Proteomik ve Transkriptomik Analizleri Spiderlardan Venom çıkarımı ve Venom Bezi Microdissections

Bu prosedürün genel amacı, transkriptomik ve proteomik çalışmalar için örümceklerden zehir ekstre etmek ve zehir bezlerini diseke etmektir; bu işlem, öncelikle elektriksel stimülasyon yoluyla zehir toplamak için gerekli ekipman ve reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, anestezi uygulanmış bir örümceğin diseksiyon mikroskobu altında pens ile immobilize edilmesidir. Ardından, örümceğe elektrik akımı uygulanır ve salınan zehir bir mikro kapiler tüp ile toplanır.

Son adım, iki ila üç gün sonra örümceğin zehir bezlerini diseke etmektir. Nihayetinde, zehirde bulunan proteinlerin dizilerini göstermek için zehrin kütle spektrometrisi veya diğer proteomik analizleri kullanılır. Zehir toplama adımları, hızlı ancak dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bir dizi koordineli eylem içerdiğinden öğrenilmesi zor olduğu için, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Başlamak için, bir elektro stimülatör güç kablosunu prize bağlayın ve harici ayak pedalını harici sinyal girişine takın. Ardından, polarite anahtarının normal modda olduğundan emin olun; pozitif elektrodu elektro stimülatördeki kırmızı çıkış terminaline, negatif elektrodu ise siyah çıkış terminaline bağlayın. Daha sonra stimülatörü aşağıdaki önerilen başlangıç ayarlarına getirin.

Timsah klipleri pozitif ve negatif voltmetre test uçlarına takarak elektrot çıkışını test edin. Ardından stimülatör güç anahtarını açın ve ayak pedalı ile akım uygulayın. Pensin bir ucunu sıvı plastik ile kaplayarak tüy ağırlığındaki pensi hazırlayın ve kaplamanın kuruması için dört saat bekleyin; plastik kuruduktan sonra, karşıt pens ucunun uç kısmındaki 15 milimetrelik alanı tek kat pamuklu dikiş ipiyle sıkıca sarın ve ipin ucunu düğümleyerek sabitleyin.

Ardından, keskin bir makas kullanarak, örümceğe zarar vermeyecek kadar küçük ancak tıkanmayı önleyecek kadar büyük olacak şekilde küt uçlu bir hipodermik iğnenin ucunu kesin. Açıklığı zımpara ile düzeltin ve iğneyi bir vakum atık tuzağına bağlayın. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobunun görüş alanı altında, plastik kaplı çatal üstte ve iplik kaplı çatal altta olacak şekilde, manyetik bir tabana sabitlenmiş vinil kaplı iki uçlu bir kıskaç yardımıyla, hafifletilmiş penseti yatay ve sıkıca kapalı bir konumda yerleştirin.

Ardından, pozitif elektrot timsah klipsini ipliğin yukarısındaki alt dişle ve negatif timsah klipsini küt metal vakum iğnesiyle birleştirin. Daha sonra pozitif ucu iplik ile timsah klipsi arasındaki forseps dişine ve negatif ucu küt vakum iğnesine yerleştirin. Voltmetre devresi akımını test etmek için, yeterli akımın tespit edildiğinden emin olmak amacıyla ayak pedalına basın ve koruyucu gözlük takılıyken uçları çıkarın.

Zehir toplamak için birkaç adet mikro kapiler tüp hazırlayın. Ardından, bir Petri kabına bir montaj macunu şeridi yerleştirin ve mikro kapilerleri bu şeridin üzerine dizin. Eldivenli bir elle tek bir mikro kapiler tüpü bir ucundan tutun, diğer ucunu steril metal pensle bir bunsen beki alevinin üzerinde tutun ve diğer ucu sabit konumda tutarken, uzatılmış bir uç oluşturmak için uç kısmı alevden uzaklaştırarak çekin; mikro kapiler uçlarını bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve sterilize edilmiş metal pensle çekilen uçta küçük, eğimli bir açıklık oluşturun.

Tüpleri kapatın ve buz üzerine yerleştirin. Örümceğin immobilizasyonuna başlamak için CO2 haznesi gazını açın. Ardından, örümceği uzun metal penslerle kapalı plastik toplama tüpünden CO2 haznesine aktarın.

Örümceği beş ila 10 dakika boyunca hazne içerisinde tutun ve uzun bir pens ile hafifçe dürtükleyerek örümceğin artık hareket etmediğini kontrol edin. Ardından, pensin ucundaki teli ıslatmak için salin solüsyonu içeren bir transfer pipeti kullanın.

