Name: Kullanımı Shigella flexneri Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Keşfedin Shigella flexneri enfeksiyonunda otofaji-sitoiskelet etkileşimlerini in vitro hücre kültürü ve canlı zebra balığı larvaları kullanarak. Septin kafesleri ve bakteri kısıtlama mekanizmalarını gerçek zamanlı görüntüleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SM laboratuarda çalışma, Wellcome Trust Araştırma Kariyer Geliştirme Bursu [WT097411MA] tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li>
<li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella%27s+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system%3A+a+tool+box+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li>
<li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3-mediated+actin-based+motility%3A+A+tail+of+pathogen+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li>
<li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+polymers%3A+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins%3A+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li>
<li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
<li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li>
<li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-defense%3A+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li>
<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4-5.2, (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li>
<li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li>
<li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li>
<li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Doku kültürü hücrelerinin kullanılarak in vitro ve hücre iskeleti Otofaji gözlendiği zaman, Bölüm 1 ve 2&#39;de tarif edilen protokoller doku kültür hücre tipleri çok çeşitli uygulanabilir. Ayrıca, Otofaji takip (örneğin, ATG8 / LC3 autophagosomes + ve) ve hücre iskeleti (örneğin,., Aktin kuyrukları, septin kafesler) canlı görüntüleme kullanılarak Shigella, enfeksiyon sırasında, gerçek zamanlı olarak dinamik, doku kültürü hücreleri geçici olarak GFP ile transfekte edilebilir, Önceden gibi RFP- veya CFP-etiketli yapıları 7,8 nitelendirdi. (. Yani, Shigella 100 de HeLa hücrelerinin% 5-30 istila edebilir düşünüyor gerçek zamanlı analiz için genellikle arzu: 1 İçişleri Bakanlığı) Shigella ile enfekte hücrelerin yüzdesini artırmak için (OD doğrudan Shigella 400 ul ekleyin, 600 = 0.3 -0.6) 2 ml hücreleri MEM (seruma acıktırıldı) ve yeterli bakteriyel girişi için en az 1.5 saatlik Enfeksiyon sonrası bekleyin fagosom, çoğaltma, Au kaçmaktophagy tanıma ve septin caging. Alternatif olarak, bir adezin AfaE ifade ve epitelyal hücrelerde çok daha yüksek istilası özellikler M90T suşu 28 karşılaştırdık Shigella M90T AfaI suşu kullanabilir. Notun, M90T AfaI türü henüz zebrafish kullanarak in vivo test edilmemiştir. Shigella koloniler plakalar 2-3 gün boyunca 4 ° C&#39;de tutuldu ve çeşitli deneyleri için de kullanılabilir. Ancak, zamanla, ayrıca Kongo Kırmızı emer ve görünebilir virülans plazmid kaybetmiş Shigella koloniler virülens plazmid muhafaza etmek. Bu nedenle biz mümkün olduğunda taze bakteri stoklarını kullanmanızı öneririz. In vivo enfeksiyon, hücre biyolojisi izlerken, protokoller bölüm 3 ve 4, yabani tip AB hattı zebrabalıkları tarif edilmiştir. Görsele DsRed GFP veya lyz: Shigella -leukocyte etkileşimlerin görüntülenmesi için, zebra balığı transgenik çizgiler, örneğin, MPX kullanılabilirnötrofiller 19,29,30 veya MPEG1 ize: mcherry makrofajlar 19,31 görselleştirmek için. Bölüm 3.8 &#39;de tarif edildiği gibi in vivo Otofaji görselleştirmek için, GFP-LC3 zebra balığı transgen doğru, 19,24 kullanılabilir. In vivo Otofaji bozmakta için, etkili bir doz, morfolino oligonükleotid transkript yapıştırma veya protein ötelenmesinin önlenmesi için verimine göre deneysel olarak değerlendirilmelidir. Bu titrasyon deneyi gerçekleştirmek için ve (uç uca ekleme morfolino oligonükleotid için) RT-PCR ile teyit tükenmesi ya da (morfolino oligonükleotid translasyon için) SDS-PAGE ile 32 tavsiye edilir. Zebra balığı embriyolarının ya da larva RNA izolasyonu guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Zebra balığı larvası (8-15 larva / tüp) proteininin, ayıklamak için, mekanik olarak,% 0.01 oktilfenol etilen oksit yoğunlaştırma 200 ul liziz tamponu (1 M Tris, 5 M NaCI, 0.5 M EDTA, bir havan tokmağı kullanılarak homojenizee ve proteaz inhibitörü). 