Name: Proteomik ve Transkriptomik Analizleri Spiderlardan Venom çıkarımı ve Venom Bezi Microdissections (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin örümceklerden elektriksel stimülasyonla zehir çıkarımı ve zehir bezi mikrodiseksiyonu yöntemlerini. Proteomik ve transkriptomik analizler için bu sistematik protokol, biyolojik araştırmalarda gen ifadesi çalışmalarına temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ben bu protokolün geliştirilmesi onların yardım için aşağıdaki kişilere teşekkür: Chuck Kristensen, Greta binford&#39;un, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier ve Mays Imad. Kütle spektrometresi ve proteomik verileri AZCC için SWEHSC, NIH / NCI hibe CA023074 için NIEHS hibe ES06694 tarafından desteklenen Arizona Proteomiks Konsorsiyumu tarafından ve Arizona Üniversitesi BIO5 Enstitüsü tarafından satın alındı. Bu iş için fon Jessica E. garb hibe 1F32GM83661-01 ve 1R15GM097714-01 gelen Sağlık Ulusal Enstitüleri (Genel Ulusal Tıp Enstitüsü) sağlandı.

Elektro-stimülatör Aparatı 1. Hazırlık <ol><li> Çıkış ve harici sinyal girişi için harici ayak pedalı takmak için elektro-stimülatör güç kablosunu bağlayın. Not: Elektrik telleri uygun şekilde yalıtılmış olmalıdır ve açıkta kalan metal teslim cari dokunulmaması gerekir. Koruma için lateks veya nitril eldiven giyin. Güç kablosunu bağlamadan ve telleri takarken Elektro-stimülatör güç anahtarı KAPALI konumunda olmalıdır. </li><li> Elektro-stimülatörü kırmızı çıkış terminaline pozitif elektrot bağlamak (kutupluluk anahtarı normal modda iken) ve siyah çıkış terminaline negatif elektrot bağlamak. Not: Her bir elektrot teli, bir timsah klibi sona gerekir. </li><li> Aşağıdaki önerilen başlangıç ​​ayarlarına uyarıcısı: gerilimi = 7 V, saniyede Frekans = 1 bakliyat, gecikme = 0 milisaniye, süresi = 200 milisaniye, ikiz bakliyat kapalı = düzenli geçiş ve mod anahtarı. </li><li> Voltme için timsah klipleri takarak elektrotların Test çıkışıter pozitif ve negatif test iletkenleri. Uyarıcısı güç anahtarını açın ve ayak pedalı ile akım sağlamak. </li></ol> Tutturma Forseps ve Diğer Malzemelerin 2. Hazırlık <ol><li> Sıvı plastik kaplama içine tüy forseps ayaklarından birini batırın ve kaplama kuruması için dört saat bekleyin. Sıkıca pamuk dikiş ipliğinin tek bir tabaka ile karşı dişin ucu 15 mm sarın ve bir düğüm ucunu bağlayarak konuyu sabitleyin. Not: Plastik kılıf, mevcut geciktirilmesi için yalıtımı sağlarken iplik, elektriksel iletkenlik teşvik uygulanan bir tuzlu su çözeltisi emmek için kullanılır. </li><li> Keskin bir makas ile künt derialtı iğne ucu kesilmiş ve zımpara kağıdı ile açılış pürüzsüz. Boru aracılığıyla bir vakum atık tuzak (örneğin, vakum filtre şişesi) için iğne takın. Not: iğne suyunu emme ve kusar ve stimülatör elektrotlar tarafından oluşturulan devreyi tamamlamak için hizmet edecek edecektir. İğne açılış must tıkanma olmadan vakum çözüm henüz yeterince büyük, örümceğe zarar vermemesi için yeterince küçük olması (örneğin, 25 G göstergesi x 1 ½, Malzeme Listesi bakınız). </li><li> Pozisyon tüy gibi forseps yatay olarak üst üste forseps plastik kaplı dişli görünümünde bir kesme mikroskop alanının altında manyetik bir baz ya da sabit bir tek cihaz ile tespit edilen bir vinil kaplı iki uçlu bir kelepçe ile sıkıca kapalı bir pozisyonda, giriş ve iplik alt çatal kaplanır. Not: iki uçlu bir kelepçe, bir kıskacı tutucusu ile manyetik tabanına sabit bir konumda muhafaza edilir (Malzeme listesi). Bir lastik bant sıkı bir kez ortaya örümcek çevresinde kapalı bir pozisyonda Hafif olan forseps tutmak için ek baskı eklemek için, kelepçe sahibine, tüy gibi hafif forseps sivri uçların yaklaşık tutturulabilir. </li><li> Ipliğin yukarı forseps &#39;alt çatal pozitif elektrot timsah klibi takın ve metal vakum iğne künt olumsuz timsah klip ekleyin. </li&gt; <li> Iplik ve timsah klibi ve künt vakum iğne üzerinde olumsuz kurşun yerleştirerek arasında forseps çatal üzerinde olumlu kurşun koyarak voltmetre ile akım test devresi. Basın ayak pedalı yeterli akım tespit sağlamak ve yeterli akım tespit edilirse potansiyel kaldırmak için. </li><li> Venom toplanması için birkaç microcapillary tüpleri hazırlayın. Bir Bunsen beki alev üzerinde yatay forseps tutulan ucunu yerleştirerek, eldivenli el ile bir ucunda ve steril metal forseps ile diğer ucunda bir tek microcapillary tüp tutun. Hareketsiz bir konumda diğer ucunu tutarak, uzakta uzun bir ipucu oluşturmak alevden metal forseps ile mikro-kılcal çekin. Not: mikrokapillerler kolayca kırabilir gibi koruyucu gözlük takmalıdır. </li><li> Bir petri çanağı içinde bir montaj macun şeridi hazırlanmış mikrokapilerler bekletin. Microcapillary bir mikroskop altında biter incelemek ve sterilize metal forseps ile çekti sonunda küçük, eğimli açıklığı