Name: Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Öğrenin, yeni doğan farelerden ekstrahepatik safra kanalı kolangiositlerinin izolasyonu ve kültürü için kalın kollajen jellerde büyütme yöntemini. Bu teknik, safra kanalı gelişimi ve patolojileri üzerine araştırmaları ilerletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Sindirim Moleküler Araştırmalar UPenn NIDDK Merkezi Moleküler Patoloji ve Görüntüleme Çekirdek ve görüntüleme yardım için Karaciğer Hastalıkları (P30 DK50306) müteşekkiriz. Bu çalışma (RGW için) Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DK-092111) gelen ve Fred ve Suzanne Biesecker Pediatrik Karaciğer Merkezi&#39;nden hibe ile ve (SK) Çocukluk Karaciğer Hastalıkları Araştırma ve Eğitim Ağı bir burs ile desteklenmiştir.

Aksi belirtilmediği sürece, tüm işlem, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Tüm hayvan çalışmaları yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde insani şartlarda yapılmalıdır. 1.. Ekipmanları hazırlanması ve Çözümler <ol><li> Doku kültürü kaputu ve inkübatör (Şekil 1A) yakın fare cerrahi tablo oluşturdu. Not: Gerekli donanımları bir diseksiyon mikroskobu, bir ışık kaynağı, 12.5 cm uzunluğunda düz iris makası, ince ipuçları ile 6 inç olmayan tırtıklı kavisli bir forseps ve 4 inç kavisli uçları (Şekil 1B) ile tırtıklı forseps içerir. </li><li> Cerrahi masaya% 70 alkol, bir cam beher içinde sterilize aletleri yerleştirin. </li><li> Steril izolasyon medya (Tablo 1) ile üç steril 60 mm Petri kapları doldurun; cerrahi masada iki ve kaput biri, buz üzerinde tüm yerleştirin. </li><li> Sıçan kuyruğu kollajen yerleştirin,10x steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), steril su, steril 1 N NaOH ve doku kültürü kaputu safra epitel hücre (BEC) ortamı (Tablo 1). Not: kollajen buz üzerinde olmalıdır. </li></ol> 2.. Safra Kanalı İzolasyon ve Kültür <ol><li> Bilinçsiz IACUC kılavuzlar (Şekil 1C) başına servikal dislokasyon ile takip kadar karbon dioksite maruz bırakılarak, yaşam 0-3 gün arasında yeni doğan farelerin Euthanize. Not: eski fareler spesifik deneysel gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir. </li><li> Sırtüstü pozisyonda hayvan yerleştirin ve pelvis bölgesinde, orta hattı geçen bir küçük yatay bir kesi yapmak. U şekilli flep oluşturulması, yanal ve yukarı karın her iki tarafını bu kesi uzatın. Karın organları maruz kapağını açın. Karın açıldığında, dikkatle karaciğer ve safra kanalının daha iyi görselleştirme için hayvanın sağ tarafına doğru karın boşluğundan dışarı bağırsak hareket. Not: Karaciğer iyi kimlik elde etmek için göğüs kafesi içine yanal kesiler uzatmak için gerekli olabilir. </li><li> Diseksiyon mikroskobu kullanılarak, ortak safra kanalı, karaciğer, bağırsak ve tanımlamak. Yapıları çok hassas olduğu gibi, dikkatli kullanarak, ilk ortak safra kanalı (Şekil 1D) tanımlayın. Tırtıklı olmayan dişli forseps ile, titizlikle temiz ve safra çevreleyen yağ dahil olmak üzere bağ dokusu koparmak. Kanal ve temizlemek için diğer tutmak için bir forseps kullanın. </li><li> Safra