Kombine DNA-RNA Floresan In situ Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, C iki hibridizasyon veya D-N-A-R-N-A balığında aynı anda birleştirilmiş DNA ve RNA floresan vasıtasıyla farklılaşmış dişi fare embriyonik kök hücrelerinde X kromozomu inaktivasyonunu incelemektir. Bu, ilk olarak dişi fare embriyonik kök hücrelerinde farklılaşmayı indükleyerek gerçekleştirilir. Normal implantasyon sonrası embriyonik gelişimi simüle eden bu işlem sırasında olduğu gibi, X kromozomu inaktivasyonu başlatılır, bu da gelecekteki inaktif X kromozomunu kodlayan kist RNA'sının transkripsiyonu ve birikimi ile sonuçlanır.

İkinci adım, farklılaşmış embriyonik kök hücreleri paraldehit kullanarak sabitlemektir. Daha sonra, DNA parçalarını biyotin veya digo genin ile etiketleyerek hem X kromozomundan hem de kist RNA'sından DNA'yı tespit etmek için probları hazırlayın. Nick çevirisini kullanma.

Son adım, D-N-A-R-N-A FISH prosedürünü gerçekleştirmektir. Farklılaşmış embriyonik kök hücreler, etiketli balık problarına nüfuz eder, denatüre edilir ve hibritlenir, bunlar daha sonra haps cinsinden biyotin veya diggeni tespit eden floresan konjuge antikorlar kullanılarak tespit edilir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskopi, dişi hücrelerdeki iki kromozomun yerini göstermek ve inaktivasyona uğrayan X kromozomundan kist RNA'nın ekspresyonunu görselleştirmek için SU'dur.

Bu tekniğin, RNA ve DNA'nın daha sonra tespit edildiği FISH yöntemleri gibi diğer yöntemlere kıyasla en büyük avantajı, protokolümüzü kullanarak, iki günden daha kısa bir sürede aynı örnekte her iki nükleik asit tipini aynı anda tespit edebilmemizdir. Kombine DNA ve RNA balıklarının performans göstermesi zor olsa da, DNA veya RNA'yı tespit etmek için en uygun koşullar önemli ölçüde farklılık gösterir. Burada sunulan protokolü kullanarak, analiz edilen hemen hemen tüm hücrelerde mevcut RNA ve her iki X kromozomundan türetilen DNA'yı tespit edebiliyoruz.

Bu, dişi fare embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması veya anormal dişi fare gelişimi sırasında meydana gelen X kromozomunu aktivasyonda incelememize izin verdi. Bu yöntem, erken fare embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen önemli ve büyüleyici bir süreç olan aktivasyon sürecinde X hakkında bilgi sağlayabilse de, kodlamayan RNA'ların biyolojik sistemlerdeki önemi nedeniyle giderek daha fazla takdir edilmesi ve genellikle tek hücreli yaklaşımların alternatif yaklaşımlara göre tercih edilmesi nedeniyle, doğal kromatinden türetilen RNA transkriptlerini tespit etmenin önemli olduğu diğer biyolojik sistemlere de uygulanabilir tüm hücre popülasyonlarının değerlendirildiği yer. Bu protokolün geniş bir bilim camiası için faydalı olacağını öngörüyoruz.

Dişi fare embriyonik kök hücreleri veya E ESL, farklılaşma indüksiyonu prosedürünü başlatmak için fare embriyonik fibroblastları ORM'leri ile kaplanmış jelatinleştirilmiş kültür kapları üzerinde standart ESL koşulları altında büyütülür. ES ortamını ESL kültüründen çıkarın ve hücre kültürü PBS ile iki kez yıkayın: 1.5 mililitre TRIPSIN EDTA ekleyin, 37 santigrat dereceye ısıtın ve hücreleri yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 3,5 dakika sonra, kolonileri parçalamak için tabağı hafifçe çalkalayın.

Hücrelere 3.5 mililitre farklılaşma ortamı ekleyerek tripsin EDTA'yı etkisiz hale getirin, tek bir hücre çözeltisi elde etmek için hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin ve bunları 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. 10 mililitre farklılaşma ortamında hücreleri topladıktan sonra, hücre süspansiyonunu jelatinleşmemiş 10 santimetrelik bir kültür kabına ekleyin ve bir saat inkübe edin. Bir hücre kültürü inkübatöründe, MES jelatinleşmemiş kültür kabına yapışabilecek, ES hücreleri ise süspansiyon halinde kalacaktır.

Bu arada, steril cam kapak fişlerini altı kuyucuklu plakaya yerleştirin,% 0.2 jelatin ekleyin ve en az beş dakika inkübe edin. Bir saat sonra oda sıcaklığında, esas olarak yapışmayan e ESL'lerden oluşacak olan prepl ESL kültürünün snatını toplayın. E ESL plakasını seyrelttikten sonra, kapak fişleri içeren altı oyuklu plakaya yerleştirin.