oluşturmak. </li><li> Lasteril 0.5 ml tüp bel değişken sayısı. Tüpler, steril, steril, de-iyonize su ekleyin (örneğin, otoklavlanmış iyonu giderilmiş suyun 5 ul). Yakın tüpler ve buz üzerinde yer tüpler. </li><li> Bir çanak içinde tuz çözeltisi hazırlayın ve otoklavlanmış su ile ikinci bir beher doldurun. </li></ol> Forseps içinde Spider 3. İmmobilizasyonu <ol><li> CO 2 tankı açmak ve kapalı plastik toplama viyalden örümcek aktarmak uzun metal forseps kullanarak CO içine 2 odasını (Malzeme Listesi bakınız). Not: kara dul örümcekleri tehlikeli zehir var; Her zaman bu protokol sırasında eldiven giyin. </li><li> 5-10 dakika kadar veya odasındaki örümcek tutmak anestezi ve hafifçe uzun forseps ile kışkırtılması artık hareket. Tuzlu su çözeltisi ile forseps iplik ıslak transfer pipet kullanın. Not: kara dul CO 2 anestezi parametrelerle ilgili yönergeler için, Spagna ve Moore 19 bakın. </li><li> CO 2 anestezi örümcek AlKünt diseksiyon forseps ve eldivenli ellerini kullanarak ön bacakları bunu toplayıp odası. Forseps cihazı tüy siklet için anestezi örümcek taşıyın. Kapalı tüy forseps ayrı sivri uçların ve dişleri arasında örümceğin Cephalothoraks yerleştirin ve uçlarının yerinde sıkıca tutulur ama ezilmekten değil örümcek sağlamak için kapatma kapatmak için izin verir. Pozitif elektrot alt çatal bağlı kalırken, örümcek ipliğinin kaplı çatal dinlenme, (örümcek anatomisine kılavuz için Foelix 20) aşağı karapas Sırt tarafı yerleştirilir ve karapaksta en ventral tarafı plastik kaplama dönük olduğundan emin olun. Örümcek tutarken hızlı bir şekilde çalışın. </li><li> Örümcek keliserin kadar mikroskop büyütme, odak ve ışık kaynağı diseksiyon ayarlayın ve dişlerini açıkça görülebilir. </li></ol> 4. Venom Koleksiyonu <ol><li> Vakum açın ve ikinci bir künt uçlu şırınga n kullanarak su çözeltisi ile örümcek keliserin spreyeedle. Kirleri çıkarmak için vakum iğne ile su uzakta emme. </li><li> Örümcek kürsü bağlanmış negatif elektrotlu vakum iğne dokunun ve ayak pedalı, bir ya da daha çok kez darbe sağlar. Gerekirse Vakum uzak kusar. Not: örümcek kürsü keliserin ve endites (ayrıntılı örümcek anatomi için Foelix 20) arasında dorsal yüzeyinde keliserin ağız posterior içindedir. Not: her darbenin ile örümceğin bacakları sözleşme ve zehir dişlerini ortaya çıkan berrak damlacıklar olarak görünür olacaktır. </li><li> Toplayın venom (çözüm kılcal emilecek) su veya tampon çözeltisi ile 0.5 ml tüp içine microcapillary ucu ve transfer kılcal ucu ile damlacıklar. Not: Hemolimf kirlenme ve ölüme yol açabilir kılcal örümcek delinmesiyle önlemek. Ayrıca memecikten ipek ve tutkal ile kılcal kirlenmesini önlemek. </li><li> Ve d (son toplama ucu yanda) mikro-kılcal için tüp adaptörü ile transferi şırınga takıngeri tüpe ispense zehir çözüm. Buz üzerinde tüp koyun. Not: yakındaki bir kabın içinde atık kılcal bertaraf edin. </li><li> Örümcek yakın olan kapağı ile birlikte, açık plastik toplama şişe yerleştirin. Künt diseksiyon forseps bir elle tutulacak ve dikkatle açık tüy künt forseps ve hızlı bir şekilde yakın kapakla şişeyi toplama içine örümcek kayar, diğer elinizle prongları forseps ile dikkatlice örümcek bacakları kavramak. Bittiğinde -80 ° C derin dondurucuda sonraki örümcek ve mağaza zehir içeren tüpler ile devam edin. Not: geri şişenin içine forseps örümcek taşırken dikkatli kullanmaya devam etmektedir. Emin toplama şişe ve kapak hızla transferi için örümceğe yakın olduğundan emin olun ve eldiven giyin. </li></ol> 5. Venom Bezi Diseksiyonlar <ol><li> İki-üç gün zehir toplama sonra, CO 2 odasını (adım 3.1) örümcek uyutmak. Diseksiyon mikroskop yanında sıvı azot taşıyıcı ve yerini doldurmak. Not: whtr sıvı azot, kullanımı göz koruması ve kriyojenik eldiven ile çalışıyor. </li><li> Temiz bir diseksiyon alanı ve RNaz ve DNA kontaminasyonu ortadan kaldırır çözeltisi ile diseksiyon forseps. Tampon (örneğin, 1x tuzlu-sodyum sitrat (SSC) tamponu) diseksiyon mikroskop diseksiyon altına yerleştirilen küçük bir petri doldurun. </li><li> CO 2 odasından Transfer örümcek petri kabına ve hızlı bir şekilde karın Cephalothoraks ayırmak için forseps kullanın. </li><li> Forseps ile mikroskop altında Cephalothoraks tutun ve görüş alanına keliserin yerleştirin. Keliserin lateral yönleri için kabuğunu katılmadan kütikül kesmek için forseps bir ikinci çift keskin uçları kullanın. Yanal forseps ikinci çifti kullanılarak keliserin kavramak, ve zehir bezleri çıkardı kadar yavaşça ileri ve geri çekiyorum. </li><li> Keliserin ayrı bezleri cyrosafe 0.5 ml tüp ve transfer (veya ayrılmak istenirse keliserin bağlı). Yeri clossıvı nitrojen içinde ed tüpü. Not: Her diseksiyon fazla 15 dakika sürer. </li><li> Bitene kadar ek örümcekler diseksiyon tekrarlayın. -80 ° C dondurucu içine sıvı azot transfer tüpleri. </li></ol>

