Kalkınma Erken Dönemlerinde Diseksiyon ve Zebra Finch Embriyolar Mansabında Analizi

Bu prosedürün genel amacı, aşağı akış gelişimsel ve moleküler uygulamalar için çok erken embriyonik aşamalarda sağlam zebra ispinoz embriyolarını incelemektir. Bu, önce yumurta kabuğunu uzunlamasına keserek ve yumurta içeriğini WHE kağıdına nazikçe boşaltarak gerçekleştirilir. Daha sonra, birleşme bölgesi bulunur ve çevreleyen yumurta sarısı kesilerek embriyo bozulmadan bırakılır.

Daha sonra embriyo bir Petri kabına aktarılır ve daha sonra analiz edilmek üzere sabitlenmeden veya hızlı dondurulmadan önce yıkanır. Son olarak, embriyonik yapıların daha fazla netliği için vitel zarı sabit embriyodan çıkarılır. Sonuç olarak, C'de, iki hibridizasyon ve EDU tedavisi, metil cıva tedavisine yanıt olarak zebra ispinozunun erken embriyonik aşamalarında sırasıyla gen ekspresyonunu ve çoğalan hücreleri gösterir.

Bu tekniğin temel avantajı embriyonik doku hasarını en aza indirgemesidir. Bu, gelişimin tüm aşamaları boyunca morfoloji ve gen ekspresyonunun araştırılmasına izin verir. Bu yöntem, çeşitli toksinlerin gelişimin en erken aşamaları üzerindeki etkileri gibi karşılaştırmalı gelişim biyolojisi ve toksikolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü erken embriyonik yapılar kırılgan ve gözlemlenmesi zor olduğundan, diseksiyon sırasında zno bağlantısının bulunması ve vilin zarının çıkarılması zor olabilir. Zebra ispinozu yumurtalarını topladıktan ve metin protokolüne göre kuluçkaya yatırdıktan sonra, diseksiyon için aşağıdaki malzemeleri bir araya getirin. Temiz bir neşter ince uçlu forseps, iki ekstra ince uçlu forseps. Üç transfer pipeti, bir XPBS ve %4 para formaldehit.

Embriyoları sabitleyecekseniz, diseksiyon için temiz, emici olmayan bir yüzey sağlamak için diseksiyon kapsamının tabanına 10 x 10 santimetrelik bir dalga kağıdı yerleştirin. Yumurtayı, zebra ispinozu kılavuzu tarafından belirlenen istenen zaman noktasında kuluçka makinesinden çıkarın. Ardından, bir fiber optik aydınlatıcı lamba kullanarak, yumurtayı dikey ekseni boyunca tutarak mumlayın ve iç mekanı aydınlatmak için yumurtanın içinden ışık tutun.

Işığın ucunu yumurtanın arkasına yerleştirin ve yumurta sarısını ve gelişmekte olan embriyoyu bulun. Daha sonra neşteri yumurta sarısının karşısındaki tarafa yerleştirin ve hafif bir basınçla yumurtayı uçtan tabana doğru kesin. Yumurtanın uç uç tabanına dikkatlice baskı uygulamak için başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak veya yumurta kabuğunu kesim boyunca nazikçe ayırmak için forseps kullanarak yumurtanın içeriğini çıkarın.

Soluk beyaz bir halka olarak görünen beyaz birleşme bölgesi için yumurta sarısını inceleyin. Gelişmekte olan embriyoyu çevreleyin ve embriyoyu ekstra embriyonik dokudan ayırmak için embriyo merkezde yer alacak şekilde yumurta sarısını yönlendirmek için ince uçlu forseps kullanın. Basıncı azaltmak için yumurta sarısının kenarlarını delin ve embriyonik diskin yanında yumurta sarısı çapının uzunluğu boyunca tek kesimler yapın.

Yumurta sarısının embriyo ile olan bölümü başarıyla ayrılana kadar çapraz çizgiler oluşturmaya devam edin. Bir transfer pipeti kullanarak, yumurta sarısının kenarlarını çıkarın ve yırtılmasını önlemek için embriyoyu yol kağıdında yağlamak için küçük bir miktar bırakın. Embriyonik diski, bir XPBS ile bir transfer pipetinin ucunu, embriyonun altına bakacak şekilde 45 derecelik bir açıyla yerleştirerek ve tamponu az miktarda bir XPBS kullanarak dağıtarak yıkayın.

Embriyoyu küçük bir plastik Petri kabına aktarın. Tabağa daha fazla PBS ekleyerek ve embriyonun yanına PBS damlatarak embriyoyu yıkayın. Kalan sarıyı yıkamak ve çıkarmak için tabağı döndürün.

Ardından atık tamponunu aspire etmek için tabağı eğin. Embriyoyu C iki hibridizasyon için sabitliyorsanız, embriyoyu batırmak için hemen% 4 PFA ekleyin, ardından kıvrılmasını önlemek için PFA'yı düzleştirmek için doğrudan embriyonun üzerine damlatın. Embriyoyu bir metanol serisinde dehidre ettikten sonra dört santigrat derecede 12 saat inkübe edin.

