Name: T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Öğrenin, floresan hedef dizileri kullanarak canlı ortamda T hücre yanıtlarını değerlendirmeyi. Bu yöntem, akış sitometrisi ile 250'den fazla parametreyi aynı anda ölçerek immünolojik araştırmalarda detaylı bağışıklık analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Proje Destek # 1010395 (BQ ve CP) ve # 525431 (CR), ve Avustralya, Hepatit ve HIV Viroloji EOI için bir Avustralya Merkezi Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, bir Programı Hibe # 455395 (CP) tarafından desteklenen 2012 hibe (CR ve RJJ) ve Gordon ve Gretel Çoban Vakfı (BQ ve CR) bir hibe. Biz JCSMR FACS laboratuvar mükemmel bakımı için Harpreet VOHRA ve Michael Devoy teşekkür etmek isterdim, peptid sentezi için Avustralya Kanser Araştırma Vakfı Biyomoleküler Kaynak Tesisi, JCSMR, IAS, ve Dr David Boyle, CSIRO Hayvan Sağlığı Laboratuarları, Geelong, Avustralya ana HIV aşısı stokları sağlamak için.

Not: Bu protokol altında kullanılan Fareler Avustralya Ulusal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu kurallarına ve farelere göre ele alındı ​​servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı. 1.. Boya ve Peptid hazırlanması <ol><li> Boya hazırlanması Not: Boyalar ayrık floresan yoğunluklarda hücre etiketleme izin farklı konsantrasyonlarda ovalanır edilir. CFSE 3.5-kat seri seyreltmeler ile yapılan yedi konsantrasyonlarda kullanılır ve CTV ve CPD (2-4 bakınız Tablolar), 3.7-kat seri seyreltmeler ile yapılan altı farklı konsantrasyonda kullanılmaktadır. Tablolar 2-4 listelenen boyaların stok konsantrasyonları Tablo 2-4 &#39;de listelenen nihai boya konsantrasyonlarda hedef hücreleri etiketlemek için kullanılacaktır. Boyalar, sulu çözeltiye maruz kalma üzerine reaksiyona girmektedir. Bu küçük şişeler önce yoğunlaştırmaya maruz boyaların en aza indirmek için açılması için, oda sıcaklığına kadar dengelenmiş olması önemlidir. <ol><li> CFSE Not: CFSE carboxyfluorescein diasetat süksinimidil ester (CFDA, SE, MW 557,47) olarak satın alınan tipik olarak 25 mg / şişe olarak,. <ol><li> , 10 mM stok çözeltisi elde etmek için 4.48 ml DMSO içinde 25 mg CFSE yeniden süspanse edin. </li><li> Seri olarak CFSE seyreltik: DMSO içinde 87.5 ul içine 10 mM stoklar CFSE 35 ul eklenir ve Tablo 3 &#39;de her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> CTV Not: CTV, tipik olarak bir boya 10 mM çözelti elde etmek için 10 ul DMSO ile yeniden olabilir, her biri 9 küçük şişeler, büyük paketler halinde satın alınır. <ol><li> Sulandırın ve bir 10 mM çözelti vermek üzere 90 ul DMSO ile CTV&#39;nin 9 şişe havuz. </li><li> Seri olarak seyreltilmesi, CTV: DMSO içinde 29.7 ul içine 10 mM stoklar CTV 11 ul eklenir ve Tablo 2 &#39;de her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> CPD Not: CPD (MW 792,6) tipikly 0.5 mg / şişe olarak satın. <ol><li> 10 mM bir çözüm elde etmek için 63 ml DMSO içinde yeniden süspanse CPD 0.5 mg. </li><li> Seri olarak CPD seyreltik: DMSO içinde 29.7 ul CPD içine 10 mM stoklar 11 ul eklenir ve Tablo 4 &#39;de, her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. Not: Boya hisse senetleri, birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir ve işlevde önemli bir kayıp olmadan birkaç kez çözündürüldü ve refrozen edilebilir. </li></ol></li></ol></li><li> Peptid hazırlanması Not: 1 uM (Tablo 5), bir başlangıç ​​konsantrasyonundan 10 misli seyreltmeler kullanılarak yapılan MHC sınıf-I-bağlama peptidleri genellikle 6 farklı konsantrasyonlarda hedef hücreler pals için kullanılır. 400 uM (Tablo 5), bir başlangıç ​​konsantrasyonundan 3 kat seyreltmeler kullanılarak yapılan MHC sınıf II-bağlama peptidleri genellikle 6 farklı konsantrasyonlarda hedef hücreler pals için kullanılır. Her bir peptit PBS gibi tha 2x son konsantrasyon yapılırt, her peptid konsantrasyonu 250 ul bir minimum hacme sahiptir. Peptid stokları önce FTA yapı hazırlanmış ve işlevde önemli bir kayıp olmadan -20 ° C&#39;de saklanabilir. <ol><li> Hazırlama stok MHC sınıf-I-bağlama peptidleri </li><li> 2 uM stok çözeltileri (2 x 1 uM) için her bir peptit epitopunun en yüksek konsantrasyon hazırlamak </li><li> Seri olarak MHC sınıf-I-bağlama peptidleri seyreltik: PBS içinde 400 ul içine 2 uM peptit stok çözeltisi 44.4 ul ekleyin. Tablo 5 &#39;de her bir peptit konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. </li><li> Hazırlama stok MHC sınıf-II-bağlama peptidleri </li><li> 800 uM stok çözeltileri (2 x 400 uM) için her bir peptit epitopunun en yüksek konsantrasyon hazırlayın. </li><li> Seri olarak MHC sınıf II-bağlama peptidleri seyreltik: PBS içinde 300 ul 800 uM peptid içine çözeltisi 150 ul ekle. Tablo 5 &#39;de her bir peptit konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarla </stRong&gt;. </li></ol></li></ol> 2.. FTA Hazırlık Not: Aşağıdaki prosedür 252 belirgin bir hücre kümeleri vermek üzere 6 kez tekrar 6 farklı konsantrasyonda (. Örneğin, hücre kümeleri 42) 7 farklı peptit epitopları ile pulse hücre içeren bir FTA yapımını açıklamaktadır. Her bir tekrar içinde, herhangi bir epitop (Nil) ile doldurulan bir zigot, bir kontrol olarak dahil edilir. FTA analiz zamanda antikor etiketleme alıcı hücrelerin kendi ayrımı sağlamak için bir ev sahibi hayvanlar, bir CD45 allotip fark sahip olması yararlıdır. Aksi takdirde, FTA (adım 2.6 de tarif edilmiştir), bu amaçla örneğin PKH-26 gibi diğer boyalar ile etiketlenebilir. Tipik olarak, FTA hazırlama işlemi bir oturma süresince baştan sona gerçekleştirilir. <ol><li> Etiket 42, 10 ml konik (örneğin, Tablo 1 &#39;de olduğu gibi) Plastik borular 1-42 dipli. </li><li> Hücrelerin hazırlanması <ol><li> Dalak ve / veya lymp izolefarelerden hnodes. 5 ml şırınga pistonu ile elek gözenekli bir 70 mikron ile ezme dokuların tek hücre süspansiyonu hazırlayın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> (RPMI ya da eşdeğeri),% 5 fetal buzağı serumu (FCS) ihtiva eden Rochester Park Memorial Institute 1640 11.5 ml 200 x 10 6 hücre / ml &#39;de yeniden süspanse lenfositler. Not: Bu hücre 3&#39;e boya toksisitesini en aza indirmek için, yüksek amin içerikli bir tampon kullanmak önemlidir. </li></ol></li><li> CTV etiketleme Not: Hücreler başlangıçta CTV&#39;nin 6 konsantrasyonları ile etiketlenir. <ol><li> Iyice tüpü birkaç kez ters çevrilerek hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. Tüplerin üst yarısı ıslak dikkat ederek, 37-42 etiketli 10 ml tüpler 6 hücre süspansiyonu, 1.9 ml ilave edilir. </li><li> CTV ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS içinde 83 ul ve bu stok CTV 17 ul ekle (TAB bakınızStok Çözelti tüp) atanmış olduğu için le 2. Not: A non ıslatılmış tüp boya çözeltisi ile hücre süspansiyonu hareket ve hücre çözeltisinin prematüre karışmasını önlemek için önemlidir. </li><li> Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır. </li><li> Adımları tekrarlayın 2.3.2-2.3.4, Tablo 2&#39;de tarif edilen tayin tüplerine CTV&#39;nin stok çözeltileri için. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin. </li></ol></li><li> CFSE etiketleme <ol><li> CTV etiketleme işleminden sonra, her bir tüpe,% 5 FCS ihtiva eden RPMI içinde 5 ml ekleyin ve iyice girdaplanır hücreleri tekrar süspansiyon. <ol><li> Tüp 37 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 31, 25, 19, 13, 7 ve 1. </li><li> Tüp 38 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 32, 26, 20, 14, 8 ve 2. </li><li> Tüp 39 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 33, 27, 21, 15, 9 ve 3. </li><li> Hücrenin boru 40 devir, 1 ml kaynaktantüpler 34, 28, 22, 16, 10 ve 4 süspansiyonu. </li><li> Tüp 41 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 35, 29, 23, 17, 11 ve 5. </li><li> Boru kaynaktan 42 ve transfer tüpleri 36, 30, 24, 18, 12, ve 6&#39;ya hücre süspansiyonu 1 mi Not: adımları 2.4.1.1-2.4.1.6 sırasında tüplerin üst yarısını ıslak dikkat edin. </li></ol></li><li> CFSE ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS 103 ml ilave edilir, ve buna, (stok çözelti ki boru tahsis edildiği için bakınız Tablo 3) stok CFSE 7 ilave edin. </li><li> Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır. </li><li> Tablo 3 &#39;de tarif edilen tayin tüplerine CFSE stok çözeltileri için adımlar 2.4.2-2.4.4 yapın. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin. </li><li> Hücreler Yıkama: 20 ° C&#39;de 9 ml hücre süspansiyonu ile seyreltinRPMI% 5 FCS, 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile katı madde ve bir transfer pipeti ile aspirasyon ile süpernatantlar çıkarın. </li></ol></li><li> Peptit pulsing ve hücre yıkama Not: hücreler CTV ve CFSE ile etiketlendi sonra, MHC sınıf I ve / veya MHC sınıf II (1.2 hazırlandı) bağlama peptidleri ile birlikte titreşim uygulanır. Hücre popülasyonlarının Bir de (Tablo 1 &#39;de, örneğin. Nil) peptit ile doldurulan ve T hücre yanıtlarının hesaplanması için bir negatif kontrol olarak kullanılmamalıdır. <ol><li> Peptit darbeli <ol><li> % 5 FCS içeren RPMI, 250 ul toplam hacim içinde süspanse hücreler. Not: Genellikle hücre süspansiyonu, 50 ul, aşama 2.4.7 sonunda, süpernatan aspire sonra kalan bu nedenle pelet hücre ortamının 200 ul ekleyin. </li><li> Uygun (Tablo 1 gibi) tüpler belirlenen için (Tablo 5 gibi) önceden hazırlanmış peptid stoklarının 250 ul ekleyin ve olmak surPBS kontrol tüpünü eklemek için bir e Nil kontrol olarak peptid olmadan tek başına ilave edildi. </li><li> Bir girdap ile hücre süspansiyonları karıştırın. Not: Bu, her bir peptit epitopunun, ve her bir peptid konsantrasyonu tek bir tüp ve atanan kritik olan bu kümenin floresan imza Tablo l&#39;de olduğu gibi (bu peptidi tanımlayan çünkü bu boru içinde, hücrelerin floresans beklenen göre net bir şekilde kaydedilir örneğin, 1). </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> Hücre yıkama <ol><li> Buzla soğutulmuş 5 ml (4 ° C) RPMI tüp ters çevrilerek hücre süspansiyonu ve tekrar süspansiyon hücreleri,% 5 FCS içeren ekleyin. Dikkatlice buzla soğutulmuş (4 ° C) FCS 3 ml hücre süspansiyonu altında yatan. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu FCS arayüz sağlamak için yavaş hızlanma ve fren kullanma ve hücre süspansiyon solüsyonu korunur. </li><li> Sonra dikkatle RPMİ&#39;de aspire verahatsız yıkanmış hücre peletleri kalacak şekilde bir transfer pipeti ile FCS,. Not: Hücreleri yıkamak için bir altlık FCS kullanılması kadar peptid solüsyonu mümkün olduğu, hücrelerden çıkarılır sağlamak için yardımcı olur ve hücreler toplanmış olduğunda böylece çok sayıda serbest peptidler hücre popülasyonlarının maruz kalmasını kısıtlar. </li><li> Yine hücreler yıkayın:% 5 FCS ihtiva eden RPMI 4 ° C, 10 ml hücre topakları yeniden süspanse edin. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu Süpernatantlar kapalı dökün. </li><li> Havuz tüm cep birlikte,% 5 FCS ihtiva eden RPMI 4 ° C arasında 6 ml kullanarak bir pipet ile tek bir tüp içine popülasyonu. Tortu, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplandı Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. </li></ol></li></ol></li><li> CPD Hücre etiketleme Not: Bu noktada, altı intra tahlil replika CPD 6 farklı konsantrasyonları ile etiketleme, peptit darbeli hücreleri tarafından üretilebilir. <ol><li> 20 ° C&#39;de 11.4 ml ekleyinRPMI iyice bir pipet kullanılarak bir araya getirilmiş ve hücre peleti tekrar süspansiyon% 5 FCS ihtiva etmektedir. </li><li> Tüplerin üst yarısı ıslak dikkat ederek, 10 ml tüpler AF etiketli, 6 hücre süspansiyonu, 1.9 ml ilave edilir. </li><li> SMG ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS içinde 92 ul ve bu için (her bir tüpe tahsis stok çözeltisinin miktar için Tablo 4) hazır CPD ekleyin. </li><li> Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır. </li><li> . CFSE ve CTV farklı olarak, CPD etiketleme konsantrasyonu tam olarak doğrusal etiketlenmiş hücrelerin, elde edilen flüoresan yoğunluğu ile ilgili değildir ve: Tablo 4&#39;te tarif edilen tayin tüplerine CPD stok çözeltileri için adımlar 2.6.3-2.6.5 not mi çok çeşitli etiketli popülasyonlarının eşit floresan tepe elde etmek için kullanılan etiketleme konsantrasyonu olmuştur(bkz. Tablo 4) ampirik olarak belirlenir. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin. </li><li> Iki kez hücreleri yıkayın: süspanse hücreleri 10 ml 20 ° C RPMI% 5 FCS içeren. 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. Tekrarlayın. </li><li> Havuz birlikte bir pipet ile% 5 FCS içeren 8 ml 4 ° C RPMI kullanarak tek bir tüp içine tüm hücreler. Tortu, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanmış ve bir transfer pipeti ile Süpernatantı aspire. </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) PKH-26 Hücre etiketleme Not: STA&#39;lar fareler barındırmak için bir CD45 alotipik farkı ifade hücreleri ile inşa edilemiyorsa, bunlar, alıcı hücrelerin kendi ayrımcılığa izin PKH-26 ile etiketli olabilir. <ol><li> Havuza alınan hücre pelletine 2,9 20 ° C ml PBS ilave edin ve bir pipet ile iyice yeniden süspanse edin. </li><li> Bir hayır hücre süspansiyonu ekleyinn tüpünün üst yarısı ıslak dikkat ederek, 10 ml tüp ıslatılır. </li><li> Tüp kapağını çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına (PKH-26 boya setinde) seyreltici C 58 ul ve bu 1 mM stok PKH-26 42 ul ekle. </li><li> Tüp kap ve iyice karıştırın boya ile hücre çözümü karıştırın. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 10 dakika içinde en az hücreleri inkübe edin. </li><li> Iki kez hücreleri yıkayın: süspanse hücreleri 10 ml 20 ° C RPMI% 5 FCS içeren. 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. Tekrarlayın. </li></ol></li><li> Konak hayvanların içine enjekte STA Not: in vivo T hücresi tepkilerini ölçmek için, FTA aktif bir bağışıklık tepkisi ve en fazla 24 saat boyunca yerinde kalan hayvanlara enjekte edilir. Bu FTA de negatif bir kontrol olarak saf bir hayvan içine enjekte edilir önemlidir.