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 19,000 x g&#39;de santrifüj tüpleri ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de numune Laemmli tamponu ilave edin ve ısıtın. Lizatlar, gerekli olana kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir ve Bölüm 2.3 &#39;de tarif edildiği gibi Western blot analizi ile değerlendirilebilir. Zebra balığı in vivo ilaç uygulaması için mükemmel bir model. Morfolino oligonükleotidler kullanılarak Analizi Otofaji (örneğin, rapamisini ve bafılomycin) işlemek için kurulan ilaçlar ile tamamlanabilir. Enfekte olmamış ve / veya enfekte olan larva rapamisin (1.5 uM) ya da bafilomycin (80 nM), E2 içinde seyreltilmiş ve 25,33 tarif edildiği gibi akış otofajik Western lekeleme yolu ile değerlendirilebilir ile muamele edilebilir. Bölüm 3.5 de tarif edildiği gibi enfekte larvaların enfeksiyon ve hayatta kalma sonucu üzerinde Otofaji manipülasyon sonucu değerlendirilebilir. Konakçı hücre incelenmesine ek olarakin vitro ve in vivo protokollerde belirleyicileri örn. Shigella ΔicsA (Shigella, protein, N-ICSA WASP toplayan ve ARP2 / 3, diferansiyel Otofaji tarafından kabul edilen bakteri mutant türünü kullanarak otofaji tanınması için gerekli bakteriyel belirleyicilerini değerlendirmek için uygulanabilir , yokluğunda, yokluğunda hiçbir aktin kuyrukları, herhangi bir septin kafes) ve ShigellaΔicsB (Shigella ICso için Otofaji makine işe engelleyen bakteriyel efektör protein IcsB aracılığıyla otofajik yanıtı önler olabilir, aktin ve kuyruk septin oluşumu için kafes daha septin kafesleri, daha otofaji) 7,8 olabilir. Shigella Zebrafish doğal bir patojen olmayan ve 37 ° C &#39;de en iyi şekilde büyür. Ancak, çalışma tta fagositik vakuol ve çoğaltma kaçmak, Shigella işgali için gerekli olduğunu virülans faktörleri göstermiştirtosol belirtilmiştir ve 28 ° C de 19 zebra balığı larvaları işlevsel olabilir. 28 ° C Normal zebra balığı gelişimini sağlamak için 23 zebra balığı ve sabit bir sıcaklıkta yetiştirilmesi için en yaygın olarak kullanılan sıcaklığıdır. Çarpıcı bir şekilde, insanlarda şigelloz yol önemli patojenik etkinlik (epitel hücreleri içinde, yani, makrofaj hücre ölümü, invazyon ve çarpma, hücreden hucreye yayılma konakçı epitel enflamatuar yok) sadık Shigella enfeksiyonun Zebrafish modelinde çoğaltılmaktadır 19. Otofaji ve iskeleti genler yayg ifade ve biyolojik işlevleri geniş bir yelpazede vardır. Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda 5 embriyonik öldürücü olan temel Otofaji 26 ya da septin genlerin nakavt göstermiştir, ve bu sorun, zebra balığı birden fazla olması gerçeği ile daha da azalabilir, ancak, bu genlerin bir kısmı da (zebra balığı gelişimi için gerekli olması da muhtemeldirparalog genler 33). Eğer öyleyse, morpholinos aşağı titre edilebilir, (ii) ve Otofaji iskeletinin düzenlenmesi için (i) farmakolojik reaktifler kullanılması da dahil olmak üzere, bu sorunu aşmak için birçok seçenek vardır, genlerin (iii) reseptörü sadece belirli bir hücre için tasarlanabilir tipleri ve / veya (iv) hayvan gelişimi için esas teşkil etmeyen otofajik tanıma ile ilgili genler (örneğin,., P62) hedeflenebilir. Zebra balığı Otofaji ve Shigella enfeksiyonu sırasında iskeletinin araştırmak için ideal bir model sistem iken, moleküler araçlar şu anda eksiktir. Bu alan yeni araç ve söz konusu proteinlerin tahrik hücre özel ifade oluşturmak için gereklidir. Otofaji / iskeleti genlerin ifadesini yıkmak için, yeni morfolino dizileri gerekli değildir ve genom mühendisliği için yeni bir yöntem (örneğin, TALEN CRISPR / Cas9) de kullanılabilir. Bu arada, birçok araç önceki çalışmalar, insan ya da fare için oluşturulmuşeşit Zebra balığı için çalışabilir. Hücre içi bakteriler, S. flexneri bağışıklık sistemi 1,2 ile tanınan bakterilerin yeteneği dahil olmak üzere biyoloji kilit sorunları ele almak için olağanüstü bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Konakçı hücre S. motilitesini kısıtlamak için kullanır septins flexneri ve otofaji onları hedef hücre özerk dokunulmazlık 7,8 kritik bir bileşenidir. Bu gözlemler Otofaji ve sitozolik bakterileri indirgeme yeteneğini incelemek için yeni bir moleküler çerçeve önermek. Bir önemli konu tamamen altta yatan moleküler ve hücresel olayları deşifre etmek, ve ilgili hayvan modelleri kullanılarak in vivo bakteriyel enfeksiyon sırasında in vitro analiz bu olayları doğrulamak için şimdi. Bu amaçla, Zebra balığı S. analizi için değerli bir yeni bir ev sahibi olarak kurulmuştur flexneri enfeksiyonu 19. Bakteri ve konak hücreleri arasındaki etkileşim yüksek çözünürlükte görüntülü edilebilir veZebra balığı model, in vivo Shigella enfeksiyonu hücre biyolojisi anlamak için yararlı ispatlamak zorundadır. Zebra balığı larvalarının konak savunmasında bakteriyel otofaji rolünü araştırmak için kullanılabilir, ve iş otofaji pertürbasyon olumsuz Shigella enfeksiyonu 19 yanıt konak yaşamını etkileyebileceğini olduğunu göstermiştir. Gözlemler konak savunmasını anlamakta temel gelişmeler sağlayabilir Zebra balığı larvaları kullanılarak doku kültürü hücreleri ve in vivo kullanılarak in vitro caging ve Otofaji septin, Shigella çalışma üretti. Onlar da bulaşıcı hastalıklarla mücadele edilmesini amaçlayan yeni stratejilerin geliştirilmesini hatırlatıyoruz. Bu raporun kritik bir amacı in vitro analiz moleküler ve hücresel olayların mantıklı (yani, otofaji, aktin kuyrukları, caging septin) bir ent bağlamında in vivo bakteriyel enfeksiyon sırasındaZebra balığı larvaları kullanılarak ire organizma. Zebra balığı biyolojisi ve taşıma ile tanıdık, biri doğru Zebrafish hayvancılık 23 ve zebra balığı enfeksiyon 19,35 in vivo analizi derinlemesine protokoller başvurabilir.