<ol><li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicogenomic+multiverse%3A+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genom.+Hum.+G%22%5BJournal%5D)">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li>
<li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venomics%3A+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li>
<li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides%3A+An+emerging+class+of+drug+leads%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Disc%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li>
<li>Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+cocktails%3A+the+evolutionary+novelty+of+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li>
<li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+aspects+of+spider+bites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li>
<li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li>
<li>Silva, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso%2FTeneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li>
<li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ziconotide%3A+an+update+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li>
<li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+paint%3A+a+chlorotoxin%3ACy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li>
<li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution%2C+functional+variation%2C+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li>
<li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+%CE%B1-latrotoxin%2C+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li>
<li>Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , Available online at:
 
 <a target="_blank" href="http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html">http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html</a> (2013).</li>
<li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li>
<li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider-venom+peptides%3A+Structure%2C+pharmacology%2C+and+potential+for+control+of+insect+pests%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li>
<li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+landscapes%3A+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li>
<li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li>
<li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li>
<li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+activity+of+a+novel+%CE%B1-latrotoxin+from+red-back+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li>
<li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+%28Arachnida%3A+Theridiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pan-Pac.+Entomo.+l%22%5BJournal%5D)">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li>
<li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoelix%2C+R+%22Biology+of+Spiders%22">Biology of Spiders</a>. , Oxford University Press. (2010).</li>
<li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366(2014).</li>
<li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+%28latrodectin%29+which+co-purifies+with+the+%CE%B1-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+%28Theridiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li>
<li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+%28Latrodectus+tredecimguttatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li>
<li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li>
<li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+%28Agelenidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li>
<li>Alape-Girón, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper%3A+geographic%2C+individual%2C+and+ontogenetic+variations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li>
</ol>

Yazar ifşa hiçbir şey ve hiçbir rakip mali çıkarları vardır.

Zehirleri bir fizyolojik açıdan reaktif proteinler, peptidler ve ilaç keşfi için uygulamaları ile diğer moleküllerin önemli bir kaynak, yanı sıra hücre ve ekolojik araştırma 1-3 temel alanlarını temsil etmektedir. Bununla birlikte, özellikle tehlikeli veya küçük hayvanların zehir toplama, zor bir iştir. Bu protokol zehir ve zehir bezleri kara dul örümcekleri alınabilir nasıl gösteriyor ve zehirinden klonlanmış zehir mudpit analizi ve cDNA&#39;lann türetilen bir protein veritabanının bir kombinasyonu yoluyla, bu yaklaşımın başarısını 21 bezleri doğruluyor. Bu protokol kara dul ve orta ölçekli örümcekler, için iyi çalışırken diğer zehirlerden toplama teknikleri ancak, bu pipetler örneğin, 24. Bu ikinci yaklaşım bardağa köpekdişlerimden zehir direkt aspirasyon gibi büyük mygalomorph (tarantula gibi) örümcekler için istihdam edilmiştir , aggressi olmayan küçük ölçekli örümcekler için iyi çalışmazA.Ş.. Daha rutin, tutarlı ve hızlı olur böylece burada anlatılan zehir toplama protokolünün bir özellikle kritik yönü toplama sürecinin hazırlanması ve optimizasyonu başlangıç ​​yılıdır. Protokol master başlangıçta zor olduğunu, ancak tekrarlanan denemeler ile, daha kolay ve daha hızlı hale gelir. Dikkat da tehlikeli örümcekler işleme, elektrik akımı, ince nokta cam mikro kılcal damarlar, ve şırınga iğneleri ve kullanımını içeren tüm kritik aşamalarında zorlanmaktadır. Bu mikro kılcal damarları şekillendirirken gözlük yanı sıra, nitril eldiven, laboratuvar önlüğü, uzun pantolon ve kapalı ayakkabı gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giymek önemlidir. Zehir toplama bir başka zorlu yönü tutarları li olabilir topladığı herhangi bir örümcek, özellikle Latrodectus türler tarafından üretilen zehirin az miktardaen iyi kişi başına 1-2 mikrolitre çokluğundan. Böyle bir protein jeller ya da işlevsel tahlilleri gibi alt uygulamalar için yeterlidir zehir elde edilmesi bir tüp içine birden fazla bireyden zehrin kombinasyonu da gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, zehir sadece aynı cinsiyetten, ontogenetik sahnenin kişilerden kombine edilmeli ve nüfus bazı zehirlerinin 25, 26 yılında, interseks gelişimsel ve coğrafi değişkenlik tanınmalı. Örümcekler de az miktarda bezinin son tükenmesi yansıtıyor olabilir bireyler, arasında üretilen zehir miktarı ciddi çeşitlilik gösterebilir. Böylece son beslenmeden sonra zehiri birkaç gün toplamak için tavsiye edilebilir. Biraz zehir bırakılırsa, aşırı akım hemolimfi veya ölüm zehir kirlenmeye yol, manikür yırtılmasına neden olabilir örümcek, uygulanan olmamalıdır. Örümcek si ile zehir örneklerin kirlenmesilk veya insan kaynakları da steril veya temiz ekipman kullanımı ile kaçınılmalıdır. Bu zorluklara rağmen, saf zehir toplama, canlı örümcek bırakarak, (diğer hücresel proteinlerden zehiri bileşenleri ayrı değil) ve örümcek öldürmek bezi homojenatlarından zehir elde yöntemler tercih edilir. Bu örnekleri hızlı bir şekilde protein parçalanmasını önlemek için dondurulmuş sağlamak için de önemlidir. Venom ekstraksiyon, böylelikle zehir bezlerinde zehir gen ifadesini uyarıcı, sonraki zehir yapımını arttırır. Örümcekler zehir tükenmesi hayatta kalmak için bu protokol sağlar çünkü, bu nedenle, bezler disseke edilebilir birkaç gün sonra zehir gen ifadesi böyle transkript 10,11 klonlama gibi genetik çalışmalar için yeterli olması beklenen bir noktada (örümcek öldürme). Birçok önemli tedbirler de zehir bezi disseksiyonlarında alınmalıdır. Vurgu laboratuar donatı kullanılarak konulmalıdırent ve RNA aşağılamak RNases ücretsizdir reaktifler. Böylece RNaz ve DNA kontaminasyonu tamamen ortadan kaldırmak çözümler forseps ve diğer non-tek cihaz ve yüzeylerin silinmesi için tavsiye edilir. Disseksiyonları ayrıca doku RNA bütünlüğünü sağlamak için mümkün olduğunca çabuk ve doğrudan donmuş olarak yapılmalıdır. Bunların cephalothoraks ve karın hızlı bir şekilde ayrılır sonra son olarak, diseksiyon sadece anestezi örümcek üzerinde gerçekleştirilmelidir. Sonuç olarak, bu makalede örümcek zehir ve zehir bezleri elde etmek için doğrulanmış bir protokol sağlar. Zehir ve venom bezleri proteomik ve transkriptomik yaklaşımlar kullanılarak, protein ve peptid bileşenlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için izin verir. Buna ek olarak, zehir numuneler bileşen moleküllerinin biyomedikal ve farmakolojik potansiyelini belirlemek fonksiyon deneyleri, başlangıç ​​noktasını temsil edebilir. Neredeyse bütün örümcekler zehir üretirler ve geniş dalgıçbireysel türler tarafından sentezlenen zehiri bileşenlerinin versitesi zehir moleküllerin geniş bir çeşitlilik henüz 13 keşfedilmeyi ileri sürüyor. Bu duruma göre, bu protokol, örümcek zehirleri bulunan biyolojik olarak aktif moleküllerin zengin bir kaynak araştırmak için araçlar sağlar.

