Name: T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin, statik adezyon deneyi ile T lenfositlerindeki hücre adezyonunu kantitatif olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, immünoloji araştırmalarında ilaçların lenfosit adezyonuna etkisini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hirschil Güven, Michael Saperstein Tıbbi Alimler Araştırma Fonu ve NYU Whitehead dostluk bu çalışmaları destekledi.

1.. Mikroplate Wells Kaplama Not: Bu adımın amacı T-hücresi LFA-1 için ligandlar olarak hizmet etmek için ICAM-1 ile kat polistiren yüzeylere etmektir. <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ol><li> Resuspending kaplama solüsyonu hazırlayın rekombinant ICAM-1, kalsiyum (1 mM zenginleştirilmiş fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) ile CaCl2) ve magnezyum (2 nM MgCl2). ICAM-1&#39;in son konsantrasyonu 0.7 mg / ml stok çözeltisi yapılmış ve -80 ° C dondurucuda tutuldu 10 ug / ml, olduğundan emin olun. </li><li> % 0.5 insan (veya bovin) serum albümini (HSA / BSA), 2 mM MgCI2 ve 1 mM CaCI2 ile PBS zenginleştirerek yapışma çözelti hazırlayın. </li><li> PBS ile 2 mM MgCl2 ve 1 mM CaCl2 eklenerek yıkama çözeltisi hazırlayın. 37 tüm çözümler ısınmakKullanmadan önce C °. </li></ol></li><li> Yıkama çözeltisinin 50 ul ile 24 kuyu yıkayın. Bu yıkanmamış kuyu, pozitif (PMA tedavi hücreleri) ve negatif (kaplanmamış kuyuları) kontrolleri içerecektir. Her koşul en az üç kuyu (üçlü) set için. </li><li> Her bir oyuğa kaplama solüsyonu 50 ul ekle. Kaplanmamış kontrol kuyulara katmayın. 37 ° C inkübatör içinde bir saat boyunca inkübe edin. </li><li> Ucu kuyuların alt dokunmasına izin vermeden, nazikçe kaplama çözüm aspire. Yıkama çözeltisi, 50 ul bir kere yıkayın. </li><li> Yapışma çözeltisi 50 ul ilave edin ve 37 ° C inkübatör içinde bir saat için mikroplak inkübe edin. </li><li> Yavaşça aspire ve 50 ul yıkama çözeltisi ile yıkayın. Ancak bu gece boyunca 4 ° C&#39;de tutmak mümkündür, aynı gün plaka kullanarak, ve ertesi gün kullanın. </li></ol> Blood 2. T Hücre İzolasyonu <ol><li> 50 ul / ml o insan T hücresi zenginleştirme kokteyl eklemef tam kan (antikoagülan, 3 ml (heparin, EDTA veya sitrat) tam kan, örneğin kokteyl 150 ul ekle). İyice karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne 3 ml işlenmiş kan ve oda sıcaklığında% 1 D-glükoz ile zenginleştirilmiş bir (kalsiyum ve magnezyum olmadan) PBS eşit hacimde. Pasteur pipeti ile yavaşça karıştırın. </li><li> Santrifüj tüpüne 15 ml Ficoll-Paque PLUS ekleyin. </li><li> Dikkatle lenfosit izolasyon ortamında kan örneği seyreltilmiş 6 ml katman. </li><li> Ara kapalı olarak 20 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Arayüzde bozulmamış lenfosit tabakası bırakarak temiz bir Pasteur pipeti kullanarak üst katman kapalı çizin. Plazmanın üst tabakası daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Temiz bir Pasteur pipeti temiz bir santrifüj tüpüne lenfosit katman transferi kullanma. </li><li> Lenfositlere karşı PBS 3 hacim (9 mi) ilave edin. Hafifçe hücreleri tarafından askıya drakanat onları ve bir Pasteur pipeti dışarı. </li><li> 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje </li><li> Süpernatant kaldırmak. Lenfositler şimdi uygulama için uygun bir ortam içinde süspansiyon gerekir. 20 ml bir T-75 kültür şişesine transfer hücreleri,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı. </li></ol> Hücreler 3. Hazırlanması Not: hücreler, bir flüoresan tepkime maddesi ile etiketlenmiş edilmesi için bir ön şarttır. Bu protokolde ifade eden hücreler kabul edilebilir bir alternatiftir karboksi floresan süksinimidil ester (CFSE), bununla birlikte, yeşil flüoresan protein (GFP) kullanın. <ol><li> Hemasitometre kullanarak 2,4 x 10 6 T hücrelerini (her bir kuyu için 1 x 10 5) saymak. </li><li> Serumu (serum açlık) eksik kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. 