Deniz taşemen Karaciğer Metamorfoz sırasında Safra Hastalığı gözünüzde Yeni Bir Açıklama Yöntemi ( Petromyzon marinus)

Bu prosedürün genel amacı, biliyer dejenerasyonun küresel, yapısal ve hücresel analizleri için metamorfik C lampreyinde tüm karaciğeri ve bağırsakla birleşme noktasını berraklaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle dokuların hidrojel monomer çözeltisinde fikse edilmesiyle gerçekleştirilir.

Ardından, hidrojel sabitlenmiş dokularla birlikte polimerize edilir. Daha sonra sabitlenmiş dokunun plazma membranı uzaklaştırılır ve doku şeffaf hale gelir. Son olarak, immunofloresan boyama gerçekleştirilir ve metamorfik c Lampry'deki biliyer dejenerasyon sırasındaki genel yapısal ve hücresel değişiklikleri göstermek için nihai olarak lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem; merkezi sinir sistemindeki konnektomlar ve bizim durumumuzda, serum noktası metamorfozu sırasındaki safra yolu dejenerasyonu gibi biyomedikal alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, insan safra yolu veya atrezisinin tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır; çünkü bu nadir konjenital bebek hastalığı, serum noktası metamorfozu sırasındaki safra yolu dejenerasyonu ile benzer özellikler paylaşmaktadır. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez Nature'da bir haber makalesi bulduğumuzda ve laboratuvar toplantımız sırasında prosedürü gösteren çevrim içi videoyu sunduğumuzda edindik; prosedür laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Ann Scott tarafından gerçekleştirilecektir. İlk olarak, metin protokolüne uygun olarak fosfat tamponlu salin ve fosfat tamponu veya pb hazırlandı.

Çeker ocak içerisinde; distile su, %40 akrilamid %2 bis akrilamid 10X PBS, %16 paraformaldehit, saponin ve amonyum persülfatı birleştirerek 400 mililitre hidrojel hazırlayın. %4 SDS ve 0,2 molar borik asit içeren bir litre berraklaştırma solüsyonu hazırlayın ve dokuyu çeker ocakta hazırlamak için 500 mililitre %80 gliserol hazırlayın. 15 mililitrelik santrifüj tüplerine 10 mililitre hidrojel monomer solüsyonu ekleyin.

Doku örneğini diseke edin ve dokuyu, dört °C'de iki gün boyunca her bir hidrojel sabitleme tüpüne yerleştirin. Çeker ocak altında inkübasyonun ardından, beş µL temid ekleyerek sabitlenmiş dokuyu polimerize edin. Ardından iyice karıştırın ve örneklerin oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe olmasını sağlayın.

İnkübasyonun ardından, doku örneklerini berraklaştırmak için fazla jeli tamamen temizleyin. Her bir örneği 15 milliliters berraklaştırma çözeltisine yerleştirin ve şeffaflaşana kadar birkaç gün boyunca 50 degrees Celsius ve 70 RPMs'de inkübe edin. Berraklaştırma çözeltisini günde en az bir kez değiştirin ve varsa fazla jeli uzaklaştırın.

Numuneleri, 37 °C'de ve 70 RPM'de gece boyunca 15 mL 0.1 M, %0.1 Triton X 100 içeren PB içine aktarın. İnkübasyonu taze tampon ile iki kez daha tekrarlayın. Doku şeffaflaştığında ve fazla jelden arındığında, numuneleri PB Triton X 100 içindeki primer antikora daldırın ve 37 °C'de, 70 RPM'de iki gün boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından, doku numunelerini 37 °C'de ve 70 RPM'de gece boyunca yıkamak için 15 mL %0.1 Triton X 100 içeren PB kullanın.

Son yıkama tamponunu çıkardıktan sonra yıkama işlemini üç kez tekrarlayın, %0,1 Trix 100 ve bloklama serumu içeren PB içindeki floresan ikincil antikor çözeltisini ekleyin ve 37 °C'de, 70 RPM'de bir gün boyunca karanlıkta inkübe edin. Numuneleri 37 °C'de ve 70 RPM'de 10 mL PB tritton X 100 ile gece boyunca üç kez yıkadıktan sonra, PBS ile üç kez gece boyunca yıkama işlemi gerçekleştirin. Son olarak, berraklaştırılmış dokuyu folyo ile kapatarak %80 gliserol içinde gece boyunca inkübe edin.

Konfokal mikroskopi görüntüleme, karanlık veya loş ışıkta gerçekleştirilir; ancak bu videoda görselleştirme amacıyla ışıklar açıktır. Lamprey metamorfozu sırasında HEPA safra sisteminde birçok önemli gelişimsel olay meydana gelir; örneğin burada gösterildiği gibi, safra kanalı ve safra kesesi apoptoza uğrar ve dejenere olur. Modifiye edilmiş berraklaştırma yöntemi kullanıldıktan ve karaciğer hücresi belirteci cytokeratin 19 ile anti-apoptotik belirteç BCL two ile boyama yapıldıktan sonra, sağlam karaciğer boyunca optik kesit alma işlemi için lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanılmıştır.

Boyama işlemi, dejeneratif sürecin iki ile dört arasındaki metamorfoz evrelerinde gerçekleştiğini ortaya koymuştur. Üst paneller ön uçtan, alt paneller ise arka uçtan alınmıştır. Burada safra ağacı ve burada karaciğerdeki koyu renkli, dendritik görünümlü apoptotik hücreler ile çevreleyen kanaliküller ve kanal araçları gösterilmektedir.

Bu şekil, sitokeratin 19 ve BCL two antikorları ile işaretlenmiş, iki ve üç arasındaki metamorfoz evrelarında bulunan üç karaciğerin konfokal Z serisinden yeniden oluşturulmuş üç boyutlu görüntülerini temsil etmektedir; safra ağacı ile dendritik görünümlü koyu apoptotik hücreler ve çevreleyen kanaliküller ile kanal araçları sırasıyla beyaz ve siyah oklarla işaretlenmiştir. Burada, lümeninde safra damlacıkları bulunan, iki ve üç arasındaki metamorfoz evrelarındaki bir örneğin safra kanallarının konfokal optik kesiti gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, daha ileri görüntüleme analizleri için tüm dokunun nasıl berraklaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Paraformaldehit ve poliakrilamid çözeltileriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven takmak ve çeker ocak kullanmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.