Zehirleri ağırlıklı predasyon ve savunma amaçlı başka bir hayvana enjekte hayvan salgılar, ve, aynı zamanda biyomedikal alaka 1-3 önemli biyolojik uygulamaya sahiptir. Sadece bazı hayvanlar zehir sentezler, ancak bu evrim bağımsız çünkü üretim, omurgasızlar (örneğin, cnidarians, konik salyangoz, akrep ve örümcek) ve omurgalıların (örneğin, yılan, bazı balık ve memeliler) arasında taxonomically yaygın birden çok kez 1,4 . Zehirlerinin biyokimyasal karakterizasyonu tipik olarak, büyük oranda hızla kimyasal maddeler, 1 sunmak için enjekte edilen hayvanların dolaşım ve sinir sistemleri üzerinde etki, protein ve peptid çok çeşitli oluşmaktadır göstermektedir. Hayvanların zehirli küçük bir kısmı insanlarda, synanthropic dağılımları 5 ile özellikle türler için bir tehdit oluşturabilir. Zehir kompozisyon ve fonksiyonel aktivitelerin çalışma önemli bir rol oynadığıOmurgalı hücresel bileşenlerin (özellikle nöronal iyon kanalları) 6 ve temel hücresel süreçleri (örn Nörosekresyon) 7 durulaştırmada fonksiyonel karakterizasyonu. Ayrıca, seçim venom peptidleri kanseri ve ağrı 8,9 için tedavi olarak kullanımları da dahil olmak üzere, biyomedikal bağlamlarda faydalı özelliklere sahiptir ve aday ilaç potansiyel ve antivenomu geliştirilmesi için çıkartılmaktadır. Zehirleri de böylece bu tehlikeli sekresyon toplanması birçok yarar vardır, ekolojik ve evrimsel araştırma 1,4,10,11 belirgin rol oynarlar. 40,000 tarif örümcek (Sipariş Araneae) türleri ve köpekdişlerimden 12 feshetme zehir bezleri eşleştirilmiş sahiptirler 100&#39;den fazla örümcek ailelerinden birinin ancak tüm&gt; vardır. Örümcekler yüksek tür çeşitliliği onlar zehirli organizmaların büyük clade temsil ettiğini göstermektedir. Ancak, örümcek zehirlerinin biyokimyasal karakterizasyonu vardır largely genellikle insan sokmalarının ile bağlantılı türlerin az sayıda konsantre edildi. Örümcek zehirlerinin son proteomik ve Transkriptomik çalışmalar bunlar genellikle birçok benzersiz proteinler ve peptidler 2,13,14 içerdiğini gösterir. Yüksek verimli cDNA dizileme ve kütle spektrometresi peptid parmak izi gelişmeler büyük ölçüde bu zehir proteinlerin 15 keşfini kolaylaştırdı. Yine de, böyle iş gibi tekniklere yönelik yeterli zehir ve / veya örümceklerin zehir bezlerinde ve detaylı belgelere koleksiyonu ile başlar 16 birkaçıdır. Bu kağıt benzer büyüklükte örümcekler uygulanabilir kara dul örümcekleri gelen zehir ve zehir bezlerinin toplanması için bir protokol sunar. Ayrı bezlerinden venom toplanması diğer hücresel fonksiyonların gerçekleştirilmesi proteinlere karşı zehir salgılanan proteinlerin tanımlanmasını sağlar. Siyah dul ve diğer Latrodectus türler nedeniyle yaygın, bazen bol terleme, kas kasılmaları, hipertansiyon, nefes darlığı ve yamalı felç 5 eşlik insanlarda şiddetli ağrıya sebep olan son derece nörotoksik zehiri, en tehlikeli örümcekler arasında olmak olarak kabul edilmektedir. Burada sunulan zehir toplama protokolü kas kasılmaları ve zehir serbest bırakılmasını temin için anestezi örümcekler elektrik akımını sağlamak için elektro-stimülasyon kullanır. Zehir damlacıkları hızlı bir şekilde mikro-kapiller ile toplandı ve dondurucu depolama için tüpleri içine tevzi edilmiştir. Protokol tehlikeli prosedürleri gerektirdiğinden, sadece iyi eğitilmiş kişiler tarafından yapılmalıdır ve dikkatli kilit aşamada zorlanmaktadır. Toplanan zehir örneğin karakterizasyonu ve fizyolojik deneyler ya da işlevsel deneyler 18 oluşturan moleküllerin 2, izolasyonu gibi çok sayıda kullanımları vardır ve zehir gen ekspresyonunu 11 uyarmak için. Protokol descr ile sona eriyorzehir bezi diseksiyon ve venom özel genlerin klonlanması için yararlı koruma iption, sentezleme üzere, farklı örümcek 10,11 venom azalması takip eden 2-3 gün meydana geldiği gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Sinir ve kas stimülatörü (elektro-stimülatör)&nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td></tr><tr><td>Voltmetre</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>herhangi bir jenerik voltmetre/multimetre ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Sivri Tüy Siklet Forseps</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Ace Hardware'de mevcuttur</td></tr><tr><td>25 G x 1&#189; Hassas Kayma hipodermik şırınga iğnesi</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Vakum filtre şişesi 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>daha küçük şişe boyutları da işe yarayabilir</td></tr><tr><td>Buchner İki Parçalı huni, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 & # 956; l Kılcal Delikler (Mikro kılcal damarlar)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Montaj macun şeridi &nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand'da Mevcuttur Genel Amaçlı Ekstra Uzun Forseps Uzunluk: 11-13/16 inç.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Tamponu, 20x (pH 7.0), Moleküler Sınıf</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>stok kimyasallardan yapılabilir (150 mM NaCl, 15 mM sodyum sitrat)</td></tr><tr><td>Eppendorf kilitli tüpler 0,5 ml tüpler (kriyojenik güvenli)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Sıvı nitrojen tezgah üstü şişe</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away VWR</td><td></td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Ultra İnce Cımbız (diseksiyon forseps)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>benzer yüksek kaliteli ince nokta forseps ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Ayak pedalı/pedalı</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>İki uçlu uzatma kelepçesi, vinil kaplı manşonlu, 8,5 inç</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>benzer modeller ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Kelepçe Tutucu</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>benzer modeller ikame edilebilir, uzatma kelepçesi çubuğunun çapına uygun olmalıdır</td></tr><tr><td>Manyetik taban (uzatma kelepçesini kelepçe tutucu aracılığıyla tutar)</td> <td>VWR</td><td>300042-270</td><td>Uzatma kelepçesini sabit konumda güvenli bir şekilde tutabilen benzer aparatlar ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Plastik Toplama Şişeleri (büyük / 40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk dikiş ipliği</td><td>Joann kumaş ve el sanatları mağazası</td><td>7245855</td><td>benzer ürün ikame edilebilir</td></tr></tbody></table>