37 ° C bir inkübatörde 2 saat boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 5 dakika (400 xg) için hücreler santrifüj. Medya ve aspire1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 1:1000 seyreltme (5 mM yapılan stok) CFSE ekleyin. Işıktan örtün ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 37 ° C PBS ile 10 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun ve 5 dakika boyunca 400 x g &#39;de dönerler. </li><li> Önceden ısıtılmış yapışma çözeltisi (50 ul başına 1 x 10 5 hücre) 1.2 ml hücre pelletini yeniden askıya. </li></ol> Hücreler 4. Uyarılması Not: yapışma başlatmak için, hücreler teşvik edilmelidir. Aşağıdaki deneyde hücreler, anti-CD3 antikorları ile çapraz bağlama, TCR ile uyarılır, ancak çözünebilir SDF-1, alternatif olarak hizmet verebilir. Deneylerin amacına bağlı olarak, çeşitli farmakolojik reaktifler hücre yapışması üzerindeki etkilerini incelemek için stimülasyon öncesi veya sırasında ilave edilebilir. Phorbol myristate asetat (PMA), ikinci haberci diasil gliserol (DAG) ile yapısal olarak benzer olan ve bu nedenle çok sayıda kinaz aktifleştiren bir forbol ester,alt TCR (özellikle protein kinaz C) s; burada bir pozitif kontrol olarak kullanılır. <ol><li> 37 ° C&#39;ye ısıtın mikroplak </li><li> 8 1.5 ml boş boruların (her bir tüpe 150 ul), her bir durum için, bir tüp içine hücreleri bölün. </li><li> Buna göre hücreleri tedavi: <ol><li> Pozitif kontrol olarak hizmet etmek için 10 ng / ml PMA ile bir tüp teşvik. Uyarılması için kontrolü (&quot;Hiçbir uyarım&quot;), yıkanmamış yükleme kontrol (&quot;hiçbir yıkama&quot;) ve ICAM-1 kaplama için kontrol (&quot;kaplanmamış&quot;) olarak hizmet etmek, işlenmemiş üç tüpleri tutun. </li><li> Anti-CD3 antikorlarının farklı konsantrasyonda (0.1, 1, 5, ve 10 ug / ml) ile dört tüp teşvik. Gecikme olmadan sonraki adıma devam edin. </li></ol></li><li> De her boş içine uyarılmış hücre karışımı aliquot 50 ul. Göz başına hücre nihai sayısı 1 x 10 5&#39;tir. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C inkübatör mikroplak yerleştirin. Not: Bazı T hücre hatları kısa uyarıdan gerektirir<html> tion zaman. Bu süre içinde, hücreler kuyu dibine yerleşmek ve hedef ligandlara bağlı. </li></ol> 5. Yıkama takım Yapışkan olmayan hücreler Not: Bu adımın amacı ligand kaplı yüzeyler ile sıkı bir temas oluşturmak için mümkün değildi hücreleri kaldırmaktır. Aynı fiziksel kuvvetler tüm oyuklara uygulanmasını sağlamak amacıyla, bu aşama için, çok kanallı bir pipet kullanın. Bu yapışık hücre yüzdesinin hesaplanmasında yardımcı olmak için yıkanmamış belirtilen kontrol kuyuları tutmak önemlidir. <ol><li> Her kuyu için, sıcak yapışma çözeltisi 150 ul ekle. Kuyulardan orta çıkarmadan önce birkaç saniye hafifçe plakayı sallayın. Ipuçları ile kuyuların dibine dokunmayın. </li><li> Bu adımı üç kez tekrarlayın. Tamponu ve dışarı pipetlerken pipet yönünü değiştirin. </li></ol> 6.. Yapışık hücrelerin yüzdesini belirlemek _content &quot;&gt; Not: Bu adımda, bir floresan plaka okuyucu içinde her bir floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan yoğunluk yapışık hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişki içindedir.. <ol><li> Plaka okuyucusu açın. Masaüstünde kısayol simgesini tıklatarak plaka okuyucu yazılımı açın. <ol><li> &quot;Görev&quot; menüsünden yeni bir protokol kurmak için &quot;Yeni&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> &quot;Eylemler&quot; menüsünden &quot;Oku&quot; seçeneğini seçin. &quot;Floresan yoğunluğu&quot; ı tıklayın ve &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> Menüsünden açılan &quot;Uyarma dalga boyu 485&quot; ve &quot;Emisyon dalga boyu 528&quot; seçeneğini seçin. &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Optik&quot; seçeneği menüsünde &quot;Bottom&quot; seçin ve &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. Geri &quot;Eylemler&quot; menüsüne gidin ve 37 ° C sıcaklığına ayarlamak ve &quot;Tamam&quot; a tıklayın. </li><li> Plaka okuyucu içine mikroplağı yerleştirin ve&quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Sonuç excel elektronik tablo halinde ihraç edilecek. </li></ol></li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak yapışkan hücrelerin yüzdesini hesaplayın: yapışık hücre yüzdesi = (yıkandı kuyularda oku ortalama floresan yoğunluğu) / (yıkanmamış hücre oku ortalama floresan yoğunluğu) x% 100. </li></ol>