Bu prosedüre, farklılaşma ortamını farklılaşma kültürlerinden çıkararak ve hücre kültürü PBS ile iki kez yıkayarak başlayın. Hücrelerin yıkanmasını önlemek için PBS'yi dikkatli bir şekilde eklediğinizden emin olun. % 4 para formaldehit PBS ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin.

10 dakika sonra para formaldehiti çıkarın ve lamele fişlerini %70 etanol ile üç kez yıkayın. DNA problarını etiketlemeye hazırlamak için, önce her bir DNA'nın bir mikrogramını toplam 16 mikrolitre hacimde su içinde seyreltin. Daha sonra girdaplama ile karıştırılmış dört mikrolitre öküz genin veya biyotin etiketleme çözeltisi ekleyin ve 16 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin.

Bu, NIC çevirisi ile biyotin veya kazma oksijen etiketli nükleotidleri içerecektir. Bu arada G 50 sütunlarını hazırlayın. Entegre olmayan nükleotidleri çıkarmak için iki mililitrelik bir şırınga alın, damgalayıcıyı çıkarın ve şırıngaya sterilize pamuk ekleyin.

Şırıngayı doldurmak için G 50 topları ve çözelti ekleyin. Daha sonra bir dakika boyunca 642 GS'de 15 mililitrelik bir tüp santrifüjüne bir şırınga yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra, şırınganın yaklaşık% 80'i G 50 ile doldurulmalıdır 90 dakika sonra, her NIC translasyon reaksiyon karışımına 40 mikrolitre su ekleyin ve reaksiyonu G 50 kolonuna aktarın.

Kolonun altına boş bir tüp ekleyin ve iki dakika boyunca 642 Gs'de santrifüjleyin. Akışı bir reaksiyon tüpünde toplayın. Akış hacmini bir pipetle ölçün ve ardından toplam 200 mikrolitre hacme ulaşmak için su ekleyin.

Akışı hızlandırmak için somon spermi, DNA mayası TRNA faresi 1D NA yakaladı ve girdaplama ile karıştırılmış iki molar sodyum asetat ekleyin. 533 mikrolitre buz gibi% 100 etanol ekleyin ve tüp santrifüjünü 16, 200 Gs'de dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sallayın. Santrifüjleme işleminin tamamlanmasının ardından, supra natanı çıkarın ve peleti dört santigrat derecede beş dakika boyunca 16.200 Gs'de% 70 etanol santrifüj ile iki kez yıkayın ve peleti havayla kurutun.

Pelet kuruduğunda. 50 mikrolitre, 50 artı hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Geçirgenlikten önce çözünmeyi kolaylaştırmak için, sabit hücreleri yeniden sulandırın, %70 etanolü çıkararak ve hücrelere hücre kültürü PBS ekleyerek kaymaları ortaya çıkarın.

Beş dakika inkübe edin, toplam üç kez tekrarlayın, böylece hücrelere izin verin. Hücre kültürü PBS'yi çıkarın ve altı Kuyucuk plakasına% 0.2 pepin ekleyin. Plakaları dört dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin.

Bundan sonra, pepin'i çıkarın ve RNA içermeyen su ile etkisiz hale getirin. Hücreleri% 4 paraform aldehit PBS ile oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek sabitleyin, fiksasyondan sonra hücre kültürü veya PBS ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Üç dakika% 70 etanol, üç dakika% 90 etanol ve üç dakika boyunca yüzde yüz etanol ile inkübe ederek hücreleri kurutun.

Bundan sonra, kapak altı kuyucuklu plakadan kayar ve kapak fişlerini birkaç dakika kurutun. Kapak kızaklarını sıcak bir plaka üzerinde bir saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe ederek hücreleri yaşlandırın. Bu arada, fare ceketi 1D NA ile önceden hibritleştirilmiş balık probları, analiz edilecek her bir örtü astarı için bir araya getirilerek bir araya getirilir.

25 mikrolitre 50 artı hibridizasyon çözeltisi. Bir mikrolitre biotin etiketli kist: Bir mikrolitre digo oksijen ve etiketli BAC probu, X kromozomunu ve 0.5 mikrolitre fare ceketi 1D NA'yı tespit ederek girdaplama yoluyla karıştırılır ve doğada beş dakika boyunca 99 santigrat derecede. Karyola 1D NA'nın probda bulunan dizileri tekrarlamak için hibritleşmesine izin vermek için hemen 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin.

Kapak fişleri üzerindeki hücreler yaşlandıktan sonra, bir cam slayt üzerine 50 mikrolitre olgunlaşma tamponu koyun ve kapak fişlerini de olgunlaşma tamponuna bakacak şekilde hücrelerin üzerine koyun. 65 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Kapak kızaklarını buz gibi,% 70 etanol ile önceden doldurulmuş altı kuyucuklu plakaya geri aktararak hücreleri sabitleyin ve beş dakika inkübe edin.