proteomik ve transkriptomik analizleri spiderlardan venom çıkarımı ve venom bezi microdissections

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Zehirleri kimyasal genellikle çeşitli fizyolojik faaliyetleri ile çok sayıda proteinler ve peptidler içeren karmaşık salgıları vardır. Zehir proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu hücresel reseptörlere ilaç potansiyel ya da prob belirlenmesi dahil önemli biyomedikal uygulamalar vardır. Örümcekler zehirli organizmaların çoğu türlerin zengin clade vardır, ama sadece birkaç türün zehirleri nedeniyle küçük hayvanların zehrinin dakika miktarlarda toplama ile ilgili zorluk kısmen, iyi anlaşılmaktadır. Bu kağıt Batı kara dul (Karadul) hakkında prosedürünü gösteren, elektrik stimülasyonu kullanarak örümcekler zehir toplanması için bir protokol sunar. Toplanan zehir kütle spektrometresi ile doğrudan protein tanımlama, fonksiyon deneyleri ve transkriptomik çalışmalar için zehir gen ifadesinin uyarılması dahil çeşitli alt analizler için yararlıdır. Bu teknik o iso protokolleri üzerinde bir avantaja sahiptirzehirin bir parçası olarak salgılanan olmayan hücresel proteinlerden hakiki zehiri bileşenlerini ayıramazsınız kepekli bezi homojenatlarının, geç gelen zehir. Örnek sonuçlar kütle spektrometrisi kullanılarak, toplanmış numune bilinen venom peptidleri saptanmasını ortaya koymaktadır. Zehir toplama işlemi sonuçlar, bu sekansı düzeyinde venom ifade edilen proteinlerin ve peptidlerin karakterizasyonuna yol açtığını gösteren sahip örümcek zehir bezlerinin kesme için bir protokol takip eder.

