Proteomik ve Transkriptomik Analizleri Spiderlardan Venom çıkarımı ve Venom Bezi Microdissections

Bu prosedürün genel amacı, transkriptomik ve proteomik çalışmalar için örümceklerden zehir çıkarmak ve zehir bezlerini incelemektir, bu, önce elektriksel stimülasyon ile zehir toplamak için gereken ekipman ve reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, anestezi yapan bir örümceği diseksiyon mikroskobu altında forseps ile hareketsiz hale getirmektir. Daha sonra, örümcek akımla vurulur ve salınan zehir bir mikro kılcal tüp ile toplanır.

Son adım, örümceğin zehir bezlerini iki ila üç gün sonra incelemektir. Sonuç olarak, zehrin kütle spektrometresi veya diğer proteomik analizleri, kurucu zehir proteinlerinin dizilerini göstermek için kullanılır. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü zehir toplama adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü bunlar hızlı ama dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bir dizi koordineli eylem içerir.

Başlamak için, bir elektro stimülatör güç kablosunu bir prize bağlayın ve harici ayak pedalını harici bir sinyal girişine takın. Ardından, polarite anahtarının normal modda olduğundan emin olun ve pozitif elektrodu elektro stimülatör üzerindeki kırmızı çıkış terminaline bağlayın ve negatif elektrodu siyah çıkış terminaline bağlayın. Ardından stimülatörü aşağıdaki önerilen başlangıç ayarlarına ayarlayın.

Timsah klipslerini pozitif ve negatif volt metre Test uçlarına takarak elektrot çıkışını test edin. Ardından stimülatör güç anahtarını açın ve ayak pedalı ile akım verin. Bir ucunu sıvı plastikle kaplayarak tüy kadar hafif forsepsleri hazırlayın ve plastik kuruduktan sonra kaplamanın kuruması için dört saat bekleyin, AP karşı çatal ucunun 15 milimetresini tek kat pamuklu dikiş ipliği ile sıkıca sarın ve ucunu bir düğüm halinde bağlayarak ipliği sabitleyin.

Daha sonra, keskin bir makas kullanarak, örümceğe zarar vermeyecek kadar küçük, ancak tıkanmayı önleyecek kadar büyük künt bir hipodermik iğnenin ucunu kesin. Açıklığı zımpara kağıdı ile düzeltin ve iğneyi bir vakumlu atık tuzağına takın. Ardından, tüy ağırlığındaki forsepsleri, plastik kaplı çatal üstte ve iplik kaplı çatal altta olacak şekilde, diseksiyon mikroskobunun görüş alanı altında manyetik bir tabana sabitlenmiş vinil kaplı iki uçlu bir kelepçe kullanarak sıkıca kapalı bir konumda yatay olarak yerleştirin.

Ardından, ipliğin yukarı akışındaki alt uca pozitif bir elektrot timsah klipsi takın ve künt metal vakum iğnesine negatif bir timsah klipsi takın. Ardından pozitif ucu iplik ile timsah klipsi arasındaki forseps çatalına ve negatif ucu künt vakum iğnesine yerleştirin. Volt metre devresi akımını test etmek için, yeterli akımın algılandığından emin olmak için ayak pedalına basın ve koruyucu gözlük takarken uçları çıkarın.

Zehir toplamak için birkaç mikro kılcal tüp hazırlayın. Ardından, bir Petri kabına bir montaj macun şeridi yerleştirin ve mikro kılcal damarları şeridin üzerine yerleştirin. Eldivenli bir el ile bir ucunda tek bir mikro kılcal boru tutun ve diğer ucunu steril metal forseps ile bir bunsen brülör alevi üzerinde tutun ve diğer ucunu sabit bir pozisyonda tutarken uzun bir uç oluşturmak için ucu alevden çekin, mikro kılcal uçları diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve sterilize metal forseps ile çekilen uçta küçük eğimli bir açıklık oluşturun.

Tüpleri kapatın ve buzun üzerine yerleştirin. Örümcek immobilizasyonuna başlamak için CO2 haznesi gazını açın. Daha sonra örümceği uzun metal forsepslerle kapalı plastik toplama şişesinden CO2 odasına aktarın.

Örümceği beş ila 10 dakika boyunca haznede tutun ve örümceğin artık hareket etmediğini kontrol edin. Uzun forseps ile hafifçe dürtün. Ardından, ipliği forseps üzerinde ıslatmak için tuzlu su çözeltisi içeren bir transfer pipeti kullanın.