kesesini temizlemek için benzer bir tekniği kullanın. </li><li> Buz üzerinde izolasyon medyanın ilk yemeğin içine temizlenmiş kanallarını ve safra kesesini yerleştirin. Medyada daha fazla bağ dokusu kaldırmak ve safra kesesi safra çıkartırken hafifçe olmayan dişli forseps ile yapıları masaj. </li><li> Izolasyon medyanın ikinci çanak kanallarını ve safra kesesini aktarın. </li><li> 5 hayvanlardan elde edilen kanal ve safra kesesi izolasyonundan sonra, aktarmakaputu üçüncü Petri kabı parçaları. Not: hücreler, en fazla 5 hayvanlardan izole edilecekse, 5 hayvandan oluşan her grup için yeni çözeltiler kullanılarak, gruplar halinde var. </li><li> Doku kültürü kaputu kalın kollajen jeller hazırlayın: Not: herhangi bir boyut çanak kullanılabilir. 5 yeni doğan her bir grup için 3 ml kolajen bir son hacme sahip 60 mm kültür çanağı iyi çalışır. Bu taze izole edilmiş kanalları gömme anda taze hazırlanmalıdır. <ol><li> Buz üzerinde fare kuyruk kolajeni, 10x steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS 10x), steril dH 2 O ve steril 1 N NaOH yerleştirin. </li><li> Kollajen 0.023 katı hacmine eşittir 1 N NaOH hacmi kullanılarak, dH 2 0, 10x PBS, NaOH ve kollajen 1x PBS içinde 2 mg / ml kolajen nihai konsantrasyonuna sahip jeller için gerekli olan miktarlar hesaplayın ilave edildi. Not: kollajen alternatif kaynak kullanılırsa, nötralizasyon ve jel oluşumu için üreticinin yönergelerini izleyin. </li><li> Birlikte dH 2 0, 1 mix0 x PBS, ve 1 N NaOH, daha sonra da karıştırma sağlamak için kolajen ve pipet kuyu ekleyin. </li></ol></li><li> Kolajen çözeltisi, oda sıcaklığında benzeri bir kıvam jel kalınlaştırılmış sonra, hemen kollajen kanalları gömmek. </li><li> % 5 CO2 30 dakika boyunca katılaşması için kolajen sağlamak için, 37 ° C&#39;de inkübatör yerleştirin. </li><li> Jel (beyaz açık renk değişiklikleri), BEC medya (Tablo 1) 3.5 ml ile kaplamayı katılaşmış ve 37 ° C&#39;de inkübe edildikten sonra,% 5 CO 2. </li><li> BEC medya haftada 3 kez kaldırmak ve 3.5 ml taze ortam ile değiştirin. </li></ol> Kalın Kollajen Jeller 3. Isolating İlköğretim Cholangiocytes Not: 3 hafta içinde, cholangiocytes (büyük çekirdekler gömülü kanallarından doğrudan uzanan hücreler) yaprak kalın kollajen görünür olacaktır. Çanak fibroblastların çok sayıda vardır, bu atılmalıdır. Yemeğin bir kaç bölge varsafibroblast büyüme, bu bir bistüriyle kesilip ve önceki cholangiocytes bölme için çıkarılabilir. <ol><li> Ince kollajen jeller hazırlayın: <ol><li> Steril PBS ile 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar kollajen seyreltin. Not: 100 mm tabak için 1 ml kullanmak; Diğer boyut yemekler için buna göre ayarlayın. </li><li> Bir hücre dağıtıcı (büyük yemekleri) veya pipet ucu (küçük yemekler) ile eşit şekilde yayılmış kolajen çözeltisi, daha sonra 10 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> DMEM/F12 plaka kapak ve 37 ° C, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li><li> Inkübatör plakasını çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın. Hemen 1x PBS aspire. </li><li> Plakası döner veya bir çalkalayıcı levha üzerinde yayma kollajen yerleştirerek ikinci bir ince tabaka ile kaplayın. 