Zehir ve zehir bezi diseksiyonların koleksiyon sık sık sekansı düzeyinde 10,11,15 de zehir proteinler ve peptidler karakterize etmek için yapılmaktadır. Toplanan zehiri da bunların fonksiyonel aktivitelerini 18 belirlemek için fizyolojik deneylerde kullanılabilmektedir. Venom koleksiyon suretle RT-PCR 10,11 aracılığıyla spesifik toksin transkript klonlama kolaylaştırılması, zehir bezi gen ifadesini teşvik edecektir. Zehir proteinlerinin tanımlanması da zehir bezi cDNA kütüphanelerinden 15,21 elde edilen dizi veri tabanları ile bir standart kütle spektrometre yöntemlerinin entegre bir yüksek verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir. İş, zehir ve yukarıda ayrıntılı protokol kullanılarak toplanan bezleri başlayarak etkinliğini gösteren bir örnek, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. Zehir L. toplanan hesperus yetişkin dişiler çözelti içinde bir üzere tripsin ile sindirildi ve tabi tutuldu veTandem kütle spektrometrisi (MS / MS) HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) bağlanan mudpit analizi. İşte mudpit analiz Arizona Proteomiks Konsorsiyumu Üniversitesi tarafından gerçekleştirilmiştir. (Spektrumları anlaşıldığı kızı iyonlar) tespit edilmiştir peptitlerin kütleleri ve ayrışmış fragmanları teorik olarak L yapılmış bir gen sentezleme kütüphanesinden elde edilmiş cDNA dizilerine çevirilerinin tahmin peptid dizileri ile karşılaştırılmıştır hesperus zehir bezleri 21 (bezler diseksiyon protokolü tarafından satın alınmıştır yukarıda açıklanan). Bu deneyde, 36 proteinleri% 99.9 olasılık eşikte toplanan bütün spektrumu ile tespit edildi, ve en az bir peptidi tespit içeriyordu. Tespit edilen proteinlerden biri protein dizisinin (Şekil 1B),% 35 kapsayan, üç özel peptidlere karşılık gelen, 43 toplam spektrumu (Şekil 1A&#39;da gösterilen örnek spektrumlan) tarafından desteklenmektedir. Bir collecte tercüme tespit proteini (<html> d cDNA) L. latrodectin bir üst BLASTP hit vardır Bu deneyde saptanan protein ile amino asit sekansı seviyesinde 2E-46, bir e-skoru tredecimguttatus (GenBank Erişim P49125.1) ve hisse% 80. Aynı zamanda, alfa-latrotoxin düşük molekül ağırlıklı bir protein olarak bilinen Latrodectin, kara dul bilinen bir zehir bileşeni sunulan protokolünün etkinliğini doğrulanması, 22, 23 örümcekler olup. Zehirinden Belirlenen bazı proteinler bu, BLAST isabet bulunursa olan serilerine tekabül etmektedir. Bilinmeyen protein zehir kirletici ifade etmekte ya da, çünkü nedeniyle örümcekler için mevcut olan sınırlı genomik kaynakların yanı sıra bunların proteinleri için sınırlı fonksiyonel bilgilere bir sonucu olup olmadığı açık değildir. Bununla birlikte, gen ya da protein ifadesi gerçek bir zehir bileşen olup olmadığını ortaya koymalıdır diğer dokulara göre zehir bezlerinde böyle bir roman proteinin bolluğu inceleyerek analiz eder. hep &quot;&gt;:&quot; keep-together.within-page = fo &quot;ent <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: kütle spektrometrisi kullanılarak kara dul venomundan tanımlanan Latrodectin peptit (A) &#39;Örnek spektrumları (43 biri) L. mudpit analizi, MS / MS kısmı ile tespit edildi. hesperus B bölümündeki Spectra gösterilen toplanan cDNA dizisinin tahmin edilen çeviri atandı zehiri kütle üstünde harflerle (CGEEDFGEEIVK) ana peptidi parçalanması ile üretilen yatay eksende tespit kız iyonların oranı (m / z) şarj etmek için göstermektedir bölüm A&#39;da spektrumları için kızı iyon kitleler dayalı peptid sırasını gösteren. (B) Protein dizisi, kırmızı kalın göstererek, atanan ve metnin bölüm A&#39;da gösterildiği spektrumları, ek kırmızı metin (kalın değil) dan gelen dizisi vurgulandı Bu protein, bir diğer peptit diğer toplanmış sp ile tespit temsil eder,ECTRA. Protein dizisi kesilmiş zehir bezlerinde elde edilen bir cDNA dizisinden çevrilmiştir.

Bu makale 1 için elektrik stimülasyonu kullanarak örümcekler zehir çıkarılması için bir protokol), proteomik karakterizasyonu yapmak 2) zehir bezi gen ifadesini uyarmak, ve 3) zehirlerinin fonksiyonel çalışmalar yapmak sağlar. Bu gen ifadesi çalışmaları için zehir bezi microdissections bir açıklama ile takip edilmektedir.

Proteomik ve Transkriptomik Analizleri Spiderlardan Venom çıkarımı ve Venom Bezi Microdissections