<ol><li> Toplamı ve PBS içinde ml başına 2.5 x 10 8 hücre hücreler tekrar süspansiyon. , Bir kontrol olarak saf bir hayvan da dahil olmak üzere, damar konakçı hücrelerin farelere 200 ul enjekte edilir. </li></ol></li></ol> 3.. Sitometrisi <ol><li> FTA enjeksiyon hasat kan ve dalak (ya da ilgili diğer dokularda) ana farelerden sonra 18-24 saat. </li><li> Bir 70 um ile ezme dokulardan tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması 5 ml şırınga pistonu ile gözenekli elek. </li><li> % 0.1 BSA içeren PBS içinde 65 x 10 6 hücre / ml &#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Antikor etiketleme için bir mikro-titrasyon plakasının oyuklarına hücre süspansiyonu 100 ul alikotları dağıtın. </li><li> CFSE, CTV ve CPD Işıksal uyumlu floresan ile florokromla etiketli antikorlar ve floresan canlılığı probları ile etiket hücreleri. Not: B220 ve bu CD69 gibi aktivasyonu gibi hücre işaretçileri B antikorlar FT kullanılıyorsa B hücresi aktivasyonunu ölçmek için gerekli olanA T H hücresi tepkilerini ölçmek için 2. STA&#39;lar ve ev sahibi fareler bir CD45 alotipik fark varsa CD45.1 ve / veya CD45.2 bir antikor içerir. </li><li> Karıştırın ve 30 dakika boyunca buz (4 ° C) üzerinde inkübe, hücre 100 ul alikotları (% 0.1 BSA içeren PBS içinde) antikor / uygunluğu boyaların 2x stok çözeltisi 100 ul ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler ve süpernatant Sediment çıkarın: hücreleri yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile 200% 0.1 BSA ihtiva eden PBS ul, tortu hücrelerinde hücreler yeniden süspanse edin ve supernatant çıkarın. </li><li> Bir 70 um ağ üzerinden% 0.1 BSA, filtre hücrelerini içeren ve ilgili floresan boyalar ve eşlenikleri saptayabilen bir akış sitometresinde akış sitometrisi ile analiz PBS içinde 400 ul toplam hacim içinde süspanse hücreler. Her FTA hücre küme çözmek için 3 x 10 6 lenfosit olaylara kadar toplayın ve istatistiksel için yeterli hücre eldecal analizi. Not: akışı için (örneğin tek lekeli kontrolleri gibi) tüm tipik kontrolleri olun sitometri istihdam edilmektedir. Tipik olarak, CFSE bir mavi lazer kaynağı (tipik olarak 488 nm) ve 520 nm üzerinde merkezli bant geçiren filtreler ile algılama uyarma gerektirir; CTV mor bir lazer kaynağı (tipik olarak 405 nm) ve 450 nm üzerinde ortalanmış bant geçiş filtreleri ile uyarılmasını gerektirir algılama; ve CPD kırmızı bir lazer kaynağı (tipik olarak 633 nm veya 640 nm) ve 670 nm üzerinde merkezli bant geçiren filtreler ile algılama gelen uyarma gerektirir. </li></ol> 4.. Veri Analizi <ol><li> Standart akış sitometri yazılımı kullanarak veri akış sitometri analiz (istihdam yolluk strateji türüne bir örnek için temsili bir sonuç bakınız). </li><li> % Spesifik öldürme için, MHC sınıf-I ve-bağlama peptidleri (&quot;Nil&quot;) pulse peptidler değildi FTA kümeleri ile doldurulan her FTA hücre kümedeki hücre sayısını hesaplar ve hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılarak% Spesifik Öldürmek. % Spesifik Killing <img alt="Formül" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51627/formula.jpg" width="200" /> Not: &quot;astar&quot;, yukarıdaki formül &quot;naif&quot;, &quot;peptit&quot; ve peptidler &quot;sıfır&quot; ile darbeli hedefleri belirtir, naif hayvanları hedeflere belirtir, hedef peptide karşı bir bağışıklık tepkisi olduğu düşünülen hayvanlardan hedefler belirtir olarak Herhangi bir peptidlerle pulse olmayan hedeflere anlamına gelir. </li><li> B hücre aktivasyonu, T H aktivitesinin bir ölçüsü olarak, en GMFI çıkarma &quot;prime&quot; hayvanlarda MHC sınıf II-bağlama peptidleri ile ve bu darbeli FTA B hücrelerinde CD69 antikor Horasanın geometrik ortalama floresan yoğunluğu (GMFI) hesaplamak T H etkinliğinin bir ölçüsünü vermek üzere &quot;naif&quot; hayvanlarda karşılık gelen FTA B hücreleri üzerinde CD69 ekspresyonu. </li><li> Adımları 4.2 ve 4.3, kullanım üretilen istatistiklerindenBu tür eğri ve EC 50 altındaki alanda (EAA bu hesaplamalar için yapılır nasıl derinlemesine açıklama gibi diğer nicel ve nitel parametreleri hesaplamak için böyle GraphPadPrizmasındaki gibi matematiksel hesap tablosu yazılımı bulunabilir http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm ve EC50 için: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm). </li></ol>

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

FTA bazlı deneylerde avantajı, akış sitometrisi ile, tek bir konak hayvandan&gt; 250 uygulanabilir ve tamamen işlevsel bir hedef hücre popülasyonlarının ayrımcılık sağlamasıdır. Bu, daha önce mümkün olmamıştır in vivo akış sitometri esaslı tahliller için karmaşıklık düzeyi sağlar. Bu 6 konsantrasyonlarda 7 farklı viral epitoplara yanıtlar, AUC ve EC 50 gibi parametreler in vivo T hücresi tepkileri için belirlenecek izin veren tek bir hayvanda aynı anda 6 tekrarlı takip edilebilir, yukarıda g...

