Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı hücrelerde gliko bileşimindeki gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemektir. Bu, bir Pero Somal hedefleme dizisi PTs ikisine kaynaşmış bir floresan proteinin eksprese edilmesiyle elde edilir. Füzyon proteini, floresan organel haline gelen olgun gliko bölgelerine aktarılır.

Bozunma ve geri dönüşüm, akış yoluyla izlenebilen bir floresan kaybına yol açar Sitometri hücreleri, glikoların yeniden şekillenmesini tetikleyen faktörleri belirlemek için farklı çevresel koşullara maruz kalır. Sonuçlar, gliko bileşiminin, hücrelerin besin açısından fakir ortamdan besin açısından zengin ortama geçişi üzerine hücresel floresanstaki değişikliklere bağlı olarak çevresel değişikliklere yanıt olarak değiştiğini göstermektedir. Dolayısıyla bu tekniğin elektron ve floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, binlerce hücrenin gerçek zamanlı analizine izin vermesidir.

Prosedürü gösterenler, yüksek lisans öğrencisi Sarah Bauer ve laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi olan Megan Conlan olacak. Bu prosedür için böcek prosiklik formu veya PCF parazitleri, 27 santigrat derece ve% 5 CO2'de 10 mililitre uygun ortam ile 25 santimetre karelik bir hücre kültürü şişesinde kültürlenir. Plazma DNA'sının hazırlanması bu videoda gösterilmeyecektir, ancak protokol ekteki el yazmasında mevcuttur.

Bu işleme başlamak için, bir akış sitometresi kullanarak 400 mikrolitre filtre sterilize edilmiş cyto karışım sayım hücrelerine 10 mikrolitre steril saflaştırılmış doğrusallaştırılmış DNA ekleyin ve 15 dakika boyunca 800 Gs'de santrifüjleme ile 50 ila yüz milyon hücre hasat edin. Oda sıcaklığında, bir mililitrelik serolojik pipet kullanarak süpernatanı dökün, hücre peletini 450 mikrolitre DNA ve Cyt karışımında yeniden süspanse edin. Hücreler, DNA ve sito karışımı içeren çözeltiyi steril dört mililitrelik bir boşluğa aktarın.

Qve ve qve'yi elektroporasyon odasına yerleştirin. Üstel azalmayı seçin ve aşağıdaki ayarları manuel olarak girin. Voltaj 1.5 kilovolt kapasitans, 25 mili direnç, sonsuz omega ve vet dört milimetre.

Nabız tamamlandığında nabız tuşuna basın. Veterineri elektroporasyon odasından çıkarın ve biyogüvenlik kabinine geri dönün. 10 mililitre SDM 79 ortamını yeni bir steril şişeye pipetleyin.

Dönüştürülen hücreleri SDM 79 ile şişeye aktarın. Hücreleri 24 saat boyunca ilaç seçimi yapmadan inkübe edin. 27 santigrat derecede,% 5 CO2.

24 saat sonra bir G 4 1 8 higromisin ve blastin geçer. İlaçla birlikte bir mililitre dönüştürülmüş hücre, ilaçla birlikte dokuz mililitre SDM 79'a dönüştürülür ve hücreler inkübatöre geri gönderilir. Daha sonra, hücreler günlük olarak bu videoda daha sonra gösterilecek olan akış sitometrisi ile analiz edilir.

Uzun süreli depolama için S, hücreler floresan olduğunda ve mililitrede 10 milyon hücre hücre yoğunluğuna ulaştığında yapılır. İlk olarak, cyto karışımına eşit hacimde% 100 gliserol ekleyerek dondurma ortamı yapın ve çözeltiyi sterilize ederek filtre yapın. Daha sonra, bir kriyo şişesindeki 800 mikrolitre hücreye 200 mikrolitre dondurma ortamı ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın.

Kriyo şişesini iki strafor raf arasına yerleştirin ve eksi 80 santigrat derecede yaklaşık 24 saat dondurun. Dondurulduktan sonra, hücreleri sıvı nitrojene aktarın, hücreleri sıvı nitrojene taşımak önemlidir 24 saat sonra eksi 80 santigrat derecede daha uzun süre depolama, hücre canlılığında bir azalmaya yol açar Donmuş stoğu çözmek için. Dondurulmuş şişeyi eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika çözdürün.

Dokuz mililitre SDM 79 ortamını ilaçla birlikte yeni bir steril şişeye pipetleyin. Çözülmüş hücreleri bu şişeye ekleyin, bu kültürün bir mililitresini yeni bir şişede dokuz mililitre SDM 79'a ekleyerek bir ila 10 arasındaki hücrelere geçiş yapın ve kültürü hücrelere üç mililitre SDM 79'da mililitre başına 100.000 hücre yoğunluğuna kadar bir seyreltme testi geçişi için hazırlayın. 25 mililitrelik bir kültür şişesinde floresan, geçişten hemen sonra ve daha sonra üç saatte ve 24 saatte ölçülür Seyreltme testine başlamadan önce hücrelerin sadece bir kez geri geçirilmesi, glikozomal yeniden şekillenmeyi gözlemlemek için gereklidir.