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Bu prosedürün genel amacı, transkriptomik ve proteomik çalışmalar için örümceklerden zehir ekstre etmek ve zehir bezlerini diseke etmektir; bu işlem, öncelikle elektriksel stimülasyon yoluyla zehir toplamak için gerekli ekipman ve reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, anestezi uygulanmış bir örümceğin diseksiyon mikroskobu altında pens ile immobilize edilmesidir. Ardından, örümceğe elektrik akımı uygulanır ve salınan zehir bir mikro kapiler tüp ile toplanır.Son adım, iki ila üç gün sonra örümceğin zehir bezlerini diseke etmektir. Nihayetinde, zehirde bulunan proteinlerin dizilerini göstermek için zehrin kütle spektrometrisi veya diğer proteomik analizleri kullanılır. Zehir toplama adımları, hızlı ancak dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bir dizi koordineli eylem içerdiğinden öğrenilmesi zor olduğu için, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Başlamak için, bir elektro stimülatör güç kablosunu prize bağlayın ve harici ayak pedalını harici sinyal girişine takın. Ardından, polarite anahtarının normal modda olduğundan emin olun; pozitif elektrodu elektro stimülatördeki kırmızı çıkış terminaline, negatif elektrodu ise siyah çıkış terminaline bağlayın. Daha sonra stimülatörü aşağıdaki önerilen başlangıç ayarlarına getirin.Timsah klipleri pozitif ve negatif voltmetre test uçlarına takarak elektrot çıkışını test edin. Ardından stimülatör güç anahtarını açın ve ayak pedalı ile akım uygulayın. Pensin bir ucunu sıvı plastik ile kaplayarak tüy ağırlığındaki pensi hazırlayın ve kaplamanın kuruması için dört saat bekleyin; plastik kuruduktan sonra, karşıt pens ucunun uç kısmındaki 15 milimetrelik alanı tek kat pamuklu dikiş ipiyle sıkıca sarın ve ipin ucunu düğümleyerek sabitleyin.Ardından, keskin bir makas kullanarak, örümceğe zarar vermeyecek kadar küçük ancak tıkanmayı önleyecek kadar büyük olacak şekilde küt uçlu bir hipodermik iğnenin ucunu kesin. Açıklığı zımpara ile düzeltin ve iğneyi bir vakum atık tuzağına bağlayın. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobunun görüş alanı altında, plastik kaplı çatal üstte ve iplik kaplı çatal altta olacak şekilde, manyetik bir tabana sabitlenmiş vinil kaplı iki uçlu bir kıskaç yardımıyla, hafifletilmiş penseti yatay ve sıkıca kapalı bir konumda yerleştirin.Ardından, pozitif elektrot timsah klipsini ipliğin yukarısındaki alt dişle ve negatif timsah klipsini küt metal vakum iğnesiyle birleştirin. Daha sonra pozitif ucu iplik ile timsah klipsi arasındaki forseps dişine ve negatif ucu küt vakum iğnesine yerleştirin. Voltmetre devresi akımını test etmek için, yeterli akımın tespit edildiğinden emin olmak amacıyla ayak pedalına basın ve koruyucu gözlük takılıyken uçları çıkarın.Zehir toplamak için birkaç adet mikro kapiler tüp hazırlayın. Ardından, bir Petri kabına bir montaj macunu şeridi yerleştirin ve mikro kapilerleri bu şeridin üzerine dizin. Eldivenli bir elle tek bir mikro kapiler tüpü bir ucundan tutun, diğer ucunu steril metal pensle bir bunsen beki alevinin üzerinde tutun ve diğer ucu sabit konumda tutarken, uzatılmış bir uç oluşturmak için uç kısmı alevden uzaklaştırarak çekin; mikro kapiler uçlarını bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve sterilize edilmiş metal pensle çekilen uçta küçük, eğimli bir açıklık oluşturun.Tüpleri kapatın ve buz üzerine yerleştirin. Örümceğin immobilizasyonuna başlamak için CO2 haznesi gazını açın. Ardından, örümceği uzun metal penslerle kapalı plastik toplama tüpünden CO2 haznesine aktarın.Örümceği beş ila 10 dakika boyunca hazne içerisinde tutun ve uzun bir pens ile hafifçe dürtükleyerek örümceğin artık hareket etmediğini kontrol edin. Ardından, pensin ucundaki teli ıslatmak için salin solüsyonu içeren bir transfer pipeti kullanın.Ardından, anestezi altındaki örümceği ön bacaklarından tutarak CO2 haznesinden çıkarın. Künt diseksiyon pensi ve eldivenli eller kullanarak, anestezi altındaki örümceği featherweight pens düzeneğine taşıyın. Daha sonra, kapalı featherweight pensin uçlarını ayırın ve örümceğin sefalik toraksını bu uçların arasına yerleştirin.Örümceğin sıkıca tutulduğundan ancak ezilmediğinden emin olmak için uçların kapanmasına izin verin. Örümceğin, karapas dorsum tarafı aşağıya bakacak şekilde iplik kaplı ucun üzerine oturduğundan ve ventral tarafının plastik kaplamaya dönük olduğundan, pozitif elektrodun ise alt uca bağlı kaldığından hızlıca emin olun. Ardından, örümceğin kelisera ve dişleri net bir şekilde görünene kadar diseksiyon mikroskobunun büyütme odaklamasını ve ışık kaynağını ayarlayın. Venom toplama işlemine başlamak için vakumu çalıştırın ve örümceğin keliserasını suyla püskürtün.İkinci bir küt uçlu şırınga iğnesi kullanarak, safsızlıkları gidermek için suyu bir vakum iğnesiyle çekin. Ardından, negatif elektrotla bağlantılı vakum iğnesini örümceğin rostrumuna dokundurun ve ayak pedalıyla bir pals uygulayın. Örümceğin bacakları kasılacak ve zehir, dişlerden çıkan şeffaf damlacıklar şeklinde görünür hale gelecektir.Gerekirse geri kusulan maddeleri vakumla temizleyin. Ardından, venom damlacıklarını mikro kapiler uçla toplayın ve kapiler ucu, su dolu 0,5 milliliter bir tüpe aktarın; böylece su kapiler içine çekilecektir. Örümceğin kapilerle delinmesinden ve kapiler ucun spinullerden gelen ipek ve yapışkanla kontamine olmasından kaçının.Ardından, tüp adaptörlü transfer şırıngasını, toplama ucunun karşı ucundaki mikro kılcal tüpe takın ve zehir solüsyonunu tüpe geri boşaltın; tüpü buz üzerine yerleştirin ve zehir içeren tüpleri -80 °C'de saklayın. Zehir toplama işlemi tamamlandığında, kapağıyla birlikte açık bir plastik toplama tüpünü örümceğin yakınına koyun. Hızlı transfer için, bir elinizle tuttuğunuz küt uçlu diseksiyon pensiyle örümceğin bacaklarını dikkatlice kavrayın ve diğer elinizle ince uçlu pensi dikkatlice açın.Ardından örümceği küt uçlu pensle toplama tüpüne kaydırın. Ve kapağı hızlıca kapatın; zehir toplama işleminden iki ila üç gün sonra, örümceği bir CO2 haznesinde anesteziye alın, ardından bir sıvı azot taşıyıcısını doldurup diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin. Diseksiyon alanını ve pensleri RNA away ile temizleyin.Ardından, küçük bir Petri kabını 1x salin sodyum sitrat ile doldurun ve bunu diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Daha sonra, örümceği CO2 haznesinden Petri kabına aktarın ve forseps kullanarak baş-göğüs bölgesini hızla abdomenden ayırın. Ardından, baş-göğüs bölgesini diseksiyon mikroskobunun altında forsepsle tutun ve kolteryumu görüş alanına konumlandırın.İkinci bir pensetin sivri uçlarını kullanarak, karabase'yi colliery'nin lateral kısımlarına bağlayan kütikülü lateral olarak kesin. Colliery'yi ikinci pensetle kavrayın ve zehir bezleri dışarı çıkana kadar nazikçe ileri geri çekin. Bu işlem 15 dakikadan fazla sürmemelidir.Bezleri kömürlükten ayırın ve 0,5 mililitrelik bir kriyojenik tüpe aktarın. Kapatılan tüpü sıvı azota yerleştirin; kütle spektrometrisi tekniklerinin, zehir bezi cDNA kütüphanelerinden oluşturulan sekans veri tabanlarıyla entegrasyonu, zehir proteinlerinin tanımlanmasını sağlamıştır. Laro inept peptit, kütle spektrometrisi kullanılarak kara dul zehrinden tanımlanan 36 proteinden biriydi.Kara dul gibi örümceklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu eldiven giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada kadın kara dul örümcekleri karın ipek üreten bezlerin kaldırmak için etkili bir strateji açıklanmaktadır. Bu prosedür, yedi ayrı ipek üreten, son derece saf bir moda, örümcek ipeği üretimi ve lif montaj inceleyen araştırmacılar için önemli bir süreci bezlerinin hızlı bir izolasyon sağlar.

