Tarafından Işığa Proteinler Proton Transferi ve Protein Konformasyon Dynamics Zamanda çözülmüş kızılötesi spektroskopi Fourier-dönüşümü Step-tarama

Bu prosedürün genel amacı, zamanla çözülmüş STEP tarama FTIR spektroskopisi oskopisi kullanarak iki ışığa duyarlı membran proteininin protonasyon dinamiklerini ve doğrulayıcı değişiklikleri araştırmaktır. Bu, ilk olarak, kızılötesi absorpsiyonu ya bakteri opsin için zayıflatılmış bir toplam yansıma konfigürasyonunda ya da kanal Rodin iki için bir iletim konfigürasyonunda incelenecek olan hidratlı bir protein filmi oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, proteinde bir foto döngüsel reaksiyon başlatmak için numuneyi uygun dalga boyunda bir nanosaniye lazer flaşı ile uyarmak ve numune ile etkileşime giren kızılötesi ışığın yoğunluğundaki zamanla çözülmüş değişiklikleri tespit etmektir.

Daha sonra, yukarıdaki işlem, iki ayrık ışın arasındaki optik yol farkını kontrol eden bir interferometrenin mobil aynasının gizli konumlarında, tam zamanlı çözümlenmiş bir interferogram kaydedilene kadar tekrarlanır. Son adım, Fourier dönüşümü ve Lambert bira yasasını kullanarak zaman çözümlü interferogramı, zaman çözümlü bir IR fark absorpsiyon spektrumuna dönüştürmektir. Nihayetinde, özellikle MI'da ve CO çift bağlı karboksilik bölgelerdeki yasakların zaman evrimi, proteindeki doğrulama ve protonasyon değişikliklerinin dinamiklerini elde etmek için incelenir.

Mevcut deneysel yöntemlerin çoğunun tekniğinin temel avantajı, proteinlerdeki geçici protonasyon değişikliklerini çözmesidir. Dahası, bunu protein işlevselliğini araştırmak için en uygun zaman aralığı olan mikro ve milisaniye zaman ölçeklerinde yapar. Bu yöntem, moleküler biyofizik ve protein bilimi alanında, bir proteinin işlevsel mekanizması sırasında hangi kalıntıları ve ne zaman yaptıkları veya proteinlerde büyük değişikliklerin ne zaman meydana geldiği gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Prosedürün gösterilmesi, laboratuvarımdan Victor Ria araştırma görevlisi tarafından yapılacaktır İlk montaj, zayıflatılmış toplam yansıma veya FTIR spektrometresinin numune bölmesine bir TR aksesuarı. Dört ters santimetrede geniş bir enerji spektrumu aralığını ölçün. Temiz iç yansıma elemanı yüzeyinin konvansiyonel hızlı taramalı FTIR spektroskopisi ile çözünürlüğü, daha sonra numuneyi yeniden sulandırmak için kullanılan 20 mikrolitre yüksek iyonik kuvvete sahip tampon ile A TR'nin yüzeyini kaplar.

Ardından tamponun IR emilimini ölçün. Ardından, tamponu çıkarın ve yüzeyi dokunmadan suyla durulayın. Kalan sıvıyı, yüzeyin üzerine mor zar içinde mililitre başına altı miligram bakteri Rodin protein çözeltisinin yaklaşık üç mikrolitresini yayarak yoğun bir hava akımı ile çıkarın.

Protein süspansiyonunu, bir film elde edilene kadar hafif bir kuru hava akımı altında kurutun. Ardından kuru filmin absorpsiyon spektrumunu ölçün. Bunu takiben, kuru filmi yeniden sulandırmak için yavaşça 20 ila 40 mikrolitre yüksek iyonik mukavemetli tampon ekleyin.

Suyun buharlaşmasını önlemek için A TR tutucuyu bir kapakla kapatın, ölçün ve emici spektrum. Tamponun absorpsiyon spektrumunu çıkararak filmin rehidrasyonundan sonra yüzeye yakın kalan numune yüzdesini tahmin edin. Bu noktada, 20 milimetre çapında bir baryum florür penceresinin merkezinde düşük iyonik kuvvette bir tampon içinde dec alside içinde çözülmüş 10 mikrolitre kanal opsin iki ekleyin.

Mikro pipet ucunun yardımıyla, en büyük açıklıkta IR ışınının boyutuna kabaca uyan bir çapa sahip yumuşak bir kuru hava akışı ılık, homojen bir film kullanarak çözeltiyi altı ila sekiz milimetre çapa yayın. Ardından, bir milimetre kalınlığında düz bir silikon O-ring kullanın. Kuru filmin etrafına üç ila beş damla halinde dağıtılan bir gliserol ve su karışımından üç ila beş mikrolitre ekleyerek filmi nemlendirin ve ikinci bir pencere ile sıkıca kapatın.

Baryum florürlü sandviç pencereleri bir tutucuya yerleştirin. Ardından tutucuyu numune bölmesine yerleştirin. Bir absorpsiyon spektrumu ölçün.