T hücreleri, adaptif bağışıklık yanıtında merkezi bir rol oynar ve genellikle immünoterapide manipülasyon için hedeflenir. CD4 + efektör T hücreleri, bağışıklık birçok yönlerini düzenleyen ve aynı zamanda doğrudan antikor üretimi için B hücrelerinin yardımcı olabilir sitokin salgılayarak yabancı antijene yanıt. CD8 + sitotoksik T hücreleri (CTL &#39;ler) aynı zamanda sitokin salgılayarak hem de doğrudan yabancı bir antijeni eksprese eden hücreleri öldüren bir rol oynayarak, yabancı antijene yanıt verebilir. Bu T hücre efektör işlevi başlatır temel etkileşim hücre yüzeyi üzerinde MHC molekülleri üzerinde görüntülenen yabancı peptidler ile T hücre reseptörü (TCR) etkileşimini içerir. CD4 + T hücreleri, tipik olarak bir mikrop bulaşmış hücreler üzerinde gösterildi MHC sınıf I molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin kabul antijen sunan hücreler ve CD8 + T hücreleri üzerinde MHC sınıf II molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin tanır. SıraylaT hücreleri, bir immün tepkisi oynadıkları rolünü değerlendirmek için, onların efektör fonksiyonları, güvenilir ve hassas tekniklerle ölçülür esastır. T hücresi yanıtı değerlendirilmesi için yaygın yöntemler arasında; MHC class-I/II/peptide Tetramer tepkime; ELISPOT ve hücre içi sitokin lekelemesi ile sitokin üretimi; ve 51 Cr-salım deneyleri ile öldürme kapasitesi. Bu deneyler, ancak, tipik olarak in vitro stimülasyon ile ex vivo olarak veya T hücre fonksiyonunun içine sınırlı bir bilgi sağlar edilir. T hücresi tepkilerini ölçümü için in vitro uyarılması yoluyla oluşabilir fonksiyonel parametreler değişiklikleri önlemek için bu nedenle T hücrelerinin herhangi bir manipülasyon ile, ortaya İdeal olarak, bu in vivo, in situ onları değerlendirmek için yararlı olacaktır. En sık vivo T hücresi işlevsel tahlillerde kullanılan bazı in vivo olarak numaralandırılır MHC sınıf I-bağlama peptidleri ile darbeli hedef hücrelerin CTL aracılı öldürme, ölçme dayanmaktadırBöyle CFSE gibi hayati boyalar ile floresan etiketleme yoluyla algılama ile. Bunlar, in vivo deneylerde ne zaman bu tür hedefleri CTL aracılı öldürme izleyebilir olsa da, daha önce nitel parametreleri, izin vermek için gerekli olan, farklı konsantrasyonlarda ve peptit epitoplarının farklı sunulması, birden fazla hedefin öldürülmesini değerlendirmek için nispeten sınırlı bir kapasiteye sahip olması fonksiyonel aviditesi ve epitop varyant çapraz reaktivite değerlendirilecektir. Bu deneyler, aynı zamanda CD4 + T hücre aracılı tepkiler üzerinde herhangi bir bilgi vermemektedir. Son zamanlarda tek bir hayvanda aynı anda&gt; 250 hedef hücrelere karşı T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar floresan hedef diziler (STA) göre çok katlı bir analiz geliştirdik, T hücresi tepkilerini değerlendirmek için kullanılan mevcut yöntem ile sınırlamaları birçok üstesinden gelmek için, 1, 2 akım sitometri. FTA sev ile etiketlenmiş lenfosit oluşmaktadırBenzersiz floresans&gt; 250 hücre kümeleri elde edilecek sağlayan CFSE, CTV ve CPD gibi vital boyaların eral konsantrasyonları ve kombinasyonları yer alır. Bu hücreler, canlı ve bütünüyle işlevsel olarak kalmaları için, bunlar, in vivo 3 efektör T hücreleri ile etkileşimi izlenmesini sağlamak için hayvanlara enjekte edilebilir. Örneğin, FTA hücre kümeleri, hedef hücrelerin 1 antijen spesifik CTL aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için MHC sınıf-I-bağlama peptidleri ile pulse edilebilir. Buna ek olarak, FTA hücre kümeleri imkan veren, MHC sınıf II-bağlama peptidleri ile doldurulan edilebilir antijene spesifik T yardımcı hücresi örneğin CD69, CD44 ve / veya aktivasyonu ile değerlendirilmesi (aktivasyonunun değerlendirilmesi ile (T H) aktivitesinin değerlendirilmesi soydaş peptid 2 taşıyan FTA içinde B hücrelerinin CD62L). 