Shigella flexneri, Gram-negatif invaziv enteropatojenik bakteri, sitoplazmada fagozomların kaçmak ve sitozolik immün yanıtları kaçmasına ve içi ve hücreler arası hareketi 1,2 teşvik etmek konak aktin iskeletinin polimerize olabilir. In vitro 3,4 aktin tabanlı motilite anlayışa rağmen, in vivo bakteri yayılmasını kısıtlayan mekanizmalar tam olarak tanımlanmamıştır. Bu doğuştan gelen bağışıklık ve konak savunma daha iyi anlaşılması için önemlidir. Septins, Metazoan&#39;da arasında proteinlerin yüksek oranda korunan bir aile hetero-oligomerik kompleksleri halinde birleşme ve hücresel membranlar ve hücre iskeleti ile ilişkilendirmek 5,6 polar olmayan filamentler oluşturmak proteinleri etmeye dayanır guanosin trifosfat (GTP) bulunmaktadır. Son çalışmalar, enfekte olmuş konakçı hücreler autoph hedeflenmiş bölümlere bakterilerin Shigella, aktin göre hareketlerini önleyebilir keşfetmiştiraktin esaslı hareketliliğini 7,8 dengeler ilk hücresel mekanizmayı ortaya agy içinde &#39;septin kafesleri&#39;,. Soruşturmanın geniş bir açık alanı artık &#39;septin biyoloji ve enfeksiyon&#39; yatıyor. Patojenlerin yol açtığı septin montaj, (örneğin, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), konak savunma 5,12 önemli bir konu olarak ortaya çıkabilir. Otofaji, yüksek oranda korunmuş hücre içi bozulma süreci, çünkü lizozomdur 13,14 sitosolik bakteri teslim kabiliyetini hücre özerk bağışıklığın önemli bir bileşeni olarak görülüyor. Ancak, in vivo bakteriyel otofaji rolü kısıtlamak veya kötü 15,16 anlaşılamamış bakteri çoğaltma teşvik etmek. Bu optik olarak erişilebilir olduğu için zebra balığı (Br.rerio) enfeksiyonları çalışma için omurgalı bir model olarak ortaya çıkmıştırlarva aşamasında doğuştan gelen bağışıklık sistemi zaten 17,18 işlevsel olduğunda. Son çalışmalar S. Zebra balığı larvalarının duyarlılığını karakterize etti flexneri, bakteriyel otofaji 15 için bir paradigma, ve in vivo 19 antibakteriyel tedavi için otofaji manipülasyon çalışma Shigella -zebrafish enfeksiyon modeli kullandı. Bu rapor yeni araçlar ve S. incelemek için tahliller sağlar otofaji ve hücre iskeleti ile flexneri etkileşimleri. Bir birinci basamakta, protokoller, hücre iskeleti otofaji-etkileşimleri insan epitel hücre hattı HeLa, Shigella enfeksiyonu kullanılarak anlatılmıştır izlemek için. In vitro Shigella enfeksiyonları sürecine otofaji-iskeleti etkileşimlerin rolünü değerlendirmek için, yöntemler sunulmaktadır Otofaji ve (siRNA&#39;nın veya farmakolojik reaktifler kullanarak) iskeleti bileşenleri işlemek için. Yeni iş Shigella enfeksiyonu o kullanarak göstermiştirf zebra balığı larvası, benzer deneyler, in vivo enfeksiyon, hücre biyolojisi okumak için uygulanabilir. Protokoller hazırlamak ve Zebra balığı larvaları detaylı bulaştırmak ve in vivo Shigella enfeksiyonu için konak yanıtı değerlendirmek için, protokoller konak yaşam ve enfekte larva bakteriyel yükü sağlanır belirlemek için. (Yöntem (sabit veya canlı larva kullanılarak zebra balığı) Shigella için septin ve Otofaji belirteçlerinin işe izlemek ve yöntemleri [morfolino (1-4 hücre aşamasında embriyoların içine enjekte) oligonükleotidlerin ya da farmakolojik reaktifler kullanılarak, in vivo bu süreçlerin rolü test etmek için Zebra balığı banyo suyuna direkt ilave)] de tartışılmıştır. Bu iş programı sitozolik ana yanıtlarının enfeksiyonu kontrolü için gerekli mekanizmaların kavranmasını sağlaması bekleniyor.