Hücreleri daha sonra üç dakika boyunca% 70 etanol, üç dakika% 90 etanol ve% 100 etanol üç dakika inkübasyon ile dehidre edin. Kapak fişlerini altı kuyulu plakadan çıkarın ve birkaç dakika kurumaya bırakın. Önceden hibritleştirilmiş Prob'u bir cam slayt üzerinde yerleştirin ve inkübatörde üstte bir kapak kayması.

Slaytları 50 mililitre% 50 IDE iki XSSC ile doldurulmuş nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, kapak cam slaytlardan kayar, iki XSSC ile doldurulmuş altı duvar plakasına 42 santigrat dereceye kadar ön ısıtma yapılır. 42 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

İki XSSC'yi çıkarın ve% 50 form MI iki XSSC ekleyin. 42 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. %50 form IDE iki X-S-S-C-A ile yıkama başına 42 santigrat derecede 10 dakika boyunca toplam üç kez yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, %50'lik formundaki iki XSSC'yi çıkarın ve slaytları 50 mikrolitre tris salin BSA veya T-S-P-S-A'yı tıkamak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki kez tris salin tween veya TST ile yıkayın. Kapak kayması, yeni cam slaytların üzerine ve kapak fişlerini baş aşağı cam slaytın üzerine yerleştirin, oda sıcaklığında TST nemlendirilmiş karanlık bir odada 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, kapak fişlerini altı oyuklu plakaya geri aktarın ve ilk antikor İnkübasyon noktası için TST ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın, kapak kızağı başına 50 mikrolitre koyun antijeni ve antikoru yeni cam slaytlara yerleştirin ve kapak fişlerini cam slayt üzerine baş aşağı yerleştirin, A TST nemlendirilmiş karanlık odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, kapak kaymaları, beraberindeki el yazmasında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi orijinal sinyali geliştirmek için bir dizi floresan etiketli antikor ile inkübe edilir. Bir dizi floresan etiketli antikor ile inkübasyondan sonra, hücreleri her biri% 70 etanol,% 90 etanol ve% 100 etanol içinde üç dakika inkübe ederek dehidre edin. Kapak fişlerini altı kuyulu plakadan çıkarın ve birkaç dakika kurumaya bırakın.

Son olarak, her cam slaytta dappy ile bir damla montaj ortamı bulun. Üstüne baş aşağı bir kapak fişi ekleyin ve slaytları oje ile kapatın. Kombine D-N-A-R-N-A FISH X kromozom inaktivasyonu için bu protokolün kullanılması, dişi ES hücrelerinin farklılaşmasında görselleştirilebilir.

Bu şekil, hem kist RNA'nın hem de X kromozomunun bir bölgesinin aynı anda tespit edildiği A-D-N-A-R-N-A balık deneyinin temsili bir örneğini göstermektedir. Kist, RNA, X kromozomu inaktivasyonu süreci için gerekli olan kodlamayan bir RNA'dır. Kadın ESL'sini burada kistin ayırt etmesinde, RNA, rumine konjuge edilmiş ve kırmızı ile gösterilen antikorlar kullanılarak görselleştirilen biyotin etiketli bir CD NA probu kullanılarak tespit edilir.

X kromozomu, etiketli BAC probunda bir xigen kullanılarak tespit edilir, bu da yeşil çekirdeklerde belirtilen FITC'ye konjuge antikorlar kullanılarak görselleştirilir ve mavi ile gösterilen DPI ile karşı boyanır. Hemen hemen her hücrede iki x kromozomu tespit edilir. Hem inaktif X kromozomları veya kist bulutları üzerinde büyük kist birikimleri hem de aktif X kromozomu veya kistten bazal kist ekspresyonu nokta atışları tespit edilir.

Kist nokta noktası her çekirdekte tespit edilmez, çünkü farklılaşma üzerine bu bazal kist ekspresyonu gelecekteki aktif X kromozomu üzerinde durur. X kromozomundan türetilen bazı nokta sinyallerinin kist bulutları içinde yer aldığını, böylece kist bulutunun gerçekten de X kromozomu boyunca lokalize olduğunu ve bir kez ustalaştıktan sonra kodladığını gösterdiğini unutmayın. Bu teknik iki günden daha kısa sürede yapılabilir ve uygun şekilde uygulanırsa güvenilir bir sonuç alınabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, dişi fare embriyonik kök hücrelerinin farklılaşmasını nasıl indükleyeceğinizi, bu hücreleri nasıl düzelteceğinizi ve bunları kombine D-N-A-R-N-A balığı gerçekleştirmenize izin verecek şekilde nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Deneylerinizin başarısı için bu protokolde belirttiğimiz gibi sıcaklıkları ve kuluçka sürelerini sabit tutmanın önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca, temiz bir ortamda çalışmak önemlidir.

Farklı bir hücre tipi kullanıyorsanız veya farklı bir biyolojik sistem üzerinde çalışıyorsanız, size en iyi sonucu sağlamak için bazı optimizasyonlar gerekebilir. Deneylerinizde iyi şanslar.