250&#39;den fazla hedefler aynı anda tespit edilebildiğinden, bu n ile doldurulan çok sayıda hedef hücre kümeleri karşı CTL ve T H tepkilerini ölçmek mümkündürfarklı konsantrasyonlarda ve pek çok kez tekrarlanabilir ve de dahil umerous peptidler. FTA tahlil bu nedenle in vivo T hücre efektör cevabının değerlendirilmesinde görülmemiş bir düzeyi sağlar. Burada ayrıntılı olarak FTA yapımını tarif ve in vivo olarak T hücresi tepkilerini değerlendirilmesi uygulanabilir şeklini göstermektedir. Prosedür, MHC sınıf I ve II-bağlama peptidleri ile doldurulan 42 hücre kümelerinin 6 tekrarlar oluşan üç vital boyaların kullanımı yoluyla 252 belirgin bir hücre kümeleri içeren bir FTA birlikteliğinin yapımını da açıklar. Etiketleme miktarını azaltmak için gerekli olan 42 hücre kümelerinin etiketleme tüpleri dipli, 10 ml konik ortaya çıkar ve bu da Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi bir tüp rafa bu hazırlamak için yararlıdır. Bu yöntem, ayırt kümelerinin daha küçük sayıları için ayarlanabilir her bir boya 1 uygulandı. Biz, bu tepkiler kazanmakla ölçebilir gösteren ile tahlilin programı vurgulamakFarelerin bir küçük hasta birden fazla epitoplara karşı rekombinant çiçek hastalığı virüs aşısı tarafından üretilen es. Bu, FTA deney sırasıyla yoluyla eğrisi (AUC) değerlendirmeleri ve yarı maksimal tepkileri (EC 50) oluşturmak için gerekli etkili peptid konsantrasyonunun ölçülmesi altındaki alan kullanımını kümülatif yanıtları ve fonksiyonel avidite ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69 parlak menekşe 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi (Fortessa veya mavi, kırmızı ve mor lazer kaynağı ile eşdeğeri)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t hücre yanıtlarının değerlendirme floresan hedef dizilerin kullanımı<em&gt; in vivo</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

In vivo T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi ve immünoterapilerin tasarımı için önemlidir. Ve kırmızı lazer heyecanlı boyalar (Hücre Çoğalma Boya eFluor 670: İşte biz böyle carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE), mor lazer heyecanlı boyalar (CTV CellTrace Violet): hayati boyalar kullanır floresan hedef array (FTA) teknolojinin kullanımını tanımlamak CPD )&gt; 250 belirgin bir floresan hücre kümeleri haline etiketli fare lenfositlerinin kombinasyon yöntemiyle için. Bu STA içinde hücre kümeleri ana doku uyumu (MHC) sınıf-I ve MHC smıf-II bağlama peptidleri ile doldurulan ve bu şekilde sırasıyla CD8 + ve CD4 + T hücreleri için, hedef hücre olarak hareket edilebilir. Bu hücreler, FTA uygulanabilir ve tamamen işlevsel kalır ve bu nedenle, FTA hedef hücreler ve CD4 + T hücresi tasarlandığını yardımseverli CD8 + T hücre aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için farelere verilebilirlerakış sitometrisi ile in vivo gerçek zamanlı olarak FTA B hücresi, hedef hücrelerin, s. &gt; 250 hedef hücreler aynı anda değerlendirilebilir bu yana, çeşitli teknik konsantrasyonlarda ve birden fazla kez tekrarlanmış çeşitli epitoplara karşı antijen T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, bu teknik, bir sayısal (yanıtın örneğin kümülatif büyüklük) ve niteliksel (örneğin,. Fonksiyonel aviditesi ve yanıtı epitop çapraz reaktivite) seviyesinde hem de T hücresi tepkilerini ölçebilir. Burada, bu FTA inşa edilmiş ve bir rekombinant çiçek virüsü aşısı ile uyarılan T hücresi tepkilerini değerlendirmek için uygulanabilir bir örnek vermek vardır açıklanmıştır.

FTA deneyinin kullanımına ilişkin bir örnek olarak, BALB / c fare, HIV-I CTL epitopuna HIV-I epitopların (VV-HIV) ile ifade edilmek rekombinant aşı virüsü (VV) ile bağışıklı hale getirilmiştir, Gag, Gag mut, Env ve Pol, VV CTL epitopları F2L ve F2L mut ve HIV-I T H hücresi epitopu, Gag Th (2 de tarif edildiği gibi) bir 252 parametre FTA deneyi (Şekil 1 B) kullanılarak değerlendirildi. Gag (Gag mut) ve F2L (F2L mut) epitop varyantları VV-HIV vektörü içinde ifade edilir ve bu nedenle...