<table><tbody><tr><td>Bafilomisin A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam mikrokılcal damarlar&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>Kaba manuel manipülatör&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 ince cımbız</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfeneuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Problar</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Keçi karınca-tavşan IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Problar</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>JetPEI transfeksiyon reaktifi</td><td>Polyplus transfeksiyon</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek cam alt çanak</td><td>MatTek şirketi</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM artı L-alanil-L-glutamin&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör ve nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme Cihazı&nbsp;</td><td>Sutter Enstrüman A.Ş., Novato,</td> <td>P-87&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal anti-tübülin, asetillenmiş antikor&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltiyoüre ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&nbsp;</td><td>Moleküler Problar</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62 / SQSTM1 antikoru</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>Rapamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon reaktifi</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield DAPI içeren sert set montaj ortamı&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

kullanımı<em&gt; shigella flexneri</em&gt; otofaji-sitoiskelet etkileşimleri okumak

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri sitoplazmada ulaşmak için fagozomların kaçmak ve onun hareketliliği ve yaygınlaştırılmasını teşvik etmek iskeletinin aktin ana polimerize edebilen hücre içi patojendir. Yeni iş aktin tabanlı motilite yer alan proteinler aynı zamanda Otofaji hücre otonom bağışıklık için önemli bir hücre-içi ayrıştırma işlemi ile bağlantılı olduğunu göstermiştir. Çarpıcı bir konakçı hücreler, S. aktin tabanlı motilite önleyebilir bakterilere içinde &#39;septin kafesleri&#39; compartmentalizing ve otofaji onları hedefleyerek flexneri. Bu gözlemler septins daha tam bir anlaşılması, lifli GTP bağlayıcı proteinler ailesidir, Otofaji sürecinde yeni görüşler işaret etmektedir. Bu rapor, S. neden Otofaji-iskeleti etkileşimlerin görüntülenmesi için protokollerini anlatır flexneri, in vitro doku kültürü hücreleri kullanılarak ve in vivo zebra balığı larva kullanılmıştır. Bu protokoller hücre içi mekaniği hakkında soruşturma etkinleştirmekmoleküler, hücresel, ve bütün organizma düzeyinde bakteri yayılmasını kontrol ms.

In vitro, S., doku kültürü hücrelerinin enfeksiyonu üzerine flexneri fagozomun kaçmak ve sitosola istila edebilir. Sitozol içinde, konakçı hücreler septin kafeslere (Şekil 1A) içine bakteri bölümlere göre Shigella aktin tabanlı motilite önleyebilir. Septin kafesler tarafından tutulan bakterileri de Otofaji belirteçleri P62 (Şekil 1B) ve LC3 (Şekil 1C) ile etiketlenebilir. Bu gözlemler invaziv patojenlerin yayılmasını kısıtlayan konak savunmasının yeni bir mekanizma vurgulamak ve otofaji ile hücre iskeleti arasında yeni bağlantılar ortaya. Çarpıcı otofaji belirteçlerin tükenmesi belirgin bakteri (Şekil 2A) septin kafes azaltır, ve aynı zamanda çalışma septin caging tükenmesi önemli Otofaji belirteçlerin 8 alımını engellediğini göstermiştir. Bu nedenle, en azından Shigella durumda, kafes aksamını ve autophagosome oluşumunu bir septin bölgesindekin birbirine süreçler olarak görülebilir. Septin kafeslerle Shigella kompartımanlara diğer hücresel şartlar aktin polimerizasyonunu ve aktomizin aktivitesi (Şekil 2B) içerir. Enfeksiyon, yeni bir hayvan modeli, Zebra balığı larvalarının 19 yararlanabilir hiçbir doğal fare şigelloz modeli, ve Shigella patogenezi, septin biyoloji ve in vivo bakteriyel otofaji soruşturma bulunmaktadır. Bu tür in vivo mikroskobu (Şekil 3A) kaudal intravenöz enjeksiyon deneyleri için hayatta kalma ve kuyruk kas enjeksiyonu gibi çeşitli anatomik bölgeler bakteri enjekte zebra balığı larvası enfekte mümkündür. Doz, S. bağlı olarak, flexneri ya 48 saat sonrası enfeksiyon içinde silinebilir Zebra balığı larvalarının enjekte ya da ilerici ve sonuçta ölümcül enfeksiyon (Şekil 3B - 3D) neden olabilir. Shigella virülans factors 28 ° C, zebra balığı optimum büyüme sıcaklığında ifade edilir ve Shigella ile zebra balığı enfeksiyonunda sahip tip III sekresyon sisteminde (T3SS) 19, insan hastalığında temel bir hastalık oluşturma mekanizmasını belirleyen sıkı sıkıya bağlıdır. Taken birlikte, bu gözlemler Zebrafish larva Shigella enfeksiyonu in vivo analizi için değerli bir yeni dizi temsil ettiğini göstermektedir. Zebra balığı larva optik erişilebilirlik in vivo (Şekil 4A) olarak septin caging önce, memeli konakçı modeller kullanılarak gerçekleştirilebilir hiçbir zaman bir başarı görselleştirme sağlar. Septin kafesleri in vivo otofaji hedefleyen bakteri tuzağa kanıtlar tamamlamak için, bir GFP-LC3 sentezleyen transgenik Zebra balığı larvaları enfekte ve Shigella (Şekil 4B) otofaji işaretleyici işe gözlemleyebilirsiniz. In vivo, el Shigella autophagosomes arasında ultrastrucutral analizi içinECTRON mikroskopi açık bir şekilde çift katlı bir zar 19 ile vaküol bakterilerin sitosolik sekestrasyonunu göstermek için kullanılabilir. Otofaji