahil olmak üzere birden fazla hücresel ağda yer alan diferansiyel eksprese mikroRNA'ların belirlenmesi için kullanılır. Bu yöntem, olgun RPE hücre döngüsü ilerlemesi, proliferasyon ve senesensle diferansiyasyonun düzenlenmesinde mikro RNA'nın rolü gibi görme araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkisi, terapide kullanılan hücrenin optimum pasaj sayısının belirlenebilmesi nedeniyle, hastalıklı veya hasarlı RPE'yi değiştirmek için kullanılan kök hücre türevli retina pigment epiteli tedavilerine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem, IPS'den RRP farklılaşmasını düzenleyen faktörlere dair öngörü sağlayabildiği gibi, IPS'den diğer TC'ye özgü hücre tiplerinin farklılaşması gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri M tester one medyumunda, yeni kaplanmış bir plakaya kuyuk başına yaklaşık 350 hücre kolonisi olacak şekilde ekin ve IPSL kolonilerinin kültürde dört ila beş gün boyunca genişlemesine izin verin.

Ardından, her üç günde bir M tesser one medyumunu dört mililitre diferansiyasyon medyumu ile değiştirin ve medyumun yarısını taze diferansiyasyon medyumu ile yenileyin. Pigmentli odakların, kültürden manuel olarak diseke edilebilecek kadar büyümesini bekleyin; bu işlem yaklaşık 40 ila 50 gün sürer. Daha sonra, pigmentli kolonilerin etrafını kesip kaldırmak için 200 µL'lik bir pipet ucu kullanın.

Diseke edilen kolonileri toplayıp 15 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin. Birleştirilen RPE hücrelerine beş mililitre DMMF 12 besiyeri ekleyin ve beş dakika boyunca 300 GS hızında santrifüjleyin. Ardından, besiyerini uzaklaştırın, hücre peletini beş mililitre besiyeri içinde yeniden süspanse edin ve santrifüj işlemini tekrarlayın.

Besiyerini hücre peletinden uzaklaştırın. Ardından, hücre kümeleri tekil hücrelere ayrışana kadar birleştirilmiş I-P-S-R-P-E'yi 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca %0,25 TRIPSIN EDTA ile inkübe ederek tek hücreli bir çözelti hazırlayın. I-P-S-R-P-E hücrelerini I-P-S-R-P-E besiyeri ile durulayın ve ardından toplanan hücreleri, 4 mL I-P-S-R-P-E besiyeri içerisinde taze matrigel kaplı bir plakaya ekin; hücreleri pasajlama öncesinde üç hafta boyunca kültüre edin ve deney süresince her üç günde bir besiyerini taze I-P-S-R-P-E besiyeri ile değiştirin.

I-P-S-R-P-E hücrelerini santimetrekare başına 100, 000 hücre olacak şekilde ekin ve ardından diferansiye olmamış IPS hücrelerini toplamak için ekimden 17 gün sonra hücreleri toplayın. Hücreleri, diferansiye olmamış kolonilerin merkezinde yoğunlaştığı gözlemlenene kadar kültüre edin. Bu durum gözlemlendiğinde, kolonileri D-M-E-M-F 12 besiyeri ile durulayın ve ardından IPS hücrelerini Accutane kullanarak tekil hücrelere ayırın.

Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve 300 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini iki mililitre D-M-E-M-F 12 ortamında yeniden süspanse ederek fetal RPE'yi toplayın; fetal RPE hücre kültürlerini önce D-M-E-M-F 12 ile durulayın. Ardından, hücre kültürlerini 37 degrees Celsius sıcaklıkta, %0,25 TRIPSIN EDTA kullanarak beş ila 10 dakika boyunca tekil hücrelere ayırın.

Fetal RPE hücrelerini 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve beş dakika boyunca 300 GS'de santrifüjleyin. Ardından süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 mililitre D-M-E-M-F 12 besiyerinde yeniden süspande edin.

17. günde I-P-S-R-P-E hücrelerini toplayın. Üçüncü ve beşinci pasajdan sonra, I-P-S-R-P-E hücrelerini iki kez PBS ile durulayın ve 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca 1 ml %0,25 tripsin ile inkübe ederek tek hücre süspansiyonu hazırlayın. Ardından, tripsini 2 ml buz gibi soğuk I-P-S-R-P-E besiyeri ile nötralize edin ve hücreleri 15 ml'lik konik bir tüpe toplayın.

Tüpü 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantı aspire edin. Hücre peletini, mikroboncuk kitinden alınan üç mililitre boyama tamponunda yeniden süspande edin; boyama tamponu içindeki I-P-S-R-P-E hücre süspansiyonunu 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı aspire edin ve yeniden süspande edin.

