Bir Ex vivo Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

Bu prosedürün genel amacı, tiroid gelişimi sırasında meydana gelen morfogenetik ve farklılaşma olaylarının incelenmesine izin vermek için bir ex vivo kültür, fare, embriyonik tiroid implantları veya lobları incelemektir. Bu, önce embriyonik günün üst çenesi ve vücudunun alt kısmı çıkarılarak gerçekleştirilir. Embriyoların boyun bölgesini izole etmek için E 12.5 ila E 14.5 fare embriyoları.

İkinci adımda, soluk borusu ve yemek borusunun üst kısmını ortaya çıkarmak için nöral tüp, yan dokular ve dil çıkarılır. Daha sonra, tiroid tomurcuğu, bölgeler veya loblar istenmeyen dokulardan daha fazla temizlenir. Son adımda, tiroid implantları, kaplanmış bir mikrokuyu veya bir filtre üzerinde kültür için kaplanır.

Sonuç olarak, epitelyal morfogenez üç boyutlu organizasyon ve folikülleri, implantların vaskülarizasyonunu veya tiroid progenitör farklılaşmasını incelemek için hızlandırılmış görüntüleme, immünos boyama veya gen ekspresyon analizi yapılabilir. Bu yöntem, temel gelişimsel ve farklılaştırmayı cevaplamaya yardımcı olabilir. 3D'de tiroid epitel hücre organizasyonu, lümen oluşumu, hücre farklılaşması, polarizasyon ve büyüme hakkında soru.

Prosedürü gösterenler, her ikisi de laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Fidel Marcel ve bir doktora sonrası olan Myla LaCorte olacak. Laminer akış başlığında steril durumda. Tiroid dokusunun izolasyonundan iki saat önce, steril Tip bir kollajeni mililitre başına 50 mikrograma seyreltin. 10 milimolar hidrojen klorürde son konsantrasyon ve kollajeni buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra bir plastik kültür odasının her bir kuyusunu 200 mikrolitre seyreltilmiş kollajen ile örtün ve odayı oda sıcaklığında inkübe edin İki saat sonra kollajeni aspire edin. Kuyuları M1 99 ortamı ile durulayın ve her birine en az 200 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Kaplanmış odaları inkübatöre yerleştirin ve ardından tiroid diseksiyonuna devam edin.

İlk olarak, disseke uterusu HBSS içeren 10 santimetrelik bir plakaya yerleştirin. Daha sonra, uterusun bir ekstremitesini tutmak için forseps kullanın ve ardından embriyoların her birini art arda serbest bırakmak için uterusu küçük bir makasla açın. Embriyoları plasentadan ayırmak için makası kullanın ve daha sonra embriyoları ekstra embriyonik zarları içinde taze HBSS içeren 10 santimetrelik yeni bir plakaya aktarın.

Daha sonra, her embriyo için stereo mikroskop altında diseksiyona devam edin. İlk olarak, yumurta sarısı torbasını ve amnyonu çıkarın. Daha sonra tungsten iğnelerini cam kılcal damarlarda bıçak ve çatal olarak tutun.

Üst çene ve kulaklar da dahil olmak üzere başın üst kısmını çıkarın. Embriyoyu sırtında tutun. Daha sonra nöral tüpün fazladan bir parçasını çıkarın ve ardından embriyonun alt kısmını ön uzuvların hemen altında ve kalbin üzerinde çıkarın.

Dokuyu yönlendirmek için, dilin boyun bölgesini içeren embriyo dilimini taze HBSS içeren 10 santimetrelik yeni bir plakaya aktarın ve nöral tüp ile yemek borusu ve trakeanın arkasındaki dokuları çıkarın. Şimdi doku dilimini dilin her iki tarafı boyunca nazikçe ayırın. Daha sonra yemek borusu ve trakeayı bulun, dili inceleyin, retinoid şişmesini ve dokuyu yemek borusu ve trakeanın her iki tarafında bırakın.

Dili çıkardıktan sonra yemek borusunu diseke edin ve trakea ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Daha sonra timus gibi istenmeyen dokuları ve faringeal ark arterlerinin lateralinde bulunan tüm dokuları inceleyin. Daha sonra E 13.5 veya E 14.5 embriyoları için, trakeanın her iki tarafındaki tiroid loblarını görselleştirin ve lobları trakeadan daha fazla inceleyin.