hücre özerk bağışıklığın önemli bir bileşeni ve intracytosolic bakterilere 14-16 karşı önemli bir savunma mekanizması olarak görülüyor. In vivo Otofaji işlevini karakterize etmek için, P62-morfolino muamele zebra balığı larvası kullanılabilir. Çekirdek Otofaji makineler aksine [örn., 36 otofaji ilgili proteinleri (ATG) 26], S62 olduğu enfeksiyona normal olarak önce gelişebilir, omurgalı gelişimi ve dolayısıyla 27 zebra balığı larvalar için gerekli değildir. Çarpıcı, P62-tükenmiş larvalar S. ile aşılanmış önemli ölçüde artmış mortalite ve artan bakteri yükünün 19 flexneri sonuç. Bu septin kafes aksamını gösteren in vitro çalışma ile anlaşma autophagosome oluşumu 7,8 ile birbirine bağlı olduğunu, Shigella için septin işe açıkça (P62-tükenmiş larva azalır <strong&gt; Şekil 4C). Bu veriler, zebra balığı sağkalım, hücre içi bakteri enfeksiyonu kontrol etmek için P62-aracılı Otofaji bağlı olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> In vitro septin kafesin Şekil 1. (A). HeLa hücreleri S. ile enfekte edilmiştir flexneri 4 saat 40 dakika boyunca, sabit ve SEPT9 falloidinle antikorları ile etiketlenmiş ve konfokal küçük kopya ile görüntülendi. Ölçek bar, 1 mikron. (B) HeLa hücreleri S. ile enfekte edildi flexneri 4 saat 40 dakika boyunca, sabit, P62 ve SEPT2 antikorları ile etiketlenmiş ve flüoresan mikroskobu ile görüntülendi. Ölçek çubuğu, 1 mikron. (C) HeLa hücrelerinde GFP-ATG8 / LC3 transfekte S. ile enfekte edilmiştir 4 saat 40 dakika boyunca flexneri, sabit floresan ışığı mi tarafından SEPT2 antikorlar ile etiketlenmiş ve görüntülücroscopy. Ölçek bar, 1 mikron. Bu rakamlar Mostowy et al 7&#39;den modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Shigella -septin kafes oluşumu için Şekil 2. Hücresel gereksinimleri. (A) HeLa hücreleri kontrolü ile tedavi edildi (CTRL), P62, ATG5, ATG6 veya ATG7 siRNA. SiRNA ile muamele edilmiş hücrelerin tüm hücre lizatları siRNA azalması (en üst) etkinliğini göstermek için GAPDH, P62, ATG5, ATG6 veya ATG7 için bağışık edilmiştir. siRNA ile muamele görmüş hücreler ile enfekte edilmiştir S. sabit ve kantitatif mikroskopi için etiketlenmiş, 4 saat 40 dakika flexneri. Grafikler (alt) muamele başına n, ≥3 deneylerden SEPT2 kafesleri içinde Shigella ± SEM ortalama% temsil etmektedir. (B), HeLa hücreleri S. ile enfekte edilmiştir fD (CytD) sitokalasin, DMSO ile muamele edilmiş lexneri, latrunculin B (LatB), nokodazol (Noco) veya Blebbistatin (kabarcık) ve 4 saat sonra 40 dakika sabitlendi ve nicel mikroskopi için işaretlenebilir. Grafikler tedavisi için iki bağımsız deneyden SEPT2 kafesleri içinde Shigella ± SEM ortalama% temsil etmektedir. Mostowy Bu rakamlar, et al 7&#39;den modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. Shigella enfeksiyonu Zebrafish modeli. (A) Görüntüler stereomicroscope altında Zebrafish larva yönünü göstermek için. (Sol panel) Zebra balığı larvalarının 72 saat sonra döllenme onların dorsal yüzü enjeksiyon iğnesi bakacak enjeksiyon plakasına yanal konumlandırılmış. (Orta panel) Kan dolaşımı enfeksiyonu enjeksiyon sureti ile gerçekleştirilmiştirkaudal damarından bakterileri (kırmızı çözelti) ecting, ürojenital açıklığına arka. Kuyruk kasında (sağ panel), bir hücre gruplarının Enfeksiyon fazla bakteri (kırmızı çözelti) enjekte edilmesiyle gerçekleştirildi. (B), 72 saat sonra döllenme larvalarının hayatta kalma eğrisi S. çeşitli dozlarda enjekte flexneri ve 48 saat sonrası enfeksiyon için 28 ° C&#39;de inkübe edildi. Etkili inokulum düşük (&lt;10 3 CFU, açık daireler), orta (~ 4 x 10 3 CFU, açık üçgenler) veya yüksek (~ 10 4 CFU, açık kareler) olarak sınıflandırıldı. Inokulum sınıf başına n ≥3 deneylerden SEM ±% (yatay çubuklar) idi. (C) Numaralandırma bireysel larva homogenatlarda canlı bakteri çeşitli zamanlarda LB üzerine kaplama ile ölçülen enfeksiyon sonrası at Not, sadece larva numaralandırma analize dahil edilmiştir enfeksiyonu atlattı sahip. Da gösterilmiştir ± SEM (yatay çubuklar) idi. (D) GFP- Shigella Dağılımı göre belirlenirÇeşitli kez düşük, orta veya yüksek doz inokulum (kaudal damardan enjeksiyonlar) kullanılarak enfeksiyon sonrası bir floresan stereomikroskopta kullanarak canlı görüntüleme. . Iletim görüntüsü (gri) ve GFP floresan (yeşil) (B) Kaplama - (D) Bu rakamlar Mostowy ve diğ 19 dan modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. in vivo Shigella enfeksiyonu hücre biyolojisi. (A) Zebra balığı larvalarının 24 saat, sabit, GFP SEPT7 (kırmızı) karşı ve antikorlar ile etiketlenmiş (yeşil için GFP- Shigella (düşük doz) ile kuyruk kas enfekte edildi ) ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Ölçek bar, 5 mikron. (B) GFP-LC3 Zebra balığı larvaları mCherry- Shigella (orta doz) için enfekte edildi4 saat, sabit, mCherry (kırmızı) karşı ve GFP (yeşil) karşı antikorlar ile etiketlenir, ve aynı odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir. . Veya P62 (sağ görüntü) morpholinos SEPT7 karşı antikorların (ile etiketlenmiş, sabit, 4 saat boyunca GFP- Shigella (orta doz) ile enfekte edilmiştir, Ölçek çubuğu, 1.5 um (C) Zebrafish larvaları ya da kontrol (sol görüntü CTRL) ile işlemden geçirildi kırmızı) ve GFP (yeşil) için ve aynı odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir. Oklar septin kafeslere (CTRL) veya entrapped Shigella bazı örnekler vurgulamak 4 saat sonrası enfeksiyon (P62 tükenmiş). Ölçek bar, 5 mikron. Bu rakamlar Mostowy ve diğ 19 dan modifiye edilmiştir.

