Için Amelogenin-kitosan hidrojelin geliştirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, yüzeysel mine rekonstrüksiyonu için bir AMLO ve kitosan hidrojeli üretme protokolü geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle asitlenmiş diş dilimlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, taze AMLO ve kitosan hidrojeli hazırlanır.

Ardından, diş kesit yüzeyine AMLO ve kitan hidrojeli uygulanır. Son olarak, yapay tükürük içerisinde AMLO kizen hidrojeli ile diş minesinin yeniden büyümesi sağlanır. Nihayetinde, yeni oluşan tabakanın mekanik dayanıklılığını ve doğal mineye bağlanma durumunu değerlendirmek için ultrasonik işlem ve nano indentasyon kullanılabilir.

Bu tekniğin etkileri, hem yetişkinlerde hem de çocuklarda etkilenmiş diş minesine uygulandığında erken çürük lezyonlarını durduran, çürük nedeniyle kaybolan mineyi yeniden yapılandıran, diş yapısını koruyan ve diş çürüğünün ilerlemesini önleyen bir teknoloji geliştirmemize kadar uzanmaktadır. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Chittar uygulamalı olarak gösterecektir. Herhangi bir restorasyon uygulanmamış çürüğü olan bir insan üçüncü molar diş seçerek başlayın.

Kronu boyuna olarak iki milimetre kalınlığında dilimler halinde kesmek için su soğutmalı düşük hızlı elmas testere kullanın ve ardından moların kök kısmını ultrasonik yöntemle çıkarın. Erozyon lezyonlarını simüle etmek için dilimleri iki dakika boyunca temizleyin ve ardından iyonize su ile üç kez durulayın. İki dilimi %30'luk fosforik asit ile 30 saniye boyunca dağlayın.

Ardından bunları hemen iyonize su ile durulayın. Daha sonra, aşındırılmış dilimleri iki dakika boyunca tekrar ultrasonik olarak temizleyin ve iyonize su ile durulayın.

Üç kez daha. Kazan stok çözeltisini hazırlamak için; önce %1 ağırlık/hacim oranında Kazan'ı %1 hacim/hacim asetik asit çözeltisinde çözün ve ardından 80 °C'de gece boyunca karıştırın.

Çözelti oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, esanı 0,45 mikrometre süzgeçten süzün ve ardından pH'ı 5,0'ye ayarlamak için bir molar sodyum hidroksit ekleyin. Kalsiyum ve fosfat stok çözeltisini hazırlamak için kalsiyum klorürür tartın ve 0,1 molar bir çözelti hazırlayın. Ardından, çözelti berraklaşana kadar vorteksleyin ve bir molar sodyum hidroksit ile pH değerini 11'e ayarlayın.

Ardından diba sodyum fosfatı tartın. 0.1 molar bir çözelti hazırlayın ve çözelti berraklaşana kadar vorteksleyin. AMLO Genin kaizan hidrojeli hazırlamak için, 200 mikrogram rekombinant porsin AMLO genin içeren bir tüpe, taze hazırlanmış %1esan çözeltisinden 960 mikrolitre ekleyin.

Ardından, çözelti berraklaşana kadar vorteksleyin. Şimdi, AMLO içeren ozan çözeltisine 25 µL 0.1 molar kalsiyum klorür çözeltisi ve ardından 15 µL 0.1 molar sodyum fosfat diba çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi beş dakika boyunca vorteksleyin.

Ardından, AMLO ve ozan çözeltisinin pH değerini 6,5'e ayarlamak için dikkatlice bir molar sodyum hidroksit ekleyin; pH değeri 6,5'e ulaştığında, AMLO ve ozan üzerinde mine yeniden büyümesini başlatmak için bir hidrojeli olan AMLO ve ozan hidrojeli oluşacaktır. İlk olarak, yapay tükürük çözeltisinin pH değerini bir molar sodyum hidroksit ile 7,0'ye ayarlayın ve çözeltiyi dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra bir şırınga kullanarak, diş kesitinin kenarına yaklaşık 20 mikrolitre AMLO ve chizen hidrojeli uygulayın ve oda sıcaklığındaki bir desikatöre yerleştirin.