Embriyo bir ila sekizinci aşamalar arasındaysa, birleşme bölgesinin ötesine uzanan zarın kenarlarını kavramak için ekstra ince forseps kullanarak embriyoya yapışan vitel zarını çıkarın. Kalan yumurta sarısı granüllerini yıkamak ve embriyonik diski vitel zarından gevşetmek için embriyoyu birkaç kez dikkatlice çevirin. Birleşme bölgesi ile vitel zarı arasında bir boşluk görünmüyorsa, zardan gevşetmek için bağlantı bölgesini nazikçe çizmek için ekstra ince uçlu forseps kullanın.

Daha sonra viel zarını ve embriyonik diskin periferik kenarını birleşme bölgesinde tutun ve viel zarını yavaşça embriyodan uzaklaştırın. Diseksiyonu takiben embriyo hızlı bir şekilde donarsa, Petri kabına iki ila üç mililitre bir XPBS ekleyin ve embriyoyu OK granüllerinden ayırmak için Petri kabını eğin. Sıvıyı çıkardıktan ve yıkamayı iki ila üç kez tekrarladıktan sonra, embriyoyu önceden etiketlenmiş bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için ince uçlu forseps kullanın ve eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma yapın.

Fiber optik aydınlatıcı lamba, mum ve yumurta kullanarak EDU hücre proliferasyon testini gerçekleştirmek için. Embriyoyu veya yumurta sarısını bulmak için, mikroenjeksiyon sırasında embriyonun zarar görmediğinden emin olmak için yumurtanın embriyo veya yumurta sarısının karşısındaki tarafını işaretleyin. Daha sonra, modelleme kili ile 60 milimetrelik plastik bir tabağı, yumurtayı istenen yönde tutmak için bir kase şeklinde kalıplayarak hizalayın.

Mikroenjeksiyon iğnesinin yerleştirilmesine izin vermek için işaretli noktanın yönünü ayarlayın. Biri yumurtaya delik açmak için olmak üzere iki cam kılcal iğneyi körelterek ve geri mineral yağ ile çektikten sonra, ikincisinin iğnesini yükleyin ve mikro enjektöre yerleştirin. Mikro enjektörde enjeksiyon başına çözelti hacmini 59.8 nanolitreye ayarlayın ve ardından 10 milimolar stok EDU çözeltisi ile mikroenjeksiyon iğnesini körelmiş cam kılcalını kullanarak yükleyin, işaretli noktada kabukta dikkatlice bir delik açın, kabuğu parçalamamaya veya parçalarını yumurta boşluğuna düşürmemeye dikkat edin.

Yumurtayı, yerleştirilecek mikroenjeksiyon iğnesi ile aynı hizada olacak şekilde delik 45 derecelik bir açıda olacak şekilde yönlendirin. Daha sonra mikro manipülatörü kullanarak, yüklü iğneyi boşluğa yaklaşık bir santimetre sokun ve istenen miktarda EDU solüsyonunu yumurta sarısına veya embriyoya enjekte edin. Yumurtayı ve kil tutucuyu sarmak için hemen birden fazla plastik tabakası kullanın ve kuluçkaya yatmayı önlemek için sargının kenarlarını tabağın dibine bantlayın.

Yumurtayı 37 santigrat derecede stabil bir yüzeyde inkübe edin, istenen aşamaya ulaşılana kadar plastik sargıyı çıkarmadan ve embriyoyu metin protokolüne göre incelemeden önce, bu şekil, orto özdeş homeo kutusunun ekspresyonunu tespit etmek için düşük dozlarda metil cıvaya maruz bırakılan disseke ve sabit embriyolar üzerinde bir NC iki hibridizasyonunu göstermektedir. Kafa yapılarının dorsal ve ventral görünümünde görüldüğü gibi, tedavi edilen embriyolar, tedavi edilmeyen embriyolara kıyasla evre 11'de zihinsel olarak gecikmeli olarak geliştirildi. Evre 12'de, solda gösterilen dört embriyo grubu aynı süre boyunca inkübe edildi.

Bununla birlikte, sol üstteki tedavi edilmemiş iki embriyo altıncı aşamaya ilerlerken, sol alttaki iki cıva ile tedavi edilen embriyo sadece beşinci aşamaya ilerledi. Bu embriyolar, burada gösterilen arka plan boyama eksikliğini göstermek için bir duyu probu ile muamele edildi, EDU ile enjekte edilen ve daha sonra gece boyunca inkübe edilen iki günlük embriyoda çoğalan hücreler. Tıklama kimyası, somitlerin ve kuyruk tomurcuğunun yan kenarlarında ve ayrıca sefalonda çoğalmayı gösterir.

Bu jel, tedavi edilmeden bırakılan veya milyonda 1.2 parça metil cıva ile tedavi edilen disseke evre 16 zebra ispinoz embriyolarından ekstrakte edilen RNA örneklerini içerir, bu da bu videoda gösterilen diseksiyon yönteminin bir kez ustalaştıktan sonra yüksek kaliteli RNA'nın ekstraksiyonuna izin verdiğini gösterir. Bu işlem sırasında uygun şekilde yapılırsa diseksiyon bir dakikadan kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü takiben erken embriyoları gözlemlemek zor olabileceğinden, embriyoyu bulmak için yumurta sarısını belirli bir açıyla incelemek önemlidir.

Kalitatif analizler için inid hibridizasyonu, hücre proliferasyonu, tahliller ve RNA ekstraksiyonu gibi diğer yöntemler, gelişimsel ve toksikolojik çalışmalarda ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.