T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, hücresel yapışmayı ölçmektir. Bu, ilk olarak ikinci adımda 96 oyuklu bir mikroplakanın yapışma molekülleri ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Birincil insan T hücreleri kandan izole edilir ve CFSE ile etiketlenir.

Daha sonra, T hücreleri, yapışkanlıklarını etkilemek için tedavilerle uyarılır. Son adımda, tedavi edilen hücreler mikroplakaya eklenir ve yapışmanın oluşmasına izin verilir. Sonuç olarak, tedavi koşulu başına yapışan hücrelerin yüzdesini belirlemek için kuyu başına floresan miktarı ölçülebilir.

Bu tekniğin modele T hücresi eklenmesi ve anteryum gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, T hücresi ve erl hücresinin kokültür kültürüne ihtiyaç duyulmamasıdır. Bu yöntem, belirli ilaçların lenfosit yapışmasını nasıl etkilediği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem çizgi ayak biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de, nötrofiller gibi diğer maie hücrelerine de uygulanabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, adımların ustalaşması zor olduğundan ve hassasiyet ve beceri gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir: Yapışma molekülleri ile bir mikroplakayı kodlamak için, 96 oyuklu bir plakanın 24 kuyusunu 50 mikrolitre yıkama solüsyonu ile yıkayarak başlayın, daha sonra kaplanmamış kontrol kuyuları hariç her bir kuyucuğu 50 mikrolitre kaplama solüsyonu ile 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, pipet ucunun kuyucukların dibine temas etmesine izin vermeden kaplama solüsyonunu nazikçe aspire edin. Daha sonra kuyucukları 50 mikrolitre daha yıkama solüsyonu ile yıkadıktan sonra, mikroplakayı kuyucuk başına 50 mikrolitre yapışma solüsyonu ile inkübe edin.

Yine 37 santigrat derecede. Bir saat sonra, yapışma solüsyonunu nazikçe aspire edin ve kuyucukları bir kez daha 50 mikrolitre yıkama solüsyonu ile yıkayın T hücrelerini izole etmek için önce her mililitre tam kan başına 50 mikrolitre insan T hücresi zenginleştirme kokteylini iyice karıştırın ve ardından tedavi edilen kanı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında 50 mililitrelik konik bir tüpe altı mililitre tedavi edilen kan ve% 1 D glikoz ile zenginleştirilmiş eşit hacimde kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ekleyin ve çözeltiyi hafifçe karıştırın.

Daha sonra 50 mililitrelik taze bir konik tüpe 15 mililitre lenfo preparat ekleyin ve seyreltilmiş kan örneklerini dikkatlice lenfosit izolasyon ortamına yerleştirin. Hücre katmanlarını kopma ile 400 kez G ve 20 santigrat derecede 20 dakika boyunca ayırın. Ardından, üst tabakayı çıkarmak için taze bir macun pipeti kullanın ve lenfosit tabakasını arayüzde bozulmadan bırakın.

Lenfosit tabakasını yeni bir pester pipeti ile taze bir konik tüpe aktarın. Lenfositlere dokuz mililitre PBS ekleyin ve ardından hücreleri nazikçe içeri ve dışarı çekerek süspansiyon boyunca eşit olarak dağıtın. Hücreleri döndürün ve ardından peleti ortamda yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri bir T 75 kültür şişesine dağıtın. Uygun kültür periyodundan sonra hücreleri uyarmak için 20 mililitre kültür ortamı. İlk olarak, altı T hücresine 2.4 çarpı 10'a serum serbest ortam ekleyin ve ardından hücreleri 37 santigrat derece inkübatörde serum aç bırakın.

İki saat sonra, hücreleri aşağı doğru döndürün ve peleti yeniden süspanse edin. Bir mililitre PBS'de, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca bir floresan işaretleyici ile etiketleyin ve ardından 10 mililitre 37 santigrat derece PBS ekleyerek reaksiyonu durdurun. Daha sonra hücreleri döndürdükten sonra, peleti 1.2 mililitre ön ısıtma yapışma çözeltisinde yeniden süspanse edin.

Kaplanmış mikroplakayı 37 santigrat dereceye ısıtın, ardından hücreleri 1.5'te sekiz adet 150 mikrolitrelik alikotlara bölün. Mililitrelik tüpler, pozitif kontrol görevi görmek için mililitre başına 10 nanogramda PMA ile bir tüpü uyarır. Stimülasyon kontrolüne, yıkanmamış yükleme kontrolüne ve ICAM bir kaplama kontrolüne hizmet etmek için üç tüpü tedavi edilmeden bırakın ve farklı konsantrasyonlarda anti CD üç antikor ile dört tüpü uyarın.

Daha sonra, uyarılmış hücre karışımlarının oyukları başına 50 mikrolitre 10 ila beşinci hücreleri hemen mikroplakadaki uygun kuyucuklara ayırın ve plakayı 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Önce yapışan hücrelerin yüzdesini belirlemek için, her bir kuyuyu 150 mikrolitre ılık yapışma solüsyonu ile yıkayın. Plakayı birkaç saniye hafifçe çalkalayın ve ardından pipet uçlarıyla kuyucukların dibine dokunmadan ortamı her bir kuyucuktan dikkatlice aspire edin.

Her aspirasyonda pipetin açısını değiştirerek yıkamayı üç kez tekrarlayın. Ardından plaka okuyucuyu açın ve görev menüsü altındaki plaka okuma yazılımını açın. Yeni bir protokol ayarlamak için yeni'ye tıklayın.

Ardından eylemler menüsü altında okuma seçeneğini seçin. Floresan yoğunluğuna tıklayın ve Tamam'a tıklayın. Uyarma dalga boyunu 485 ve emisyon dalga boyunu 528 olarak girin.

Ardından optik seçenek menüsü altında, alttan seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından eylemler menüsüne geri dönün ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın ve Tamam'ı tıklayın. Son olarak mikroplakayı yükleyin ve çalıştır'a tıklayın.

Sonuçları bir elektronik tabloya aktardıktan sonra, bu görüntülerdeki yapışma hücrelerinin yüzdesini hesaplamak için formülü kullanın. Çeşitli konsantrasyonlarda anti CD üç antikorları ile uyarılan birincil T hücreleri kullanılarak yapılan bir yapışma testinin bir örneği gösterilmiştir. Uyarılmamış hücreler negatif kontrol görevi görür.

PMA ile muamele edilen hücreler, anti CD üç antikorları için pozitif kontrol görevi görür, tablo CFSE'nin nispi floresan yoğunluklarını gösterir. Etiketli primer T hücreleri, farklı dozlarda çözünür anti CD üç antikorları ile uyarılır ve IAM bir kaplanmış kuyucuklar üzerine kaplanır. Her koşul için, üçlü kuyuların ortalama yoğunluğu hesaplanabilir ve yüklenen toplam hücrelerin nispi yüzdesine dönüştürülebilir.

Tipik bir deneyde, yapışan PMA ile tedavi edilen hücrelerin yüzdesi %40 ila %50 arasındayken, uyarılmamış hücrelerin yüzdesi %5 ila %10 arasındadır.Stimülasyon için kullanılan anti CD üç antikorunun konsantrasyonu arttıkça yapışma hücrelerinin yüzdesinin arttığını unutmayın. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç saatten daha kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, floresan girişini belirlemek için yıkanmamış bir kuyunun floresansını ölçmeyi unutmamak önemlidir.

Veri analizinde kritik bir değer. Bu videoyu izledikten sonra, statik hücresel yapışmanın nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan kan örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.