<ol><li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+in+motion%3A+migrating+toward+improved+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li>
<li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li>
<li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

LFA-1 aktivasyonu ve T hücre yapışmasının 12 sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır. Akış sitometrisi bükülmüş ya da LFA-1 ya da genişletilmiş seçici olarak bağlanan monoklonal antikorlar kullanılarak canlı hücreler içinde LFA-1 afinite durumlarını ölçmek için kullanılır. Bu yöntemin sınırlamaları biri dikkate İntegrinler &#39;avidite almaz olmasıdır. Göç deneyleri yararlı araçlardır ama onlar belli bir zaman noktasında cimri yapışma değil göç ölçmek, ve. T lenfosit göçünü (örn. deri aşırı ...

T lenfosit yapışma bağışıklık tepkisi 1 temel bir süreçtir. Bu tarama antijen hedef hücreler 2 ile lenf düğümleri içinde hücreler (APC) ve immünolojik sinaps oluşumu için (IS) için, endotel hücreleri, kılcal duvarlar dekorasyon ile T hücre etkileşimi için gereklidir. Bu gereksinimler, işlevsel ve kinetik farklıdır. Lenfositler ekstravazasyonunun süreci chemoattraction, haddeleme, sağlam yapışma ve göçü oluşur. Yapışmasını pekiştirmek için yuvarlanmaya geçiş hızlı bir G protein bağlı reseptör sinyaline yanıt T hücreleri gerektirir. Bu yanıt, haddeleme hücre 3 yavaşlatır ve tutuklama bir integrin ligand etkileşimini verir. Integrin aviditede ani bir değişim bu süreci aracılık eder. Göç &#39;ön uç&#39; de adezyonların oluşumu ve &#39;arka ucunda&#39; de yapışıklıklar kırılma dinamik etkileşimler betweenTcells ve endotel hücreleri gerektirirbiçimlendirilmiş ve 4 kırma arasında yaklaşık bir dakika ara ile. IS inminutes oluşturur, ama saat 6 bozulmadan kalması gerekiyor. İlginç bir şekilde, tek bir yapışma molekülü, integrin ailesi elemanıdır limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) - 1, tüm bu işlemler 5 için gereklidir. LFA-1, immünoglobulin süper familyasının çeşitli üyeleri ile etkileşim yoluyla bir yapışmaya neden olur. LFA-1, en yüksek afiniteye sahip en yaygın olarak incelenmiştir ligand arası yapışma molekülü (ICAM) -1. Non-aktive dolaşımdaki lenfositler, bu nedenle, hücre yüzeyi üzerinde LFA-1 ve ICAM-1 kaplı yüzeylerin uygun durumda olan düşük afiniteye ifade eder. LFA-1, değişken afinite ve bu tür G-protein kenetli reseptör aktivasyonu, sitokin stimülasyonu ve T hücre reseptörlerinin (TCR) kaynaklı sinyaller gibi çeşitli sinyal olayları tarafından düzenlenir. LFA-1 hücre dışı alanı, hücre içi