Geçirgenliği için bir yöntem Drosophila Embriyolar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tanıtılan küçük moleküllü ilaçların veya toksinlerin biyoaktivitesini test etmek için geçirgen bir yumurta kabuğu ile canlı drosophila embriyoları hazırlamaktır. Bu, ilk olarak gelişimsel olarak evrelenmiş embriyoların dış koryonik yumurta kabuğu katmanlarını çıkarmak için seyreltik ağartıcı ile muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, embriyolara, küçük moleküllü çözünen maddeleri bloke eden ince mumsu yumurta kabuğu tabakasını tüketen bir çözücü ile nüfuz etmektir.

Üçüncü adım, yumurta kabuğunun geçirgenliğini aynı anda ölçmek ve ilgilenilen bir bileşiği eklemek için embriyoları bir ilaç veya toksin ve bir boya ile tedavi etmektir. Daha fazla geliştirmeden sonra, embriyolar doğrudan görüntülenebilir veya immünohistokimya için işlenebilir. Sonuç olarak, sonuçlar, immün reaktifler veya hayati bağlar ile floresan mikroskobu ile belirlenen dokuların gelişimi üzerindeki bir ilacın veya toksinin aktivitesini gösterebilir.

Bugün, küçük molekül aktivitesinin tahlilleri için drosophila embriyolarına nüfuz etme yöntemimizi sunacağım. Bu tekniğin, heptan gibi geleneksel organik çözücülerin nüfuz etmek için kullanılması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları. Yumurta kabuğu, embriyo geçirgenlik çözücümüzün veya EPS'nin sudan kaçırılabilir ve nispeten toksik olmamasıdır.

Bu özellikler, solvent maruziyetlerinin daha hassas bir şekilde kontrol edilebildiği ve fizyolojik olarak ilgili ortamlarda gerçekleştirilebildiği embriyo tedavilerini kolaylaştırır, bu da her ikisi de daha fazla embriyo canlılığı ile sonuçlanır. Bu yöntem için fikir ilk olarak yumurta kabuğunun mumsu tabakasını nasıl çıkaracağımı düşündüğümde aklıma geldi. Bir kayakçı olarak, kayakların tabanından kalan balmumunu çıkarmak için narenciye çözücüsünün yaygın kullanımı üzerine düşündüm.

Bu, bu uygulamayı sinek embriyosu yumurta kabuğuna çevirmemi istedi ve bazı deneme yanılmalardan sonra EPS bileşiminin çözülmesine yol açtı, İstenilen suşlardan en az 500 çiftleşme yaşı sineği olan popülasyon kafesleri hazırlayın. Kafeslere 10 santimetre üzüm suyu takılmalıdır. Bir miktar maya ezmesi ile havalandırır.

Bu plakaları günde iki kez değiştirin. Birkaç gün sonra, sinekler kültüre şartlandırılacak ve embriyoları daha düzenli olarak bırakacaktır. EPS, yüzey aktif maddelerden ve sınırlayıcı çözücü çözeltilerinden yapılır ve iki ay boyunca iyidir.

Oda sıcaklığında saklandığında, taze EPS'yi karıştırırken yüzey aktif maddeleri 37 santigrat dereceye ısıtın EPS tedavisi için embriyolar üç santimetreden yapılmış sepetlerle işlenir, böylece 50 mililitre polipropilen tüp ve naylon ağ pürüzlendirilir. Plastik kenarlar, daha sonraki geliştirme adımlarında ağa daha kolay erir. Embriyolar ayrıca 50 mililitrelik tüplerin kapaklarından yapılan sepetlerle de işlenir.

Kapak delinir ve çentiklenir ve kapak ile boru arasındaki diş ağı sabitler. Alternatif olarak, yerel olarak makinede bir kaydırma odası kullanılır ve oksijen geçirgen bir parça ile hazırlanır. Embriyoları hasat etmek için açıklığın üzerine bir tutucu halka ile sabitlenmiş zar yapın.

Sabahları kültürün üzerine maya ezmesi ile taze bir üzüm tabağı koyun. Bir saat sonra plakayı değiştirin ve ilk toplanan plakayı atın. İkinci plakanın embriyoları 25 santigrat derecede iki saat boyunca toplamasına izin verin.

Sonra plakayı toplayın ve 18 santigrat dereceye aktarın. Embriyoların istenen aşamaya gelmesine izin verin. Embriyolar hazır olduğunda, EPS tedavisinden önce onları kaplayın.

Bunları plakadan suyla ve bir boya fırçası kullanarak püre sepetine durulayın. İkinci olarak, kalıntıları temizlemek için hafif akan suda durulayın. Üçüncüsü, ağartma çözeltisinin periyodik sirkülasyonu ile iki dakika boyunca% 50 ağartıcıya batırın.

Ardından hemen akan su ile durulayın. Şimdi altı adet 60 milimetrelik tabağı banyo işlevi görmesi için her biri 10 mililitre PBS ile doldurun ve MBIM'de bir ila 40 arasında bir EPS stoğu seyreltme yapın, karışımı döndürün. Beyaz bir emülsiyon oluşturacak, ağ sepetinin altındaki fazla suyu bir mendil kullanarak kurulayacak ve embriyoları sürekli dönme hareketi ile EPS seyreltmesine daldıracaktır.