Hücre peletini, mikroboncuk kitindeki boyama tamponu ile 100 µL başına 2 × 10⁶ hücre konsantrasyonunda süspande edin. 2 × 10⁶ hücre başına 10 µL anti TRA1-60 PE antikoru ekleyin. İyice karıştırın ve ardından 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri, her 2×10⁶ hücre için 1 mL boyama tamponu ile yıkayın. Ardından, hücre süspansiyonunu 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, üst fazı aspire edin ve hücre peletini her 2×10⁶ hücre için 80 µL boyama tamponu içerisinde yeniden süspande edin.

Ardından, her 2 × 10⁶ hücre için 20 µL anti-PE işaretli mikroboncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her 2 × 10⁶ hücre için 1 mL boyama tamponu ekleyin, 300 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.

Ardından hücre peletini 500 µL boyama tamponunda yeniden süspande edin ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı üzere manyetik hücre ayırıcıda TRA1-60 negatif hücreleri için ayıklama yapın. Her örneği, nükleik asit mini preparasyonları için tasarlanmış, ticari olarak temin edilebilen bir mikro santrifüj homojenizatör mini spin kolondan geçirerek hücreleri lize edin. Ardından, küçük RNA moleküllerini korumak için tasarlanmış, ticari olarak temin edilebilen bir RNA ekstraksiyon kiti ile iPS hücrelerinden, iPS-RPE ve fetal RPE'den toplam RNA'yı ekstrakte edin.

Toplam RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir NanoDrop spektrofotometresi kullanın; örnek grupları arasında en az iki kat farklı ekspresyon seviyelerine sahip olduğu belirlenen mikroRNA'ların listesini içeren bir Excel dosyası oluşturun. Ardından, çevrimiçi RNA yolak analiz programına giriş yapın ve Excel dosyasını yükleyin. Dosya formatı için esnek formatı (flexible format) seçin ve tanımlayıcı (identifier) için açılır listeden Agilent'ı seçin.

Ham veri başlığı altına yazın. Prob ID sütununa ID'yi atayın ve log oranı sütununa gözlem birini ve log oranını atayın. Diğer tüm sütunlar için yoksay seçeneğini seçin.

Analiz parametrelerini şu şekilde seçin: güven düzeyini yalnızca deneysel olarak gözlemlenenler şeklinde belirleyin, doğrudan ve dolaylı ilişkileri dahil edin ve endojen kimyasalları ekleyin. Referans set olarak Ingenuity bilgi tabanını seçin. Ardından referans molekül veritabanını belirleyin.

Bu, tüm türlerden, tüm hücre hatlarından, dokulardan ve tüm mutasyonlardan gelen verileri içerir. Tüm parametreleri seçtikten sonra, ağları seçerek ağ analizini çalıştırın. Ardından örtüşen ağları seçin ve sonuçları görmek için ilgilenilen bir ağa tıklayın.

I-P-S-R-P-E hücrelerine farklılaştırılan IPS hücreleri, fetal RPE hücrelerine benzer şekilde, heksagonal pigmente hücre morfolojisi ile klasik RPE fenotipini sergilemiştir. Farklılaşmamış IPS hücrelerinin I-P-S-R-P-E hücreleri ile mikro RNA ekspresyon profillerinin karşılaştırılması, 47 mikro RNA'nın yukarı regüle olduğunu ve 36'sının aşağı regüle olduğunu ortaya koyarken; fetal RPE hücrelerinde I-P-S-R-P-E hücrelerine kıyasla 61 mikro RNA'nın yukarı regüle, 49'unun ise aşağı regüle olduğu görülmüştür. Ingenuity IPA yazılımı ile yapılan yolak analizi, diferansiyel eksprese olan mikro RNA'ların hedef genlerinin hücresel gelişim, büyüme ve hücre döngüsü dahil olmak üzere hücresel süreçlerde yer aldığını göstermiştir. Bu analiz ayrıca, in vivo olarak oküler dokularda eksprese edilen mikro RNA'ların, IPS hücrelerine kıyasla I-P-S-R-P-E ve fetal RPE'de zenginleştiğini belirtmiştir. Bu prosedürü uygularken, işlemin ardından RNA örneklerinin kontaminasyonunu ve degradasyonunu önlemenin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Deployment sonrasında, her hücre tipindeki mikro RNA ekspresyon seviyesini doğrulamak için R-T-P-C-R gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, görme araştırmaları alanındaki araştırmacıların rrp'de mikro RNA'nın diferansiyasyon ve hücre döngüsü ilerlemesindeki rolünü keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, IPS'den RPE'nin nasıl türetileceği ve I-P-S-R-P-E'nin mikroRNA ekspresyon profilinin IPS hücreleri ve fetal RPE ile nasıl karşılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.