Patojen yayılmasını karşı koymak için, konakçı hücreler bakteriler ve bölümlere Otofaji uyarabilme iskeletinin yeniden. Doku kültürü hücreleri, ev sahibi ve bu işlem altında patojen belirleyicileri kullanılarak Shigella enfeksiyonu tespit ve karakterize edilir. Shigella enfeksiyonu Zebra balığı modellerini kullanarak, keşfedilen moleküllerin ve mekanizmaların rolü in vivo incelenmiştir.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığı larvalarındaki doku kültürü hücrelerini kullanarak, enfeksiyon sırasında bakteriyel yayılımı kontrol eden hücre içi mekanizmaları in vitro ve in vivo olarak incelemektir. In vitro yöntemi, gram-negatif ve enteroinvaziv bir bakteriyel patojen olan Citrobacter rodentium'un hazırlanmasıyla başlar; ardından hücreler enfekte edilir ve enfeksiyon sırasında konakçı otofaji mekanizmasını ve hücre iskeletini manipüle etmek için siRNA veya farmakolojik reaktifler kullanılır. Citrobacter rodentium tarafından tetiklenen otofaji-hüzyel iskelet etkileşimlerini in vivo olarak incelemek için, her iki yöntem için de döllenmeden üç gün sonra zebra balığı embriyoları enfekte edilir.Son adım, dokuların otofaji ve hücre iskeleti belirteçleri ile işaretlenmesidir. Nihayetinde, sonuçlar sitozolik konak yanıtları tarafından enfeksiyonun kontrolü için gerekli mekanizmalara dair içgörüler sağlayacaktır. Bakteriyel otofajiyi incelemek için jel kullanmanın listeria gibi diğer bakterilere göre avantajı, jelle hedeflenen otofajinin aynı zamanda başlangıç kafeslerine hapsedilebilmesidir.Bu yöntem, hücre iskeletinin otofajideki rolü nedir ve hücre içi bakterilerin kısıtlanması veya teşvik edilmesinde otofajinin rolü nedir gibi otofaji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, virüslerin veya mitokondrilerin otofajisi gibi diğer otofaji süreçlerine doğru genişleyebilir ve ayrıca septin veya otofaji bileşeni içeren insan hastalıkları için terapötik çıkarımlar sağlayabilir. Bunlar zebra balığı üzerindeki gösterimlerdir.Enfeksiyon aşaması kritiktir; çünkü zebra balıklarının bakterilerle enjekte edilmesini içeren adımları öğrenmek zordur, zira iğne hazırlığı ve doğru enjeksiyon zaman ve yüksek hassasiyet gerektirir. Zebra balığı enfeksiyonunun mikroskobik incelemesi ise deneyim gerektirir. Bu protokol için, donmuş gliserol stoktan vahşi tip cha Flexner M nine DT suşunu kullanın, bakterileri Kongo Kırmızılı triptik soya plakalarına ekin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ayrıca, ertesi gün altı kuyucuklu plaklarda %10 fetal calf serum içeren MEM medyumunda hella hücrelerini ekleyin. Bir sonraki gün tek bir koloni seçin ve bunu 37 °C'de çalkalamalı inkübasyonda bir gece boyunca TCS medyumunda büyütün. Taze TCS ile 1:80 dilüsyon yaparak alt kültürleri hazırlayın.600 nanometrede alt kültürlerin optik yoğunluğu 0,3 ile 0,6 arasındayken, bakterileri 1000 G'de beş dakika santrifüj ederek toplayın. Ardından bakteriyel peleti, aynı optik yoğunluğa ulaşacak şekilde MEM içerisinde yeniden süspanse edin.Merhaba, hücreler doğrudan 100'e bir enfeksiyon multiplisitesi ile enfekte edilmelidir. MEM içinde dilüe edilmiş chag'ı plaklara yerleştirilmiş hella hücrelerine ekleyin ve toplam MEM hacmini kuyuk başına iki mililitreye tamamlayın. Ardından, bakterilerin konak hücrelere yapışmasını maksimize etmek için plakları 700 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve oda sıcaklığında, bakterilerin hücreleri enfekte edebilmesi için plakları 30 dakika boyunca inkübe edin; enfeksiyon süresinden sonra işlemi tamamlayın.Hücreleri nazikçe iki kez yıkayın. Hücre dışı bakterileri daha fazla uzaklaştırmak için taze MEM kullanarak, hücreleri ampirik gözlemlere bağlı olarak bir ila dört saat boyunca Gentamisin içeren komple medyumlarda inkübe edin. Ardından, enfekte hücreleri fikse edin ve işaretleyin.DAPI ile işaretlenmiş cha septin kafeslerini çözümlemek için 63 x veya 100 x objektif kullanarak epi floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin; bunlar, sitozolik bakterilerin polimerize ettiği aktini çevreleyen, çapı yaklaşık 0.6 mikron olan halka benzeri yapılar olarak görselleştirilebilir. Septin kafeslerinin