E 12.5 embriyoları için, dil ve yemek borusu eksize edilene kadar diseksiyon gösterildiği gibi yapılabilir. Daha sonra faringeal ark arterlerini bulduktan sonra, E 13.5 ila 14.5 embriyolarında olduğu gibi tüm yan dokuları çıkarın. Son olarak, bir P 200 mikro pipet üzerinde önceden ıslatılmış bir filtre ucu kullanarak, izole edilen dokuyu ön ısıtma kültür ortamı içeren 35 milimetrelik bir kültür plakasına aktarın.

Kaplamadan önce E 13.5 ila E 14.5 tiroid X exexplain. İlk olarak, lobları önceden kaplanmış odacıklara kaplamak için bir mililitre ön ısıtma kültür ortamı içeren 24 oyuklu bir plakanın üç oyuğuna art arda transfer ederek dokuyu yıkayın. İlk olarak, kültür ortamını aspire edin ve bir tiroid lobunu kültür odalarının her birine dikkatlice yerleştirmek için filtrelenmiş uçlara sahip bir mikro pipet kullanın.

Fazla ortamı çıkarın ve ardından eksplantların matrise yapışmasına izin vermek için kültür odasını bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra iki saat sonra, her bir oyuğa nazikçe 200 ila 300 mikrolitre ön ısıtma kültür ortamı ekleyin ve E 12.5 trakea bölgesini veya tiroid loblarını yarı gözenekli filtrelere yerleştirmek için odaları inkübatöre geri yerleştirin. İlk olarak, 24 oyuklu bir plakanın kuyularını yüz ve 30 mikrolitre Prewarm kültürü ile doldurun.

Orta, filtreleri ortama yerleştirin. Kültür filtresinin altında hava kabarcıklarının sıkışmamasına dikkat edin. Ardından, tiroid ekplanını veya loblarını dikkatlice aktarmak için filtrelenmiş uçlara sahip bir mikro pipet kullanın ve filtrelerin her birinin merkezine, filtre başına maksimum dört x dışa kadar minimum hacimde bir ortam kullanın.

X explan'ı filtrenin üzerine geçirdiğinizde, ortamın filtre duvarı ile temas etmesini ve menisküs oluşturmasını önlemek için bunları minimum miktarda ortamla filtrenin merkezine aktarmak önemlidir. Son olarak, fazla ortamı çıkarın ve bunları ayırmak için bir tungsten iğnesi kullanın. Daha sonra, bunları laminer akış başlığının altında iki günde bir kültür ortamını değiştirerek yedi güne kadar doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Bir filtre üzerinde kültürde bir gün sonra, laa üzerindeki orta hat, üst uzunluğu kapsayan ve trakeanın her iki tarafında iki lob oluşturan uzun bir doku olarak görülebilir. Kültür ile loblar, epitel hücrelerinin morfogenez organizasyonuna maruz kalarak makroskopik olarak görülebilen foliküler yapılara genişler. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, e uyumlu, pozitif epitel hücrelerinin organizasyonu ve polarizasyonu ezrin immün etiketleme ile görselleştirilebilir.

Zamanla, ezrin pozitif hücre içi yapılar, apikal kutup haline gelecek olan hücrenin kutbu ile kaynaşır. Bu işlem sırasında, endotel hücreleri pozitif dört pcam çoğalır ve anjiyo foliküler üniteler oluşturmak için gelişmekte olan foliküllerin etrafında organize olur. Thro, sitler ve C hücrelerinin farklılaşmasını ölçmek için, gen ekspresyonu, kültürlenmiş tiroid loblarından izole edilen RNA'nın R-T-Q-P-C-R ile test edilebilir.

Tiroid transkripsiyon faktörünün ekspresyonu NK X 2.1 kültür sırasında değişmezken, thy spesifik tiroglobulin ve C hücresine spesifik kalsitoninin ekspresyonu fonksiyonel bir farklılaşmaya işaret ederek dramatik bir şekilde artar. Bu videoyu izledikten sonra, tiroid ekzyonunun nasıl diseksiyon ve kültür yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Yabani tip veya NOCO embriyoları kullanarak fonksiyon kazanımı ve kaybı deneyi yapmaya hazır değilsiniz.