37 ° C&#39;de, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin. </li><li> Kollajen katılaşan sonra, kapak DMEM/F12 plakası ve 37 ° C, 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li></ol></li><li> Th hücreleri bölmeTran kollajen jeller: <ol><li> Bu yüzer böylece hücre kültürünün bir spatula ya da hücre kazıyıcı ile, plaka kapalı yavaşça kollajen jel kazıyın. </li><li> DMEM/F12 ile 10 mg / ml Tip XI kolajenaz (maddeler listesine bakınız) seyreltilerek kolajenaz çözeltisi hazırlayın. De ve steril filtre karıştırın. </li><li> Kalın kollajen hücrelerin 60 mm tabak başına kolajenaz çözeltisi (yukarıdaki) 1 ml ilave edilir. (3 ml olmalıdır) BEC ortamı çıkarmayın. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe çanak,% 5 CO2. </li><li> Hücreleri içeren çözüm çıkarın ve 15 ml konik bir tüp içinde yer. </li><li> 5 dakika boyunca 2.200 xg&#39;de aşağı spin. Süpernatantı atın ve DMEM/F12 benzer hacminde pelet askıya yeniden. </li><li> 5 dakika boyunca 2,200 x g hızında tekrar çözelti Spin. Süpernatantı. </li><li> 3,% 0.5 tripsin ml ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca,% 5 CO2 inkübe içinde süspanse pelet. Inkübasyondan sonra, çözüm yukarı pipet ve aşağı cholangiocytes bir yaprak kırmak için. BEC medya a 5 ml ekleyin5 dakika boyunca 1500 xg nd sıkma çözüm. </li><li> Daha sonra 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de çözeltisi spin DMEM/F12 süpernatant ve pelet tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Süpernatantı ve BEC medya (Tablo 1) pelet askıya yeniden. Önceden yapılmış ince kollajen jeller üzerinde plaka hücreleri. </li></ol></li></ol> Hücreler 4. Passage ve Depolama Not: Gerektiğinde ince kollajen jeller üzerinde hücreler bölünebilir. <ol><li> Önce 10-15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de% 0.25 tripsin kuluçka için steril PBS ile plakaları yıkayın. </li><li> BEC ortamının bir eşit hacmi ile nötralize ve 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de topak. DMEM/F12 pelet durulayın, daha sonra 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de topak. </li><li> Kollajen kaplı hücre kültürü yemekleri dağıtımı için BEC medyada süspanse edin hücreleri. Not: Alternatif olarak, hücreler, depolama ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve -80 ° C veya sıvı azot dondurucu (Tablo 1) saklanabilir. </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan yenidoğan dahil her yaştan farelerin farelerin ekstrahepatik safra kanallarında saf cholangiocytes izole etmek için bir tekniktir. Teknik ekstrahepatik cholangiocytes intrahepatik cholangiocytes ayrı ele alınabilir ki avantaj sunuyor, ve hücrelerin bu toplumlar arasında önemli farklılıklar tespit çalışmaları kolaylaştırabilir. Biz son zamanlarda bir çalışma demonstrating bu yöntemle izole ve al yanaklı rotavirüs 8 ile enfekte ekstrahepatik cholangiocytes içinde kirpikler azalmıştır yayınlandı...