İki saat sonra, tükürük çözeltisine 300 PPM sodyum florür ekleyin ve ardından diş dilimini 30 mililitre çözelti içeren bir behere aktarın. Beheri alüminyum folyo ile kapatın ve ardından beheri 37 °C'deki bir fırına yerleştirin. Son olarak, üç ila yedi gün sonra diş dilimini çıkarın ve AMLO ile chizen hidrojeli tarafından onarıldıktan sonra kuruması için oda sıcaklığında bir desikatöre yerleştirin; yedi gün sonunda, aşındırılmış mine yüzeyinde 15 µm kalınlığında mine benzeri bir tabaka oluşur.

Yeni büyütülen tabaka, yüzeye dik olan c ekseni boyunca öncelikli olarak büyüyen, yaklaşık 50 nanometre çapında, yüksek derecede düzenli kristal dizilerinden oluşmaktadır. Bu iğne benzeri kristallerin, doğal diş minesinin temel birimlerine benzer demetler şeklinde organize oldukları dikkat çekicidir. Onarılan tabakanın seçili alan elektronleleksiyona (SAED) görüntüsü, yeni büyüyen kristallerin hiyerarşik dizilimini ortaya koyan yay şeklinde bir desen sergilemektedir.

0 0 2 yönü boyunca yapılan X-ışını kırınımı analizi, yeni büyütülen tabakanın, taramalı elektron mikroskobu ve seçilmiş alan elektron kırınımı gözlemleriyle uyumlu olarak kristalografik C ekseni boyunca hizalanmış apatitten oluştuğunu doğrulamaktadır; bu görüntüde, yeni büyütülen tabaka ile doğal mine arasındaki arayüzün mikro yapısı gösterilmektedir. Yeni büyüyen kristallerin orijinal mine kristalitiyle aynı yönde büyümediğine ve protein aracılı apatit büyümesinin, yeni büyüyen kristallerin doğal mine kristallerine göre dik bir yönelim sergilemesine neden olduğuna dikkat ediniz. Yeni büyütülen tabaka ile mine substrat arasındaki arayüzde belirgin bir boşluk bulunmamaktadır.

Nanoscale düzeyde, mine ve yeniden büyüyen kristaller, kesintisiz bir arayüz oluşturacak şekilde birbirine kaynamıştır. 10 dakikalık ultrasonik işlemden sonra, AMLO Genin kito hidrojelinde yeni büyüyen tabaka hala mine yüzeyine sıkıca bağlıdır ve am mologen içermeyen tizen hidrojel ile işlem görmüş örnek için organize yapı korunmuştur. Bununla birlikte, yeni büyüyen tabaka ile doğal mineyi net bir şekilde ayırt edebilmek için mine ile onarılan tabaka arasında geniş bir boşluk gözlemlenmiştir.

Bu deneyde, yeni büyüyen tabakadaki AMLO genin immünofloresan olarak işaretlendi ve AMLO genin varlığı, yeni büyüyen tabaka içindeki yeşil floresans ile doğrulandı. Grafikte gösterildiği üzere, asit aşındırma sonrası mine yüzeyinin sertliği ve modülü sırasıyla yaklaşık %98 ve %88 oranında azalmaktadır. AMLO genin içermeyen ozan hidrojeli ile işlem gören kontrol grubu, hem sertlikte hem de modülde yalnızca sınırlı bir iyileşme göstermektedir.

Buna karşılık, AMLO ve ozan hidrojellerinde mineralizasyon sonrası, gelişimden sonra modülde yaklaşık dört kat ve sertlikte dokuz kat artış gözlemlenmiştir. Bu protokol, in vivo ve modellerdeki ileri değerlendirmelerde, erken çürük mesafesi ve erozyon gibi mine defektlerinin tedavisine yönelik bir teknoloji tasarlamak için genişletilebilir.