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak&gt; 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Bu prosedürün genel amacı, çok parametreli akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirilen immün analizler için 252 adede kadar farklı şekilde işaretlenmiş floresan hedef hücre dizisi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle hedef lenfositlerin CFSE ve CTV gibi canlı hücre boyalarıyla benzersiz kombinasyonlar ve yoğunluklarda işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, her bir farklı hedef lenfosit popülasyonuna aday MHC Sınıf I ve MHC Sınıf II bağlayıcı peptid epitoplarının verilmesidir.Bunu, epitopların özgüllüğünü korumak için hücrelerin kapsamlı bir şekilde yıkanması, ardından hücrelerin havuzlanması ve bir hayvana enjekte edilmesi takip eder. Son adımlar, floresan etiket dizisi hücrelerinin belirli dokulardan hasat edilmesi, etiketlenmesi ve MHC peptit spesifik yanıtlar açısından değerlendirilmesidir. Nihayetinde, akış sitometrisi sonuçları, hedef hücre ölümünü ölçerek CTL yanıtlarını ve B hücresi hedeflerindeki aktivasyon belirteçlerinin yukarı regülasyonunu ölçerek CD four pozitif T yardımcı hücresi yanıtlarını gösterebilir. Bu tekniğin geleneksel in vivo CTL analizlerine göre temel avantajı, tek bir hayvanda 250'den fazla hedef hücrenin eş zamanlı olarak ölçülmesine olanak tanımasıdır; prosedürü laboratuvarımdaki araştırma görevlisi Ben Quire gösterecektir.Prosedür, farelerin izole edilmiş dalak ve/veya lenf düğümlerinden toplanan lenfositlerin filtrelenmesini ve %5 fetal calf serum içeren 11,5 mililitre RPMI içerisinde mililitre başına 200 milyon hücreye kadar yeniden süspande edilmesini gerektirir. FDA hazırlığı etiketleme ile başlar. 1'den 42'ye kadar numaralandırılmış 42 adet 10 mililitrelik konik tabanlı plastik tüp kullanılır; tüm hücreler, 252 ayırt edilebilir hücre kümesi oluşturmak amacıyla altı farklı konsantrasyonda yedi farklı peptit epitopu ile altı kez tekrarlanarak pulse edilir.Şimdi, tüpü birkaç kez ters çevirerek lenfositleri tamamen yeniden süspanse edin. Ardından, tüplerin üst yarısını ıslatmamaya dikkat ederek, 37'den 42'ye kadar etiketlenmiş 10 mililitrelik tüplere 1.9 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Şimdi 38 numaralı tüpün kapağını açın ve tüpü yatay konuma getirin. 83 µL PBS ekleyin. Ardından, metin protokolündeki tablo ikide sunulan uygun CTV stokundan 17 µL ekleyin.Tüp yüklendikten sonra vorteksleyin. Aynı işlemi, tablo iki'de listelendiği gibi her tüpe farklı bir CTV stoğu gelecek şekilde 39 ile 42 arasındaki tüpler için tekrarlayın.Şimdi hücreleri oda sıcaklığında en az beş dakika inkübe edin. Ardından her tüpe %5 FCS içeren beş mililitre RPMI ekleyin. Her tüpteki hücreleri vorteksleyerek tamamen yeniden süspande edin. Süspansiyonun bir mililitresini, metin protokolünde belirtilen önerilen yükleme düzenini takip ederek diğer altı tüpe aktarın; her aktarım sırasında, yüklü tüpün üst kısmını ıslatmamak önemlidir. Hücreleri CFSE ile işaretlemek için, bir mililitre hücre içeren 31 ila 36 numaralı tüplerin kapaklarını çıkarın ve tüpleri diğer tüplerin yanına yatay olarak yerleştirin.Öncelikle, kuru üst duvara püskürterek 103 µL PBS ekleyin. Ardından, metin protokolündeki tablo üçe göre uygun CFSE stok çözeltisinden yedi µL ekleyin ve tüpü hemen vorteksleyin. Bu işlemi tablo üçte gruplandırıldığı şekilde diğer tüpler için tekrarlayın.Her tüpe farklı bir CFSE stok çözeltisi eklendiğinden emin olun. Tüm tüpleri oda sıcaklığında en az beş dakika inkübe edin. Beş dakika bekledikten sonra, markalamayı tamamlamak için hücreleri yıkayın.Her bir süspansiyonu, oda sıcaklığındaki 5%FCS içeren dokuz mililitre RPMI ile seyreltin. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 GS ile pelletleyin ve süpernatanları bir transfer pipeti kullanarak aspirasyonla uzaklaştırın; MHC Sınıf bir ve MHC sınıf iki bağlayıcı peptidlerin hazırlanışı metin protokolünde sunulmuştur. Bu bölüm, hücrelerin bu peptidlerle nasıl pulse etiketleneceğini göstermektedir.İlk olarak, tüpleri bir ızgara boyunca kaydırarak hücre peletini artık besiyerinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücre süspansiyonunun toplam hacmini %5 FCS içeren PMI besiyerimizle 250 microliters seviyesine getirin. Her bir hücre peleti için yaklaşık 200 microliters besiyeri gerekecektir.Ardından, tablo beşte listelenen önceden hazırlanmış peptit stoklarından 250 µL'yi belirlenen tüplere ekleyin. Tablo birde sunulan desene uyun ve T hücresi yanıtlarını hesaplamak için yalnızca PBS içeren bir kontrol tüpü eklediğinizden emin olun. Her bir peptit epitopunun ve her bir peptit konsantrasyonunun tek bir tüpe atanması ve bunun, söz konusu tüpteki hücrelerin beklenen floresansı temel alınarak net bir şekilde kaydedilmesi kritik önem taşır.Bu kümenin floresan imzası bu peptidi tanımlayacağı için, her bir hücre süspansiyonunu vorteksleyerek karıştırın ve ardından hücreleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücreleri yıkamak için yıkama işlemine geçin. İlk olarak, her bir hücre süspansiyonuna beş mL buz gibi soğuk %5 FCS içeren RPMI ekleyin ve tüpleri alt üst ederek hücreleri