aktivasyonu taşır Sonuçta elde edilen yüksek afiniteli bir şekilde tICAM-1 ile hrough etkileşimleri. Bu yol 7 sinyalizasyon iç-out denir. Benzer şekilde, hücre dışı alan ikinci LFA-1 ile sinyal dış-in sinyal olarak adlandırılır. Iç-dış ve sinyalizasyon dışarıdan katılan sinyal basamaklarının içi mevcut araştırmaların önemli bir odak noktası vardır. Küçük GTPaz Rap1 son zamanlarda TCR ligasyonu ve 8 sitokin sinyal için ortak olan sinyalizasyon iç-out anahtar bileşeni olarak ortaya çıkmıştır. T hücre yapışma baskın negatif Rap1 9 ekspresyonu ile bloke edilir ise integrin aktivasyonu Rap1 kritik rolü, Rap1 aşırı ifadesi T hücreleri integrin bağımlı yapışmayı teşvik keşfi ile vurgulanır. Rap1 tarafından integrin düzenleme anlayışımızda bu gelişmeler vitro araçları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bunlar arasında Burada açıklanan yapışma deneyidir. Bu yöntemin genel amacı T incelemektirICAM-1 kaplı yüzeylere hücre yapışma. Daha özel olarak ise, bu ölçmenin ve farklı koşullar altında, gerçek zamanlı canlı hücrelerde, karşı ligandları doğru LFA-1 afinite ölçmek için kullanılır. Bu teknik, T hücreleri ile etkileşime hücre yüzeyleri taklit etmek için ICAM-1 ile kaplanmış polistiren kuyu kullanır. Pek çok daha önce tarif edildiği statik T hücre yapışma deneyleri, deneysel karmaşıktı. Genellikle T hücreleri için gerekli Bu deneyler, radyoaktif etiketli T hücre yapışması için alt-tabaka olarak hücre dışı bir matris oluşturmak için kültürlenmiş sığır kornea hücreleri kullanılmaktadır, ya da T hücre yapışmasını 10 desteklemek için uzun bir süre boyunca fizyolojik olmayan, T hücresi uyarımı için çağrılacak. Diğer birçok deney sistemlerinde 11 kullanılan gibi, akış sitometrisi ve mikroskopi ile karşılaştırıldığında yapışma, inkübasyonu takiben T hücresi sayısını bulmak için florometrik ölçüm kullanılması miktarının daha hassas ve kesin bir yöntemdir. Buna ek olarak, tek bir hücre mikroskopintegrin lokalizasyon ic analizi fluorometrik ölçümü ile aynı şekilde geniş, nüfus tabanlı analiz için izin vermez. Aktivasyon durumu spesifik LFA-1 antikorlar, ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bu antikorlar, burada tarif edilen yönteme göre düşük duyarlılık sunmaktadır. Alternatif teknikler üzerinde ana avantajı sadeliği ve aynı anda birden fazla deneysel koşulları incelemek için yeteneğidir. Belirli bir uygulama için bu yöntemi göz önüne alındığında, bir T hücreleri olumsuz, seçilmiş taze izole edilmiş ve bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş gerektiğini dikkate almalıdır.