içindeki bakteriler, P 62 ve lc three a TG eight gibi otofaji belirteçleri ile de tanımlanabilir. Kavramsal olarak, bu prosedürün en zor yönü, dikkatli mikroskopi ve analiz gerektiren bakteriyel otofagozomların ve sing kafeslerinin in vivo ve in vitro ortamda tanımlanmasıdır.Ayrıca, birkaç biyolojik replika boyunca uygun sayıda olayın analiz edildiğinden ve istatistiksel anlamlılığın sağlandığından emin olunmalıdır. HeLa hücreleri Chlamydia ile enfekte edildikten sonra, öncelikle bakterilerin sitozole ulaşması için onlara en az iki buçuk saat süre tanıyın. Ardından, hücre iskeletini işleme almak için ilaç uygulaması yapılabilir.Negatif kontrol olarak, hücrelerin bulunduğu her iki mililitre besiyerine, seyreltilmiş ilaç stokundan bir ila beş mikrolitre arasında ekleyin. Bir grup hücreyi MEM içinde DMSO ile işleme tabi tutun, ardından hücrelerin otofajik akışını manipüle etmek için hücreleri 30 dakika boyunca inkübe edin. 20 nano molar rapamisin veya 160 nanomolar bafimisin kullanın.Ardından, işlemden sonra hücreleri dört ile 12 saat boyunca inkübe edin. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı şekilde tespit edin ve işaretleyin. Bu teknik, gel enfeksiyonunu ve otofaji sitoskelet etkileşimlerini in vivo olarak modeller. Subkültüre başlamak ve gel'i daha önce açıklandığı gibi toplamak için, bakterileri bir kez XPBS ile yıkayın ve 1000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.Ardından bakterileri 80 µL %0,1 PBS içinde Fenol kırmızısında yeniden süspande edin. Bu hazırlığı buz üzerinde tutun. Planlanan enjeksiyondan 72 saat önce nanolitre başına yaklaşık 2000 bakteri içermelidir. Hücre dışı kontaminantları gidermek için yumurtlama yapan zebrafishlerden embriyoları toplayın.Embriyoları %0,003'lük çamaşır suyu içeren E iki ortamında 10 dakika boyunca yıkayın. 10 dakika sonra, ortamı E iki ortamı ile değiştirin ve embriyoları E iki içinde beş kez yıkayın. Ardından, 10 santimetrelik kaplara 50 mililitre E iki ve 50 adete kadar embriyo ekleyin.Toplamda yaklaşık 100 embriyoyu, döllenmeden 24 saat sonra 28 °C'de büyütün. Gelişen embriyoları, mikroskopi işlemini engelleyen kormen oluşumunu önlemek için E2 ortamında %0,003'lük fenotreyazin ile tedavi edin. 72 saatlik larvaları, E2 ortamındaki 200 µg/mL'lik trikain banyosu kullanarak anestezi ederek işleme başlayın.Ardından, bir mikro manipülatör ve ince cımbız kullanarak mikro enjeksiyon iğnesinin ucunu kırın ve kırılmayı mikroskop altında kontrol edin. Şimdi iğneyi hazırlayın; önce bir damla bakteri kültürünü mikroskop tablasındaki bir lamel üzerine aktarın. İkinci olarak, mikro enjektörü ve gaz tüpünü açın.Üçüncü olarak, iğne ucunu damlanın içine indirin. Ve dördüncü olarak, cha enfeksiyonu sırasında zebra balığı sağkalımını değerlendirmek için iğneyi doldurun. İnce bir resim fırçası kullanarak dikkatli bir şekilde intravenöz enjeksiyon yapın.Anestezize edilmiş larvaları, dorsal kısımları iğneye bakacak şekilde enjeksiyon plakasına yan olarak yerleştirin. Şimdi iğne ucu, urogenital açıklığın yakınına, kodle venine doğru yönlendirilmiş olarak konumlandırılmalıdır. Ardından deriyi delerek bir ila beş nanolitre hacminde bakteri bolusu enjekte edin.Kodal vene yapılan başarılı bir enjeksiyon, fenol kırmızısının ven boyunca yayıldığının gözlemlenmesiyle anlaşılır. Teknik olarak, kodal ven enjeksiyonu bu prosedürün en zor kısmıdır ve zebrafish larvaları ile pratik yapılması gerekir. Larvaların uygun şekilde sabitlenmesi gerektiği için konfokal mikroskopi de zorlayıcı olabilir.Enjeksiyonlardan sonra, enfekte olan her bir larvayı, bir mililitre E2 besiyeri içeren 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna tek tek aktarın. Plakayı 28 °C'de inkübe edin ve embriyoları günlük olarak takip edin. Septin ve otofaji markerlarının birikimini görselleştirmek için.Ella'yı kuyruk kası gibi lokal bölgelere enjekte edin. Larvaları önceki bölümde gösterildiği şekilde enjekte etmeye hazırlayın. Zebra balığını yan şekilde konumlandırın ve iğneyi kasın üzerine yerleştirin.Ardından somitlerin arasındaki boşluğa girilerek yaklaşık bir nanolitre Ella enjekte edilir. Kuyruk kaslarına