A TR kurulumu için amid bir bölgesindeki maksimum absorpsiyonun 0.6 ila 1.0 aralığında olduğunu onaylayın. Lazeri numuneye bağlamak için A TR kapağının üstüne yerleştirilmiş bir optik fiber kullanın. Numunedeki lazerin enerji yoğunluğunu darbe başına santimetre kare başına iki ila üç milijoule olarak ayarlayın.

Bir güç ölçer veya iletim deneyleri kullanarak, lazeri numuneye getirmek için aynalar kullanın ve gerekirse, lazer ışınını numune film boyutunun biraz üzerinde bir çapa harmanlamak veya yönlendirmek için lensler kullanın. Q anahtarını kullanarak lazer darbesini veri kaydı ile senkronize edin. Spektrometre analogdan dijitale dönüştürücüyü tetiklemek için neodimyum uyuşturucu atriyum alüminyum granat lazerin elektroniğinin TTL darbesini senkronize edin.

Çözülen süreyi gerçekleştirmek için lazerin uyarma hızını ayarlayın. 1800 ila 850 ters santimetre spektral aralığında adım tarama ölçümleri. 1.950 ters santimetrenin üzerinde opak olan ve 1800 ters santimetrenin altında iyi iletim sağlayan optik yola alçak geçiren bir optik filtre yerleştirin.

Ardından dedektörü AC'den DC bağlantılı moda değiştirin. Bu noktada, dedektöre bir akım yanlılığı uygulayarak INTERFEROGRAM'ın DC seviyesini sıfıra getirin. Analogdan dijitale dönüştürücünün dinamik aralığını daha iyi kullanmak için elektronik kazancı yeniden ayarlayın.

Bunu takiben, FTIR spektrometresinin adım tarama menüsünü başlatın. Kademeli tarama ölçümü için hedef spektral bant genişliğini helyum neon lazer dalga sayısının sekizde birine ayarlayın. Spektral ve faz çözünürlüğünü sırasıyla sekiz ters santimetre ve 64 ters santimetre olarak ayarlayın.

Bir uygulama işlevi seçin. Ardından INTERFEROGRAM çekim modunu tek tarafı ileri olarak ayarlayın. Analogdan dijitale dönüştürücünün örnekleme hızını spektrometrede bulunan en yüksek değere ayarlayın.

Deneme tetikleyicisini harici olarak ayarlayın. Ardından, 100 pret tetikleme noktası da dahil olmak üzere kaydedilecek doğrusal aralıklı veri noktalarının sayısını ayarlayın. Ardından, ayna konumu başına ortak sürümlerin sayısını veya fotoğraf reaksiyonunun ortalamalarının sayısını ayarlayın ve deneyi başlatın.

Son olarak, deneyi bakteri, redsin için 10 kez ve ayna konumu başına yaklaşık 200 co ilavesine sahip olacak şekilde kanal redsin iki için üç farklı numune film üzerinde 35 kez tekrarlayın. Peptit bağı amid titreşimlerinden karakteristik yasaklar, Redsin bakteri kuru köpük absorpsiyon spektrumunda ayırt edilebilir. Düşük iyonik kuvvete sahip tamponlar kullanıldığında, film aşırı derecede genişler ve buharlaşan alan tarafından incelenen protein miktarını azaltır. Film şişmesi ve tampon iyonik kuvveti arasındaki kesin bağımlılık, diğer faktörlerin yanı sıra lipitlerin doğasına bağlı olacaktır.

Hidrasyondan sonra film şişmesi, dosin bakterileri için stabilizasyona ulaşmak için zaman gerektirir. Mor zarda, işlem 12 dakikalık bir zaman sabiti ile mono üsteldir. Tipik bir zaman çözümlü adım taramasından bir 3D çizim, bakteriler üzerinde FDIR deneyi.

Redsin burada gösterilmektedir. Spektrumlar belirli zamanlarda çıkarılabilir. Örneğin, bakteri redsin foto döngüsündeki ara durumların en yüksek popülasyonlarına ulaşması beklenir.

Bakteri çubuğunda Dossin foto döngü süresi 1.762 ters santimetrede absorbans değişiklikleri izleri. Aspartat 85'in protonasyon deprotonasyon dinamikleri ve 1.741 ters santimetrede hidrojen bağı değişiklikleri ve aspartik asidin deprotonasyon reprodüksiyon dinamikleri hakkında raporlar.96. Zaman 1.670 ve 1.555 ters santimetrede izler.

Her ikisi de peptit omurga onayına duyarlı olan MI bir ve iki titreşimdeki değişiklikleri rapor edin. Bu yöntemi takiben, proteinin geliştirilmesinden sonraki spesifik kalıntılara titreşim bandı atamak için bölgeye yönelik nörojenez veya retinal enzim spektroskopisi gibi diğer teknikler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, moleküler biyofizik alanındaki araştırmacıların birçok farklı ışıkla çalışan proteinin işlevsel mekanizmasını keşfetmelerinin yolunu açtı.