Intra ve ekstrahepatik cholangiocytes kökeni ve gelişim belirgin farklıdır. Karaciğer ventral foregut endoderm 5 bir divertikül gelişir. Kranial bölge intrahepatik safra yolları 5 üretirken divertikül kaudal bölge, ekstrahepatik safra yolları oluşturur. Intrahepatik kanal cholangiocytes peri portal bölgelerde 6&#39;da duktal plaka çevresinde projenitör hücrelerinden türetilmiştir. Bu hücreler hepatositler veya cholangiocytes 6 ya da içine ayırt etmek yeteneğine sahip. Bu cholangiopathies özellikle cholangiocytes bir kategori hedef olabileceğini verilen önemli klinik etkileri vardır. Alagille Sendromu intrahepatik kanalları etkiler Örneğin, biliyer atrezi başlangıçta, yenidoğanın ekstrahepatik kanalları etkiler. Fare ve sıçan cholangiocytes intrahepatik safra kanalı ve birimlerin tecrit çok açıklamaları vardır. Içindevestigators kanal izolasyon ve sonraki akıbet tarafından tek hücreleri izole veya karaciğer sindirim ve antikor spesifik hücre yüzey belirteçleri 1-4 ifade cholangiocytes aşağı çekme var. Fonksiyonel ve polarize safra kanalı birimleri karaciğer sindirim ve boyut filtrasyon 7 tarafından izole edilmiştir. Safra kanalı tane izole cholangiocytes vitro 1,2 kanalsal yapıların geliştirilmesi için gösterilmiştir ve, uyarı salgılama ve sıvı salgı 7 göstermek için yanıt yeteneğine sahiptir. Bu yöntemlerden Sınırlamalar sindirim enzimleri ile karaciğer perfüzyon için uzman teknik uzmanlık ve özel ekipman ihtiyacı bulunmaktadır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler 3 ile kirlenme riski vardır. Özel olarak neonatal ekstrahepatik safra kanallarının ikinci, ekstrahepatik safra kanalı cholangiocytes izole edilmesi için bir yöntem olup, daha önce tarif edilmemiştir. Bu yazıda yenidoğan a izole etmek için basitleştirilmiş bir teknik özetliyoriyi saflık yüksek seviyelerde yetişkin ekstrahepatik safra kanalı hücreleri olarak var. Bu teknik, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve ekstrahepatik kanalları dahil safra atrezi gibi hastalıkların mekanizmaları araştırma arasındaki farkların çalışma kolaylaştıracaktır.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Yaşam teknolojileri</td><td>11320-033</td><td>500 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitlerle MEM</td><td>Gibco/ Yaşam teknolojileri</td><td>11140-019</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>İnsülin-transferrin-selenyum</td><td>Gibco/ Yaşam teknolojileri</td><td>51300-044</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Na Piruvat</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılır ve 500 &#956; l izolasyonda</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco / Yaşam teknolojileri</td><td>15750-060</td><td>0.2 ml, BEC ortamında ve 500 &# 956'da kullanılır; l izolasyonda</td></tr><tr><td>Etanolamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0.13 ml, BEC ortamında kullanılan</td></tr><tr><td>MEM vitamin çözeltisi</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılan</td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörü</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılır. Çözücü PBS'dir, 5 mg / ml stok konsantrasyonuna karıştırın</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Sığır hipofiz özü</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1.1 ml, BEC ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0.5 ml, BEC ortamında kullanılır, Stok conc 393 &# 956; g / ml etanol</td></tr><tr><td>3 3 ', 5-triiyodo-L-tironin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.5 ml ile seyreltin, BEC ortamında kullanılır, Stok konsantrasyonu 3.4 mg / ml etanol ile seyreltin</td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0.5 ml, BEC ortamında kullanılır, 25 &# 956; g / ml, BEC ortamında kullanılan DMEM F12 +% 1 BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 ml ile seyreltin, 0.411 mg / ml stok konsantrasyonunda kullanın ve DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco / Life technologies</td><td>15290-018</td> 