<table><tbody><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Hibrit</td> Çok Kanallı <td></td></tr><tr><td>pipet</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>Optik tabanlı 96 oyuklu mikroplaka</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant ICAM-1</td><td>R& D Sistemleri</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 antikorları</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Moleküler Problar</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum</td><td>Gibco</td> <td>içeren DPBS</td><td></td>14190250</tr><tr><td>Periferik lenfositler</td><td>örneğin fare veya insan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 yazılımı</td><td>BioTek</td><td>Sürüm 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Sağlık</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>15 ve 50 ml santrifüj tüpleri</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık plastik Pasteur pipetleri</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75 kültür şişeleri</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RozetSep T hücre zenginleştirme kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

t lenfositlerindeki integrin aktivasyonunun Çalışması için statik adezyon deneyi

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lenfosit yapışması enflamasyon ve antijen sunan hücreler ile immünolojik sinaps oluşumu sitelerine göçü de dahil olmak üzere birden fazla T hücre fonksiyonları için gereklidir. T hücreleri, integrinler, ortak hücreler ya da hücre-dışı matrisi üzerinde hedef molekülü ile etkileşim transmembran proteinlerin çiftlerinden oluşan heterodimerik hücre yapışma moleküllerinin bir sınıf yapışkan özelliklerini kontrol ederek düzenlenmiş yapışmasını gerçekleştirmek. En belirgin T hücre integrin olan hedef hücre içi adezyon molekülü (ICAM) -1 alt birimi αL ve β2, oluşan, limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) -1. Yapışmayı kontrol etmek için bir T hücresinin yeteneği bireysel integrinlerin afinite durumlarını düzenleme yeteneğinden kaynaklanır. İç Çıkış sinyali, bir hücre içindeki sinyal integrinlerin dış etki aktive edilmiş bir durumunu almasına neden sayede işlemi tarif etmektedir. Bu karmaşık olayların bilgimizin çok mekanik dayanmaktadırçalışmalar, in vitro model sistemlerinde de basitleştirilmiş uygulandı. Burada anlatılan T lenfosit yapışma deneyi, T hücreleri, statik koşullar altında, molekülleri hedef alan uymak için sağlar ve daha sonra yapışkanlığını ölçmek için bir flüoresan plaka okuyucusu kullanır mükemmel bir araçtır. Bu deney, lenfositler üzerinde hareket yapışma uyarıcı ya da önleyici maddeler tanımlama, hem de söz konusu sinyal olayları için yararlı olmuştur. LFA-1, burada açıklanan halde - ICAM-1 aracılı yapışma; Bu deney hali hazırda başka bir yapışma etkileşimlerinde (- fibronektin örneğin VLA-4) çalışma sağlamak için adapte edilebilir.

Aşağıdaki, anti-CD3 antikorlarının çeşitli konsantrasyonları ile uyarılmış T-hücreleri, primer yapışma deneyinin bir örnektir. Bu yıkanmamış hücrelerin floresan (yani toplam yükleme) bilmek yararlıdır. Stimüle edilmemiş hücreler bir negatif kontrol olarak hizmet etmek ve PMA ile muamele edilmiş hücreler, anti-CD3 antikorları için pozitif kontrol edilir. Kaplanmamış kuyularda kaplı hücreler, ICAM-1 için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Uyarılmamış hücre yüzdesi% 10 ila% 5 arasında iken Tipik bir deneyde ya...

