Yöntem Spontan Karakterizasyonu Ürkütme kaynaklı hareket yeteneği bir Rotenon ile uyarılan Parkinson Hastalığı Modeli için Drosophila

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila'nın rotenon kaynaklı Parkinson hastalığı modelinde irkilmeye bağlı ve uzun süreli spontan hareketi belirlemektir, bu, fenotipi indüklemek için drosophila'nın rotenon takviyeli gıda üzerinde yetiştirilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, sinekler irkilme yanıtı testine ve çift flakon aparatına ve uzun süreli spontan hareket testine tabi tutulur. Bir drosophila aktivite monitöründe sonuçlar, rotenona maruz kalmanın, irkilme ve uzun süreli spontan hareketin nicelleştirilmesine dayalı olarak drosophila'da hareket kusurlarına neden olduğunu göstermektedir.

Bu yöntemler, drosophila alanındaki temel soruların, ürkütücü hareketteki kusurlar gibi nörodejeneratif ve hareket bozukluklarının modelleri ve uzun süreli spontan hareket gibi soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için 1.5 gram anlık drosophila ortamı ekleyin. Standart bir sinek şişesinde, uygun rotenon dozunu içeren beş mililitre deiyonize su içeren ortamı oluşturun.

Daha sonra, bir ila üç günlük yaşları arasındaki sekiz ila 12 erkek sinek karbondioksit kullanır ve bunları ilacı içeren şişelere taşır. Takviye edilmiş gıda, flakon yatay pozisyonda iken sineklerin 20 dakika boyunca sedasyondan kurtulmasını sağlar. Daha sonra şişeyi, deneyin geri kalanı için 25 santigrat derecede 12 saatlik açık koyu bir inkübatöre dik olarak yerleştirin.

Daha sonra, standart bir sinek şişesini başka bir şişenin üzerine ters çevirin ve bir çift şişe aparatı oluşturmak için dikişi bantla kapatın. Daha sonra, şişelerin etrafındaki daireleri kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyerek çift şişeyi 6.33 santimetrelik üç eşit bölüme bölün. Üç günlük ilaca maruz kaldıktan sonra, sinekleri çift flakon aparatına aktarın.

Bandın dikişin üzerine yerleştirilmesi, sineklerin 15 dakika boyunca yeni ortama alışmasını sağlar. Ardından şişeleri beyaz bir arka plan üzerine yerleştirin ve dijital kamerayı kurun. Tüm aparatın tek bir resim çerçevesinde görünür olduğundan ve çift flakon aparatının ve zamanlayıcının görüş alanında olduğundan ve tüm sineklerin odakta olduğundan emin olun.

Denemeler arasında tutarlı kareler sağlamak için kameranın ve şişenin konumunu işaretleyin, kamera görünümünde deneme numarasını ve ilaç tedavisini net bir şekilde görüntüleyin. Ardından, çift flakon aparatını tezgaha üç kez sıkıca vurun ve tüm sineklerin flakonun dibine düştüğünden emin olun ve zamanlayıcıyı hemen başlatın. Bir dakika boyunca her beş saniyede bir cihazın resmini çekin.

Sonra sineklerin bir dakika boyunca rahatsız edilmeden iyileşmesine izin verin. Her deneme arasında bir dakikalık iyileşme süreleri ile testi iki kez daha tekrarlayın. Hesaplamaların üç gram anlık oph, 15 mililitre deiyonize su içeren bir ortam ve uygun rotenon dozunu yeniden oluşturmasını sağlamak için resimleri gözden geçirin ve zaman içinde her bölümdeki sinek sayısını kaydedin.

Beş dakika sonra, tüpleri dikkatlice şeffaf şişelere dikey olarak yerleştirin ve tüpü çevirerek sert yiyeceği bir santimetre yüksekliğinde yükleyin. Daha sonra, hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek tüpün ucundaki plastik kapağı yavaşça itin. Bir günlük erkek karbondioksit ile uçar ve her tüpe bir boya fırçası ile dikkatlice bir sinek yerleştirir.

Ardından tüpün ucunu küçük bir pamuk top ile tıkayın. Tüpler 15 dakika boyunca yatay konumdayken sineklerin karbondioksitten kurtulmasına izin verin ve tüm sineklerin canlı ve aktif olduğundan emin olun. Tüpleri drosophila aktivite monitörüne veya DAM'a yerleştirin ve tüm tüplerin DAM'a göre aynı konumda olduğunu kontrol edin.

DAM'ı 25 santigrat derecede 12 saatlik açık koyu bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, DAM'ı veri toplama sistemine bağlayın. Ardından tercihler altında DAM yazılımını açın.

Veri toplamaya başlamak için 10 dakikalık bir bölme uzunluğu seçin ve programın yedi gün boyunca veri toplamasına izin verin. Ardından, DAM dosya tarama programını açın ve giriş verilerini seç'e tıklayarak monitör verilerine erişin. Ardından uygun monitör aralığını seçin ve bölme uzunluğunu 10 dakikalık aralıklarla ayarlayın.

Çıktı dosyası türünün ardından kanal dosyalarını seçin ve diğer tüm seçenekleri varsayılanlarında bırakın. Ardından verileri tara'ya tıklayın ve dosyaları belirlenen bir klasöre kaydedin. Son olarak, dakika başına sayım elde etmek için verileri sirkadiyen veri analizi yazılımına aktarın.

Üç gün boyunca farklı dozlarda yabani tip kunağa maruz kaldıktan sonra, artan dozlara maruz kalan Kanton sinekleri, irkilme tepkisinde bir eksiklik gösterdi. Sineklerin daha düşük bir yüzdesi üst kısımda ve 30 saniye sonra aparatın alt kısmında daha yüksek bir yüzde idi, bu da saral yanıtında bir eksikliğin göstergesiydi, spontan hareket tahlilinde sinekler için de benzer bir eğilim görüldü. Dakikadaki sayımlar drosophila aktivite monitöründe veya DAM'da ölçüldü.

Maruziyetten sonraki dördüncü günde, 250 mikromolar ve 500 mikromolar rotenona maruz kalan sinekler, dakika başına sayımlarda önemli bir azalma gösterir. Bu tahliller, diğer özofagus hastalık modellerindeki hareket kusurlarını ve terapötik ajanların etkinliğini karakterize etmek için uygun şekilde uyarlanabilir.