1 ml ile seyreltin<td>, BEC ortamında kullanılır ve 500 & # 956; l izolasyonda</td></tr><tr><td>Sıçan kuyruğu kollajen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>kollajen konsantrasyonuna bağlı olarak değişken</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>10x'te kullanın, steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonuna bağlıdır</td></tr><tr><td>dH 2 O</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonu</td></tr><tr><td>NaOH'ye bağlıdır 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>1 N'ye seyreltin, steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonuna bağlıdır</td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657'den</td> kollajenaz tip XI kullanmadan <td>önce DMEM ve steril filtrede seyreltin</td></tr><tr><td>tripsin-EDTA (1x) %0,25</td> <td>Gibco/ Yaşam teknolojileri</td><td>25200-056</td><td>3 ml, maksimum 10 dakika inkübe edin</td></tr><tr><td>tripsin-EDTA (10x) %</td><td>0,5Gibco/ Yaşam teknolojileri</td><td>15400-054</td><td>3 ml, maksimum 10 dakika inkübe edin</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Diğer modeller kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Işık kaynağı (fiberoptik aydınlatıcı)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Diğer modeller kabul edilebilir</td></tr><tr><td>12,5 cm düz iris makası</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Diğer modeller kabul edilebilir</td></tr><tr><td>6" tırtıksız kavisli forseps ince uçlu</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td></td><td>Diğer modeller kabul edilebilir</td></tr><tr><td>İnce uçlu 4" tırtıklı paslanmaz forseps</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td></td><td>Diğer modeller kabul edilebilir</td></tr></tbody></table>

yenidoğan ekstrahepatik cholangiocytes İzolasyonu

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Karaciğer içi ve ekstrahepatik safra kanalları gelişimsel farklıdır ve farklı şekilde bazı hastalıklar etkilenebilir. Ancak, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve yenidoğan ve yetişkin hücreleri arasındaki arasındaki farklar, iyi anlaşılmış değildir. Intrahepatik safra kanallarının ikinci cholangiocytes izolasyonu için yöntemler de 1-4 kurulmuştur. Bu ayrı cholangiocyte popülasyonları arasındaki farklılıkları anlamak ve ekstrahepatik kanalları hedef gibi görünür, safra atrezi gibi hastalıklara okuyan büyük fayda olacağını, ancak özellikle Yenidoğandan ekstrahepatik duktal hücrelerin izolasyonu, henüz tarif edilmemiştir. Neonatal ve yetişkin fare hem de ekstra-hepatik safra kanalı hücreleri izole etmek için optimize edilmiş bir teknik aşağıda tarif edilmiştir. Bu teknik, fibroblastlar gibi mezenkimal hücrelerden en az kirlenme ile saf bir hücre popülasyonu elde edilir. Bu metod titiz diseksiyon ve yağ ve fibroblast tabakaları kaldırmak için kazıma tarafından takip ekstrahepatik kanalları ve safra kesesi, çıkarılması dayanmaktadır. Yapılar deneysel kullanım için daha sonra tripsinize edilebilir ve kaplama yeniden tek katmanlarda cholangiocytes arasında gelişimini sağlamak için yaklaşık 3 hafta boyunca kollajen ve kültüre kalın tabakalar gömülür.

Neonatal fare ekstrahepatik mükemmel saflıkta cholangiocytes, K19 immünofloresan boyama ile gösterildiği gibi (Şekil 2A ve 2B) bir nüfus izolasyonunda bu protokol sonuçlarının kullanılması; erişkin farelerin hücrelerini izole benzer sonuçlar elde. Bu kalın kolojen jeller üstünde tek tabakaları oluşturacak şekilde taze olarak izole edilen safra kanalları hücrelerin boyunca 3 hafta sürer olduğunu gözlemledik. Cholangiocytes kanallarından izole edilmiş hücre tabakaların oluşturulması, kalın kollajen boyunc...

Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Bu prosedürün genel amacı, neonatal nöron ekstrahepatik kolanjiyositleri izole etmek ve kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle karaciğere ve safra kanallarına erişim sağlamak için abdominal organların cerrahi olarak açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, safra kanallarını ve safra kesesini çevreleyen bağ dokusu ile yağların titizlikle temizlenmesidir.Temizlenen safra kanalları ve safra kesesi daha sonra kalın kolajen jeller üzerine yerleştirilir ve üç hafta boyunca kültüre edilir. Kolangiositler kanallardan göç edecek ve daha ileri kültür çalışmaları için ince kolajen jellere bölünerek aktarılacaktır. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskopi ile saf kolangiositlerden oluşan monokatmanlar görülür.Genellikle, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, diseksiyon tekniğiyle ilgili teknik zorlukların yanı sıra küçük safra kanallarının temizlenmesi nedeniyle güçlük çekerler. Bu prosedür için, doku kültürü davlumbazına ve inkübatöre yakın bir yere fare cerrahi masası kurun. Tüm sterilize edilmiş cerrahi aletleri %70 ethanol içeren bir behere yerleştirin.Besiyeri yüklü, 60 milimetrelik üç tabağı buza yerleştirin. Cerrahi masada iki tabağa ihtiyaç duyulacaktır, ancak diğer malzemeleri çeker ocak içinde tutun. Kollajen buz üzerinde olmalıdır.Ötanize edilmiş sıfır ila üç günlük neonatal bir fareyi diseksiyon tahtası üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirerek başlayın. Pelvise yakın orta hat boyunca küçük bir yatay insizyon yapın. İnsizyonu her iki yana doğru genişleterek U şeklinde bir flep oluşturun ve organları açığa çıkarın.Şimdi bağırsakları karın boşluğunun sağ tarafına dikkatlice kaydırın. Karaciğeri ve safra kanalını görebilmek için, gerekirse deri insizyonlarını genişleterek flebi büyütün. Diseksiyon mikroskobu altında, ana safra kanalını dikkatlice belirleyin ve temizleyin.Bağ dokusunu ve çevredeki yağları temizleyin. Ardından, aynısını tekrarlayın. Safra kesesini temizlemek için, safra kanalını ve safra kesesini çıkarıp hazırlanan kaplardan birine yerleştirin.Daha fazla bağ dokusunu uzaklaştırmak ve safrayı boşaltmak için yapıları derecelendirilmemiş penslerle masaj yaparak temizleyin. Ardından, temizlenmiş dokuları ikinci kaba aktarın. Tam olarak beş neonattan doku toplanana kadar bu prosedürü tekrarlamaya devam edin.İşe kalın bir kolajen jel hazırlayarak başlayın. Bunu her zaman önce taze olarak hazırlayın. Tüm sterilize edilmiş çözeltileri buz üzerinde bir araya getirin.1X PBS'in mililitresi başına iki miligram kolajen için gereken hacimleri hesaplayın. Her bir parçaya 0,023 kısım sodyum hidroksit ekleyin. Kolajen. Alikotları oda sıcaklığında pipetleme yöntemiyle birbirine karıştırın.Kolajen eklenmeden önce PBS sodyum hidroksit ve distile suyun karıştırılması esastır. Kolajen stok çözeltisi, jele eklenen son bileşen olmalı ve nihai çözelti pipetle aktarılmalıdır. Bu işlem, kolajenin topaklanmasını önler.Çözelti jel benzeri bir kıvam almaya başladığında, izole edilen dokuları hemen gömün ve ardından gömülen dokuları katılaşmaları için 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın. Katılaştıktan sonra, jelin üzerine 3,5 milliliters BEC medyumu ekleyin ve inkübasyona devam edin. BEC medyumunu haftada üç kez değiştirin. Üç hafta içerisinde, gömülü kanallardan uzanan büyük çekirdekli hücre tabakaları oluşacaktır.Bunlar kolanjiyositlerdir. Eğer kapta önemli miktarda fibroblast popülasyonu varsa ve bunlar kesilerek uzaklaştırılamıyorsa, kap atılmalıdır. Şimdi, mililitre başına 1 mg kolajen içeren PBS ile ince kolajen jeller hazırlayın; 100 mm'lik bir plağa 1 mL kaplayın, kolajeni eşit şekilde yayın ve 10 dakika bekleyin.10 dakika sonra, plakayı yedi mililitre DM EMF 12 ile kaplayın ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Kısa inkübasyonun ardından, kolajeni hızlıca bir kez XPBS ile yıkayın. Tüm PBS'yi aspirasyonla uzaklaştırın ve ardından, ilk katmanı oluştururken yaptığınız gibi ikinci bir kolajen katmanı ekleyin.Katılaştıktan sonra, plakayı DMF 12 ile kaplayın ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Şimdi hücreleri kalın jellerden ayırın. Öncelikle bir spatula veya kazıyıcı kullanarak, kollajeni plakadan nazikçe ayırarak yüzmesini sağlayın.Ardından, filtrelenmiş kollagenaz çözeltisini hazırlayın ve kalın kollajen içeren her bir 60 milimetrelik kaba bir mililitre ekleyin. Daha sonra plakaları inkübatöre yerleştirin. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri içeren tüm çözeltiyi uzaklaştırın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tüpü santrifüjleyerek çöktürün ve süpernatantı aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Pelleti 4.5 milliliters DM F 12 besiyerinde yeniden süspanse edin ve tekrar santrifüjleyerek çöktürün. Pelleti üç milliliters %0.5 Trypsin içinde yeniden süspanse edin ve hücre tabakalarının gevşemesi için hücreleri 37 degrees Celsius sıcaklıkta beş dakika inkübe edin.Beş dakika sonra, kümeler parçalanana kadar onları beş veya 10 mililitrelik bir pipetle aktarın. Ardından beş mililitre BEC medyumu ekleyin ve hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin. Üçüncü kez resüspansiyon yapın.Yıkama adımı olarak pelletini DMM F 12 medyumunda süspande edin ve hücreleri tekrar pelletleyin. Şimdi hücreleri BEC medyumunda yeniden süspande edin ve hazırlanan ince tabaka üzerine ekimleyin. Kolajen jeller hücreleri büyütür; gerektiğinde onları kolajen jeller üzerinde bölün.Açıklanan protokol kullanılarak, mükemmel saflığa sahip neonatal fare ekstrahepatik kolanjiyosit popülasyonu izole edilmiş ve K 19 immünofloresan ile boyanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, titiz kanal diseksiyonu ve kalın kolajen jeller üzerinde büyütme yöntemlerinin kombinasyonuyla nasıl saf bir neonatal fare ekstrahepatik kolanjiyosit popülasyonu izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz bütün fare karaciğer doku sindirim, hücre zenginleştirme ve flow sitometri izolasyonu gerektiren bir süreçten CD133 eksprese karaciğer kök hücre ve kanser kök hücrelerin izolasyonu tarif. Biz gelişmiş tek hücre izolasyonu ve klonal genişleme için yöntemler içerir.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Burada sunulan değiştirilmiş bir kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak yetişkin fare karaciğerlerinden fare hepatositizolasyon için bir protokoldür. Ayrıca açıklanan bir 3D kollajen sandviç ayarında hepatosituzun kültürü yanı sıra safra kanaliküler oluşumu ve tedaviye yanıt çalışma için sitoskeletal bileşenlerin immünetiketleme.

İzolasyon ve 3D Kollajen Sandviç Kültürü Birincil Fare Hepatositler Safra Canaliküler Oluşumunda Sitoskeleton Rolünü Çalışma In Vitro

Bu protokol, özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık tüp, gerçek zamanlı izleme ile tamamlanan sıcaklık kontrolü ve izole primer sıçan hepatositlerinin yaşayabilirliği, verimi ve işlevselliğindeki tutarlılığı artırmak için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için bir alarm sisteminin kullanımını detaylandırmaktadır.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Murin neonatal safra kanalı bozukluklarının gözlenmesi için sağlam bir safra kanalı ve etkili bir hazırlık gereklidir. Bu nedenle, murin yenidoğanlarda tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin izole edilmesi için safra kanalının bütünlüğünü korurken başarılı bir şekilde yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir.

Dokuz Günlük Fare Yenidoğanlarında Ekstrahepatik Safra Kanalı ve Safra Kesesi Diseksiyonu

Lipid yüklü hepatositler karaciğer rejenerasyonuna özgüdür, ancak genellikle yoğunluk gradyan santrifüjleme ile kaybolurlar. Burada, steatotik hepatositleri tutan ve farelerde parsiyel hepatektomi sonrası rejenere hepatositlerin temsili popülasyonlarını veren optimize edilmiş bir hücre izolasyon protokolü sunuyoruz.

Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Öğrenin, yeni doğan farelerden ekstrahepatik safra kanalı kolangiositlerinin izolasyonu ve kültürü için kalın kollajen jellerde büyütme yöntemini. Bu teknik, safra kanalı gelişimi ve patolojileri üzerine araştırmaları ilerletir.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

Daha fazla video keşfet