Black Widow Spider İpek üreten Bezler, Mikrodisseksiyon

Tarama kantitatif, yüksek miktarda ifade ve küçük ölçekli Escherichia coli kültürlerinden füzyon proteinlerinin saflaştırılması için analitik bir protokol tarif disülfid zengin hayvansal protein zehir hedeflerin ekspresyonu uygulanır.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Her ne kadar alt Heteroptera içinde birçok böcekler (Insecta: Hemiptera) zehirli, onların venom kompozisyon ve onların venom toksinleri işlevleri vardır çoğunlukla bilinmeyen. Bu iletişim kuralı heteropteran zehirlerini elektrostimülasyon, taciz ve bezi diseksiyon kullanarak daha fazla karakterizasyonu için hasat yöntemleri açıklar.

Venom toksinlerin Assassin böcek ve diğer Heteropteran böcekler hasat

Burada, deniz anemonundan ham zehir ekstraktı elde etmek ve hemolitik ve fosfolipaz aktivitesini tespit etmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Deniz Anemonlardan Elde Edilen Ham Ekstraktlarda Hemolitik ve Fosfolipaz Aktivitesinin Basit Biyotahlillerle Tanımlanması

Burada, Brezilya sağlık sisteminin talebini karşılamak için sonraki akrep panzehiri üretimi için zehir sağlamak amacıyla büyük ölçekli Tityus serrulatus Lutz ve Mello, 1922 (Brezilya sarı akrep) yetiştiriciliği için başarılı bakım ve zehir çıkarma protokolleri sunuyoruz.

Antivenom Üretimi için Tityus serrulatus'un (Brezilya Sarı Akrebi) Esir Bakımı ve Zehir Ekstraksiyonu

Burada, polietilen film ve amino asit çözeltisi ile oluşturulan yapay bir konakçı kullanarak Trichogramma dendrolimi'den zehir çıkarmak için bir protokol sunuyoruz.

Parazitoid Yaban Arısı Trichogramma dendrolimi'den Yapay Bir Konakçı Kullanarak Zehir Çıkarılması

Bu video, poli-acrylimide jel elektroforezi (PAGE) kullanarak proteinlerin elektroforetik ayrımı için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Elektrik alanların uygulama tarafından bir dizi elektrot - Dijital Mikroakiskan ayrık damlacıklar (ml ~ nL) manipülasyon ile karakterize bir tekniktir. Hızlı, sıralı, minyatür otomatik biyokimya testleri yürütmek için çok uygundur. Burada, birkaç proteomik işlem adımlarını otomatik olarak yetenekli bir platform raporu.

Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Protein ekstraksiyonu mantar türlerinde proteomik analizleri için en az bir proteomik deney (MIAPE) kuralları hakkında bilgi göre, başarılı olmak için standardizasyon yüksek düzeyde gerektirir. Biz toksin indüksiyon ve protein izolasyonu sırasında deneysel önyargı en aza indirmek için bir prosedür içeren bir video protokol...

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Öğrenin örümceklerden elektriksel stimülasyonla zehir çıkarımı ve zehir bezi mikrodiseksiyonu yöntemlerini. Proteomik ve transkriptomik analizler için bu sistematik protokol, biyolojik araştırmalarda gen ifadesi çalışmalarına temel oluşturur.

Proteomik ve Transkriptomik Analizleri Spiderlardan Venom çıkarımı ve Venom Bezi Microdissections

Daha fazla video keşfet