Daha sonra, anestezi uygulanmış örümceği ön bacaklarından tutarak CO2 odasından alın. Künt diseksiyon forsepsleri ve eldivenli eller kullanarak, anestezi uygulanmış örümceği tüy ağırlığındaki forseps aparatına hareket ettirin. Daha sonra kapalı tüy ağırlığındaki forsepslerin uçlarını ayırın ve örümceklerin sefalik thax'ını tırnakların arasına yerleştirin.

Örümceğin sıkıca yerinde tutulduğundan ancak ezilmediğinden emin olmak için tırnakların kapanmasına izin verin Örümceğin hızlı bir şekilde dorsum tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirildiğinden, iplik kaplı çatala dayandığından ve pozitif elektrot alt çatala bağlı kalırken arabanın ventral tarafının plastik kaplamaya baktığından emin olun. Ardından, örümceklerin cery ve dişleri net bir şekilde görünene kadar diseksiyon mikroskobu büyütme odağını ve ışık kaynağını ayarlayın. Zehir toplamaya başlamak için vakumu açın ve örümcek kömür ocağına su püskürtün.

İkinci bir künt uçlu şırınga iğnesi kullanarak, kirleri gidermek için suyu bir vakum iğnesi ile emdirin. Ardından, negatif elektrotlu vakum iğnesini örümceğin kürsüsüne dokundurun ve ayak pedalı ile bir nabız verin. Örümceğin bacakları büzülecek ve zehir dişlerden çıkan berrak damlacıklar olarak görünecektir.

Vakumlayın, gerekirse kusun. Daha sonra mikro kılcal uç ile zehir damlacıklarını toplayın ve kılcal ucu, kılcal damar içine emilecek olan su ile 0,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Örümceği kılcal damarla delmekten ve kılcal damarın iplikçiklerden ipek ve yapıştırıcı ile kirlenmesini önleyin.

Daha sonra, tüp adaptörlü transfer şırıngasını toplama ucunun karşısındaki uçtaki mikro kılcal damara takın ve zehir solüsyonunu tekrar tüpe dağıtın ve tüpü eksi 80 santigrat derecede buz deposu zehir içeren tüplerin üzerine yerleştirin. Bittiğinde, zehir toplama işlemi bittiğinde, kapağıyla birlikte açık bir plastik toplama şişesini örümceğin yakınına yerleştirin. Hızlı aktarım için, örümceğin bacaklarını bir elinizde tutulan künt diseksiyon forsepsleri ile dikkatlice kavrayın ve diğer elinizle tüy ağırlığı forsepslerini dikkatlice açın.

Daha sonra örümceği künt forseps ile toplama şişesine kaydırın. Zehir toplandıktan iki ila üç gün sonra kapağı hızla kapatın, örümceği bir CO2 odasında uyuşturun, ardından bir sıvı nitrojen taşıyıcısını doldurun ve bir diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin. Diseksiyon alanını ve forsepsleri RNA ile temizleyin.

Daha sonra küçük bir Petri kabını bir x salin sodyum sitrat ile doldurun ve diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Daha sonra, örümceği CO2 odasından Petri kabına aktarın ve sefalik thax'ı karından hızlı bir şekilde ayırmak için forseps kullanın. Daha sonra sefalik thax'ı forseps ile diseksiyon mikroskobu altında tutun ve kömür ocağını görüş alanına yerleştirin.

Karabazı kömür ocağının yanal yönlerine yanal olarak bağlayan kütikülü kesmek için ikinci bir forseps çiftinin keskin uçlarını kullanın. Kömür ocağını ikinci forseps çifti ile kavrayın ve zehir bezleri dışarı çekilene kadar hafifçe ileri geri çekin. 15 dakikadan fazla sürmez.

Bezleri kömür ocağından ayırın ve kriyo güvenli 0,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kapalı tüpü sıvı nitrojen içine yerleştirin, kütle spektrometresi tekniklerini zehir bezi CD NA'dan üretilen dizi veritabanlarıyla entegre edin. Kütüphaneler, zehir proteinlerinin tanımlanmasını sağladı. Laro beceriksiz peptid, kütle spektrometresi kullanılarak kara dul zehirinden tanımlanan 36 proteinden biriydi.

Kara dul gibi örümceklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu eldiven giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.