yapılan başarılı bir enjeksiyon, enjekte edilen somitin kırmızıya boyandığını gösterecektir. Fenol kırmızısı tamponun bir sonucu olarak, E2 ortamında düşük erime noktalı %0,1 agaroz 37 °C'de hazırlanmıştır.Cam tabanlı bir kaba tek tek agarro damlaları ekleyin. Enjekte edilmiş larvaları, minimum hacimde çözelti ile agarro damlalarına aktarın. Larvaları orada istediğiniz şekilde konumlandırın ve agarronun katılaşmasını bekleyin.Ardından, tüm kabı LMA ile kaplayın ve ardından trica ile E ikisini ekleyin. Sonra birkaç saat boyunca her iki dakikada bir Zacks alın. Enfekte doku kültürü hücrelerinde, shaila fagozomdan sitozole kaçar; burada konakçı hücre iskeleti yeniden düzenlenebilir ve bakterileri septin kafes benzeri yapılar içinde bölmelere ayırabilir.Septin kafeslerinde hapsolmuş bakteriler, P 62 ve lc three gibi otofaji belirteçleri tarafından tanınır. Zebrafish, CHA enfeksiyonunun in vivo çalışması için değerli ve yeni bir konakçıdır. Enfeksiyon dozuna bağlı olarak zebrafish, enfeksiyondan sonraki 48 saat içinde düşük dozu temizleyebilir veya yüksek doz durumunda enfeksiyona yenik düşebilir.Zebra balığının optik şeffaflığı, septin kafeslerinin in vivo görselleştirilmesine olanak tanır; bu, septin kafeslerinin ve hedef alınan bakterilerin otofajiye yönlendirildiğine dair kanıtları tamamlamak adına diğer omurgalı modeller kullanılarak gerçekleştirilmemiş bir başarıdır. Lc3-GFP transgenik zebra balıkları, hücre içi Chlamydia'ya lc3-pozitif otofagosomların gerçek zamanlı ve in vivoya yönelik katılımını gözlemlemek amacıyla enfekte edilmiştir. Otofajiyi karakterize etmek için P62 morfo ile işlem görmüş larvalara Chlamydia enjekte edilmiştir. Kontrol morfo larvaları normal septin kafes yapıları göstermiştir.Ancak, P 62 morpho ile işlem görmüş larvalarda chala'ya septin alımı azalmıştır; bu durum, P 62'nin otofaji mekanizması için temel bir bileşen olduğunu göstermektedir. Enfeksiyon süreci bir kez kavrandıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde uygulandığında PHI larvası bir ila iki gün içinde tamamlanabilir. Zebrafish genomunu manipüle etmek için CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak genom düzenleme gibi diğer yöntemler de kullanılabilir. Ayrıca, canlı görüntüleme tekniğiyle jel enfeksiyonu sırasında otofaji hücre iskeleti dinamiklerini gerçek zamanlı olarak takip etmek için yeni floresan hedefli zebrafish hatları geliştirilebilir.Chaga Septin kafesi, otofaji sitoskelet etkileşimlerini incelemek için kullanılmış ve enfeksiyon ile hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, otofajide sitoskeletin yeni rollerini aydınlatmalarının önünü açmıştır. Ella ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken ikinci seviye laboratuvar ortamında çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. CLP kaynaklı sepsis bağlamında in vivo Otofaji değerlendirmek için mevcut protokoller burada sunulmuştur: (GFP)-LC3 fareler kullanılarak Otofaji ölçülmesi için bir protokol ve elektron mikroskobu ile autophagosome oluşumunu ölçmek için bir protokolü.

Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Sunulan iki antikor tabanlı protein-protein etkileşimi araştırma tekniği vardır: ayirt ve immunoprecipitation. Bu teknikler proteinlerin hücresel sinyal yollar roman bileşenleri keşfi ve anlayış protein dinamikleri arasında fiziksel etkileşimleri çalışmak için uygundur.<br...

Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

Burada, kalsiyum (Ca2 +) yanıt Shigellatarafından enfekte HeLa hücreleri tarafından elde edildi görselleştirmek için protokolleri mevcut. Bakteriyel enfeksiyon parametrelerini optimize ve Ca2 + floresan problar ile görüntüleme, enfeksiyon kinetik büyük bir aralığı içinde bakteriler tarafından indüklenen atipik küresel ve yerel Ca2 + sinyalleri karakterize edilmektedir.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

Keşfedin Shigella flexneri enfeksiyonunda otofaji-sitoiskelet etkileşimlerini in vitro hücre kültürü ve canlı zebra balığı larvaları kullanarak. Septin kafesleri ve bakteri kısıtlama mekanizmalarını gerçek zamanlı görüntüleyin.

Kullanımı

Daha fazla video keşfet