Embriyoları EPS'de 30 saniye döndürdükten sonra, onları çıkarın ve fazla çözeltiyi kurulayın. Daha sonra sepeti altı PBS banyosu arasında hareket ettirin, durulamak için hafifçe fışkırtın ve boya ve ilaç tedavisine devam edin. Geçirgenliği ve canlılığı optimize etmek, bu protokolün en zor kısmıdır.

Geçirgenlik embriyo gelişim aşamasına duyarlıdır. Embriyoların yaşlandığı sıcaklık ve ayrıca bireysel sinek türleri arasında büyük farklılıklar gösterebilir. EPS seyreltmesi ve maruz kalma süresi için en iyi parametrelere ampirik olarak ulaşılmalıdır.

İlk olarak, MBIMT'de 50 mikromolar bir bilimkurgu karboksilik asit boya çözeltisi hazırlayın, bir mikrofiş tüpünde bir mililitre yeterlidir. Akut tedavilerin girdabının karışması için bu aşamada bir toksin veya ilaç eklenebilir. Perme embriyolarını sepetten bir boya fırçası ile mikro füj tüpüne aktarın.

Tüpü kapatın ve birkaç kez ters çevirin. Daha sonra tüpü bir mutatöre yükleyin ve 15 dakika inkübe etmelerine izin verin. Embriyolar yerleştikten sonra, boyayı bir pipetle çıkarın ve yıkama için bir mililitre M-B-I-M-T ekleyin. Resus.

Embriyoları askıya alın, yerleşmelerine ve M-B-I-M-T'yi değiştirmelerine izin verin. Sonra bunu üçüncü ve dördüncü kez yapın. Dördüncü yıkama tamamlandıktan sonra, tüm M-B-I-M-T'yi çıkarın ve embriyoları uzun gelişim dönemleri için bir gelişim sepetine taşıyın.

Geliştirme sepeti için önce sepeti %70 etanol durulama ve ardından di su ile hazırlayın, kanınızı bir laboratuvar mendiliyle kurulayın. Bittiğinde. Daha sonra, sepeti, istenen ilacı veya toksini içeren altı mililitre inkübasyon ortamı içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarın.

Embriyoları bir boya fırçası ile üzerlerine hafifçe inkübasyon ortamı bırakarak sepet içindeki ağa aktarın, embriyoları tek tabaka halinde dağıtın. Ağın altına hava kabarcıkları sıkıştırmamaya dikkat edin. Önce bir sürgülü hazne kullanmak için, hazneyi hazırlayın, sürgülü hazneyi ters çevirin ve açıklığın kenarına ince bir boncuk vakumlu gres koyun.

Daha sonra, açıklık içindeki do membranının yüzeyine istenen ortamdan 150 mikrolitre yükleyin. Şimdi, embriyoları bir boya fırçası kullanarak ortama aktarın ve zarın üzerine dağıtın. Ortamı düzleştiren 25 milimetrelik dairesel bir kapak kayma uygulayarak bitirin.

Sızdırmazlığı sağlamak için çevre etrafına hafif bir baskı uygulayın. Embriyoların 18 santigrat derecede yetiştirilmesinin, EPS tarafından nüfuz etme ve gelişimin geç aşamalarında boya alma yetenekleri üzerinde güçlü bir etkisi vardır. Bu, 25 santigrat derecede yükseltilmiş EPS ile muamele edilmiş embriyolarda Rumine BD alımının olmaması ile gösterilmektedir, burada kırmızı renkte görülen bilimkurgu karboksilik asit boya alımı, EPS ile tedavi edilen embriyolarda tipik olarak görülen çeşitli geçirgenlik seviyelerini ortaya koymaktadır.

Uzak kırmızı bilim kurgu boyasının gelişim sırasındaki dinamik dağılımı ve mavi otofloresan ile görülen gelişmiş bağırsaktaki yumurta sarısında konsolidasyonu, canlılığı değerlendirmek için kullanılan bir kriteri ortaya koymaktadır. Bilim kurgu boyası, formaldehit fiksasyonu ve immüno boyamayı takiben önceki embriyo geçirgenliğini de belirleyebilir. EPS embriyoları bilim kurgu boyası ve metil cıva toksini ile muamele edildikten sonra, motor nöronları etiketlemek için yeşil renkte görülen Antifa iki ve nöron hücre gövdelerini etiketlemek için kırmızı renkte anti E lab ile boyanır.

Bilim kurgu boyası mavi renkte yalancı renklidir. Metil cıva, kontrol tedavisi embriyolarında oklarla işaretlenmiş korton nöron hücre gövdelerinin desenlenmesi üzerinde bir etkiye sahiptir. Bu nöronların daha düzenli bir fasyal özelliği vardır, burada beyaz olarak gösterilen ikisi, ok uçları tarafından belirtilen kontrol tedavisinde segmental nöronların normal dallanmasını göstermektedir.

Karşılaştırıldığında, metil cıva işlemi, düz yeşil oklarla işaretlendiği gibi dallanma modelini değiştirir. İçi boş yeşil ok, dallanmanın yer değiştirdiği yeri işaretler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikte embriyo geçirgenliği tedavileri, uygun şekilde yapılırsa yaklaşık 30 veya 40 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, gelişim sırasında bir ilaç veya bir toksin tarafından hangi spesifik dokuların hedeflendiği gibi ek soruları yanıtlamak için embriyoların fiksasyonu ve immün boyaması gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu prosedürü izlediğiniz için teşekkür ederim ve bu yöntemleri laboratuvarınızda çalıştırmanızda size iyi şanslar dilerim.