yeniden süspande edin.Ardından, her hücre süspansiyonunun altına, hücrelerin 4 °C'de 300 G'de 10 dakika santrifüj edilmesiyle elde edilen üç mililitre buz soğukluğunda FCS sedimentini dikkatlice ekleyin. Her tüpte çözelti ara yüzeyinin korunduğundan emin olmak için yavaş hızlanma ve frenleme kullanın. Önce RPMI'yı, ardından yıkanmış hücre peletini rahatsız etmeden FCS'yi dikkatlice aspire ederek uzaklaştırın.Peletler izole edildikten sonra, hücreleri tekrar yıkayın; iki kez yıkanmış hücre peletlerini 5%FCS içeren 10 mililitre buz soğuğunda RPMI içerisinde yeniden süspande edin ve santrifüj işlemini tekrarlayın; döndürme işleminden sonra süpernatanları dökün. Ardından tüm popülasyonları, 5%FCS içeren altı mililitre buz soğuğunda RPMI ile birlikte yeni bir 10 mililitrelik tüpte birleştirin, birleştirilen hücreleri santrifüj ile çöktürün ve prosedürün bu aşamasında süpernatanı bir transfer pipeti ile aspire ederek uzaklaştırın.Peptit pulse hücrelerinin altı farklı CPD konsantrasyonu ile işaretlenmesiyle altı intra-assay tekrarı oluşturulabilir. İlk olarak, birleştirilmiş hücre peletine %5 FCS içeren oda sıcaklığındaki 11,4 mililitre RPMI ekleyin ve pipetleme yoluyla iyice yeniden süspande edin. İkinci olarak, tüpün üst yarısını ıslatmamaya dikkat ederek, hücre süspansiyonunun 1,9 mililitresini A'dan F'ye kadar etiketlenmiş altı yeni 10 mililitrelik tüpe ekleyin.Hücrelerin CPD ile işaretlemesine başlamak için kapaksız B tüpünü alın ve tüpü kuru duvar boyunca yatay olarak yerleştirin. Öncelikle, 92 µL PBS ekleyin ve ardından tablo dörde göre uygun hacimde stok CPD ilave edin. Ardından karışımı vorteksleyin. Her tüpe tablo dörtte belirtildiği gibi farklı bir CPD stoğu geldiğinden emin olarak bu adımı C ila F tüpleri için tekrarlayın.Tüm tüpler karıştırıldıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmeye bırakın. Ardından hücreleri iki kez yıkayın; önce hücreleri 10 milliliters oda sıcaklığındaki besiyerinde yeniden süspanse edin. İkinci olarak, santrifüjle çöktürün ve üçüncü olarak süpernatanları bir transfer pipeti ile aspire ederek uzaklaştırın.Ardından işlemi tekrarlayın. Şimdi, A'dan F'ye kadar olan tüm tüplerdeki hücreleri, 8 mL buz gibi soğuk besiyerinin bulunduğu tek bir tüpte birleştirin.Hücreleri santrifüj ederek toplayın ve ardından hücrelerin hayvanlara enjeksiyonu ile sonraki akış sitometrisi analizine geçin. Detaylar metin protokolünde verilmiştir. Bir BC faresi, HIV V one epitoplarını eksprese eden rekombinant vaccinia virüsü ile immünize edilmiş ve çeşitli epitoplara verilen yanıtlar 252 parametreli bir FTA analizi kullanılarak değerlendirilmiştir.gag mute ve FTL mute olmak üzere iki epitop varyantı vektörde eksprese edilmedi ve naif farelere ayrıca FTA enjekte edildi. TA, P KH 26 etiketlemesi ile konak fare hücrelerinden ayırt edildi ve FTAB hücreleri akış sitometrisi yoluyla B two 20 antikor boyaması ile ayırt edildi. Altı hayvan içi tekrarlamanın her biri CPD floresansı temel alınarak kapılandı; çeşitli epitop konsantrasyonlarını eksprese eden FTA hedefleri ise CFSE ve CTV floresansı temel alınarak kapılandı.Her bir tekrarda spesifik öldürme oranı, primeli hayvanlardaki FTA küme hücre ölümü, naif hayvanlardaki karşılık gelen FTA kümeleri ile karşılaştırılarak değerlendirildi. Helper T aktivitesi, primeli hayvanlardaki FTA B hücresi CD 69 yukarı regülasyonu, naif hayvanlardaki karşılık gelen FTA B hücresi kümeleri ile karşılaştırılarak değerlendirildi. Bu analizden elde edilen verilere göre, V-V-H-I-V enfeksiyonu, immunodominant VV epitopu F two L'ye karşı en güçlü CTL yanıtlarını oluşturmuş olup, 0.001 micromolar veya daha fazla epitop ile pulse edilen FDA hedef hücrelerinin %100'ü dalaktan temizlenmiştir.CTL yanıtlarına ek olarak, FTA testi, H-I-V-M-H-C sınıf iki bağlanma epitopu HIV gag th ifade eden FTAB hücrelerinin aktivasyonunu değerlendirerek yardımcı T yanıtlarını da ölçmüştür. Bu durum, priming uygulanmış hayvanlarda antijene özgü B hücresi aktivasyonunun gerçekleştiğini göstermiş ve HIV gag, T spesifik yardımcı T hücresi efektörlerinin oluştuğunu ortaya koymuştur. Bu videoyu izledikten sonra, 250'den fazla hedef hücreden oluşan floresan bir hedef dizisinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

the-use-fluorescent-target-arrays-for-assessment-t-cell-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, floresan bazlı test yoluyla immünomodülatör bileşiklerin taranmasını göstermektedir. Yeşil floresan protein ekspresyon kasetlerine sahip transgenik fare kaynaklı T lenfositleri bu bileşiklerle tedavi edilir. Geliştirilmiş ve azaltılmış GFP sinyalleri, sırasıyla bileşiklerin uyarıcı ve inhibitör etkilerinin tanımlanmasını sağlar.

İmmünomodülatör Bileşiklerin Taranması için Tasarlanmış Lenfositlerin Kullanıldığı Floresan Bazlı Bir Test

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Öğrenin, floresan hedef dizileri kullanarak canlı ortamda T hücre yanıtlarını değerlendirmeyi. Bu yöntem, akış sitometrisi ile 250'den fazla parametreyi aynı anda ölçerek immünolojik araştırmalarda detaylı bağışıklık analizi sağlar.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı

Daha fazla video keşfet