Hücreler iki geçişin ötesinde kültürlendiğinde, lizozomal yeniden şekillenme tahmin edilemez hale gelir. Herhangi bir numuneyi çalıştırmadan önce, akışkanlar gösterildiği gibi tekrar yıkanmalı ve durulanmalıdır. Burada akış sitometresini açın ve C Flow plus programını açın.

SIP'nin saklandığı nano saf su tüpünü boş bir tüple değiştirin. Ters yıkama düğmesini seçin. Geri yıkama tamamlandıktan sonra.

Mikro santrifüj tüpünü yudumdan çıkarın ve atın. Yudumun üzerine bir mililitre yeni nano saf su içeren yeni bir mikro santrifüj tüpü yerleştirin. C Flow programında çalışma limitleri altında yeni kuyuyu seçin.

Süreyi iki dakika olarak ayarlayın. Fluidics altında, hızlı ve çalıştır'ı seçin. İki dakikalık bir süre sınırı tamamlandığında, örnek verileri sil düğmesine tıklayın.

Akış sitometresi kurulduktan sonra hücreler sayılabilir. SIP üzerindeki suyu sayılacak numune ile değiştirin. Çalışma sınırlarını 30 saniyeye, fluidcs'i hızlı olarak ayarlayın ve ardından 32. süre sınırı tamamlandıktan sonra çalıştır'ı seçin.

C Flow plus, son çalıştırmada mikrolitre başına olayları sağlayacaktır. Floresanı ölçmek için, çalışma sınırlarını 10.000 olay ve akışkan olarak ayarlayın. Yavaşlatmak için eşiği ayarla'yı seçin.

Birincil eşik altında, FSCH'deki olayları kalıcı olarak ortadan kaldır'ı seçin ve 30.000'den az girin. Uygula'ya ve ardından kapat'a tıklayın, yeni çizim pencerelerinden birinde histogram düğmesini seçin ve FSCA'yı seçin Açılır listeden, floresanı ölçen FL one A'yı seçin. 530 nanometre dalga boyunda seçin.

Tüm kültürler floresan açısından değerlendirildikten sonra, temizleme solüsyonunu akışkan hattından iki dakika ve iki dakika su boyunca çalıştırın. Veri analizine başlamak için C Flow plus'ta analiz sekmesini seçin. Aşağıdaki histogram düğmesine tıklayın, yeni bir çizim yapın.

FSEA'yı seçin. Bir açılır liste görünecektir. FFL bir a kanalını seçin.

Analiz etmek için bir kuyuyu vurgulayın, kapı düğmesini seçin ve ilgilenilen nüfus için manuel olarak bir kapı çizin. C Flow plus, bu geçit içinde bir hücre sayımı ve glikoz içeren ortamda büyütülen PCF hücrelerinin bu arsa akış sitometrisi analizinin yüzdesini sağlayacaktır. SDM 79, biri parlak diğeri sönük olmak üzere iki popülasyon ortaya çıkardı.

Dim hücreler, floresan raportörü içe aktarmayan olgunlaşmamış gliko bölgelerini barındırır. Parlak hücreler daha olgun gliko bölgeleri barındırırken, ortamda glikoz bulunduğunda, gliko proteinlerinin yanlış lokalizasyonu öldürücüdür ve gli protein ekspresyonu ve ithalatı sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Bu, orta floresan yoğunluklarına sahip hücrelerin yokluğunda yansıtılır.

SDM 80 ortamında Glikoz olmadan, glik proteinlerinin yanlış lokalizasyonu tolere edilir. Bimodal popülasyon dağılımı kaybolur ve ara floresan hücreleri gözlenir. Bu sistem, gliko yeniden şekillenmesini tetikleyen koşulları belirlemek için kullanılabilir.

Yaklaşık% 10 sönük hücre içeren yüksek yoğunluklu kültürler veya taze ortama geçtiğinde, sol kapıya giren olgunlaşmamış gliko bölgelerine sahip dim hücrelerin yüzdesinde bir artış olur. 24 saat içinde, orijinal nüfus dağılımı yeniden kurulur. Olgunlaşmamış gliko köpükler artık floresan proteini ithal etmek için gerekli peroksizom proteinlerini içerdiğinden.

Bu prosedürü denerken, kapsamlı kültürlemeden kaçınmayı unutmamak önemlidir. İki geçişten sonra, kültürler atılmalı ve yeni kararlı sekizler kullanılmalıdır. Bu protokol, gliko modellemeyi tetikleyen reaktiflerin ve koşulların tanımlanmasına izin verir.

Bu işlemi takiben, Western analizi ve floresan ve elektron mikroskobu gibi diğer ilaçlar yapılabilir. Glikoprotein ekspresyonu, lokalizasyonu ve morfolojisindeki değişiklikleri daha kesin bir şekilde cevaplamak için.