Ardından, anestezi altındaki örümceği ön bacaklarından tutarak CO2 haznesinden çıkarın. Künt diseksiyon pensi ve eldivenli eller kullanarak, anestezi altındaki örümceği featherweight pens düzeneğine taşıyın. Daha sonra, kapalı featherweight pensin uçlarını ayırın ve örümceğin sefalik toraksını bu uçların arasına yerleştirin.

Örümceğin sıkıca tutulduğundan ancak ezilmediğinden emin olmak için uçların kapanmasına izin verin. Örümceğin, karapas dorsum tarafı aşağıya bakacak şekilde iplik kaplı ucun üzerine oturduğundan ve ventral tarafının plastik kaplamaya dönük olduğundan, pozitif elektrodun ise alt uca bağlı kaldığından hızlıca emin olun. Ardından, örümceğin kelisera ve dişleri net bir şekilde görünene kadar diseksiyon mikroskobunun büyütme odaklamasını ve ışık kaynağını ayarlayın. Venom toplama işlemine başlamak için vakumu çalıştırın ve örümceğin keliserasını suyla püskürtün.

İkinci bir küt uçlu şırınga iğnesi kullanarak, safsızlıkları gidermek için suyu bir vakum iğnesiyle çekin. Ardından, negatif elektrotla bağlantılı vakum iğnesini örümceğin rostrumuna dokundurun ve ayak pedalıyla bir pals uygulayın. Örümceğin bacakları kasılacak ve zehir, dişlerden çıkan şeffaf damlacıklar şeklinde görünür hale gelecektir.

Gerekirse geri kusulan maddeleri vakumla temizleyin. Ardından, venom damlacıklarını mikro kapiler uçla toplayın ve kapiler ucu, su dolu 0,5 milliliter bir tüpe aktarın; böylece su kapiler içine çekilecektir. Örümceğin kapilerle delinmesinden ve kapiler ucun spinullerden gelen ipek ve yapışkanla kontamine olmasından kaçının.

Ardından, tüp adaptörlü transfer şırıngasını, toplama ucunun karşı ucundaki mikro kılcal tüpe takın ve zehir solüsyonunu tüpe geri boşaltın; tüpü buz üzerine yerleştirin ve zehir içeren tüpleri -80 °C'de saklayın. Zehir toplama işlemi tamamlandığında, kapağıyla birlikte açık bir plastik toplama tüpünü örümceğin yakınına koyun. Hızlı transfer için, bir elinizle tuttuğunuz küt uçlu diseksiyon pensiyle örümceğin bacaklarını dikkatlice kavrayın ve diğer elinizle ince uçlu pensi dikkatlice açın.

Ardından örümceği küt uçlu pensle toplama tüpüne kaydırın. Ve kapağı hızlıca kapatın; zehir toplama işleminden iki ila üç gün sonra, örümceği bir CO2 haznesinde anesteziye alın, ardından bir sıvı azot taşıyıcısını doldurup diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin. Diseksiyon alanını ve pensleri RNA away ile temizleyin.

Ardından, küçük bir Petri kabını 1x salin sodyum sitrat ile doldurun ve bunu diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Daha sonra, örümceği CO2 haznesinden Petri kabına aktarın ve forseps kullanarak baş-göğüs bölgesini hızla abdomenden ayırın. Ardından, baş-göğüs bölgesini diseksiyon mikroskobunun altında forsepsle tutun ve kolteryumu görüş alanına konumlandırın.

İkinci bir pensetin sivri uçlarını kullanarak, karabase'yi colliery'nin lateral kısımlarına bağlayan kütikülü lateral olarak kesin. Colliery'yi ikinci pensetle kavrayın ve zehir bezleri dışarı çıkana kadar nazikçe ileri geri çekin. Bu işlem 15 dakikadan fazla sürmemelidir.

Bezleri kömürlükten ayırın ve 0,5 mililitrelik bir kriyojenik tüpe aktarın. Kapatılan tüpü sıvı azota yerleştirin; kütle spektrometrisi tekniklerinin, zehir bezi cDNA kütüphanelerinden oluşturulan sekans veri tabanlarıyla entegrasyonu, zehir proteinlerinin tanımlanmasını sağlamıştır. Laro inept peptit, kütle spektrometrisi kullanılarak kara dul zehrinden tanımlanan 36 proteinden biriydi.

Kara dul gibi örümceklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu eldiven giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.