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Bu prosedürün genel amacı, hücresel adezyonu nicelikle belirlemektir. Bu işlem, ikinci adımda 96 kuyucuklu bir mikroplakanın adezyon molekülleri ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Primer insan T hücreleri kandan izole edilir ve CFSE ile işaretlenir.Ardından, T hücreleri yapışkanlıklarını etkileyecek tedavilerle stimüle edilir. Son adımda, işlem görmüş hücreler mikroplakaya eklenir ve yapışmaya izin verilir. Nihayetinde, tedavi koşumu başına yapışan hücrelerin yüzdesini belirlemek için kuyuk başına düşen floresans miktarı ölçülebilir.Bu tekniğin, T-hücrelerinin modele ve anteriuma eklenmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, T-hücresi ve erl hücresinin ko-kültürünün gerekmemesidir. Bu yöntem, belirli ilaçların lenfosit adezyonunu nasıl etkilediği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem lenfosit biyolojisine dair içgörüler sağlayabilmesinin yanı sıra, nötrofiller gibi diğer maya hücrelerine de uygulanabilir.Adımlar uzmanlaşması zor olduğundan, hassasiyet ve beceri gerektirdiğinden bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bir mikroplakayı adezyon molekülleri ile kaplamak için, öncelikle 96 kuyucuklu bir plakanın 24 ku

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

T lenfosit göç homing lenfoid organlar, damar çıkış sırasında oluşur ve periferik dokularda girmeden. Burada, T lenfosit göçü analiz etmek için kullanılan bir protokol...

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Burada, varsayılan hücre adezyon moleküllerinin içsel yapışkan özelliklerini karakterize etmek için basit, hızlı bir yöntem sunuyoruz.  Bir hücre adezyon molekülünün salgılanan, epitop etiketli ektodomaini, kültür ortamından küçük, düzgün işlevselleştirilmiş boncuklar üzerinde yakalanır.  Bu boncuklar daha sonra basit boncuk agregasyon testlerinde hemen kullanılabilir.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Integrin gerginlik çeşitli hücre işlevlerinde önemli rol oynar. Bir bütünleştirici gerilim sensör ile integrin gerginlik picoNewton (pN) hassasiyeti ile kalibre edilmiş ve Mikronaltı çözünürlükte görüntüsü.

Integrin gerginlik ve hücresel kuvvet bütünleştirici gerilim sensör ile Mikronaltı çözünürlükte görüntüleme

TGT yüzeyi, büyüme faktörü-integrin çapraz konuşmasını incelemek için yenilikçi bir platformdur. Esnek prob tasarımı, adezyon ligandının özgüllüğü ve stimülasyon koşullarının hassas modülasyonu, EGFR-integrin etkileşiminin sağlam nicel değerlendirmelerine izin verir. Sonuçlar, EGFR'yi fokal adezyon montajını ve hücre yayılımını etkileyen bir 'mekanik-düzenleyici' ayar integrin mekaniği olarak vurgulamaktadır.

Büyüme Faktörü Aracılı İntegrin Mekaniği ve Yapışmasını Ölçmek için Gerilim Ölçer Tether Probları

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Ayarlanabilir yoğunluğa sahip RGD ile işlevselleştirilmiş avidin-biyotin bağları kullanılarak tek göç eden trombositlerin görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır ve trombositlerin avidin-biyotin bağını koparmak için yeterli kuvvet ürettiğini ortaya çıkarır.

RGD İşlevselleştirilmiş Avidin-Biotin Bağları Kullanarak Trombosit Migrasyonunu İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Öğrenin, statik adezyon deneyi ile T lenfositlerindeki hücre adezyonunu kantitatif olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, immünoloji araştırmalarında ilaçların lenfosit adezyonuna etkisini değerlendirmek için kullanılır.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Daha fazla video keşfet