Deniz taşemen Karaciğer Metamorfoz sırasında Safra Hastalığı gözünüzde Yeni Bir Açıklama Yöntemi ( Petromyzon marinus)

Bu prosedürün genel amacı, biliyer dejenerasyonun küresel, yapısal ve hücresel analizleri için tüm karaciğeri ve bağırsakla olan bağlantıyı netleştirmektir. Metamorfik C lamprey'de. Bu, önce dokuların hidrojel monomer çözeltisine sabitlenmesiyle gerçekleştirilir.

Daha sonra, hidrojel sabit dokularla polimerize edilir. Daha sonra sabitlenen dokunun plazma zarı çıkarılır ve doku saydam hale gelir. Son olarak, metamorfik c Lampry'de biliyer dejenerasyon sırasında global yapısal ve hücresel değişiklikleri göstermek için immünofloresan boyama ve sonuçta lazer cilt ve konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, merkezi sinir sistemindeki konektomlar ve bizim durumumuzda serum nokta metamorfozu sırasında biliyer dejenerasyon gibi biyomedikal alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, insan biliyer veya atrezisinin tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü bu nadir konjenital bebek hastalığı, serum nokta metamorfozu sırasında ary dejenerasyonu ile benzer özellikleri paylaşır. Bu yöntem için fikir ilk olarak nature'da bir haber makalesi bulduğumuzda ve laboratuvar toplantımız sırasında prosedürü gösteren çevrimiçi videoyu sunduğumuzda vardı. Fosfat tamponlu salin ve fosfat tamponu veya pb yaptıktan sonra laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Ann Scott, metin protokolüne göre.

Çeker ocakta, sülfat başına damıtılmış su, %40 akrilamid, %2 bis akrilamid 10 XPBS, %16 paraform, aldehit, saponin ve amonyumu birleştirerek 400 mililitre hidrojel hazırlayın. % 4 SDS ve 0.2 molar borik asitten oluşan bir litre temizleme çözeltisi hazırlayın ve çeker ocakta doku hazırlamak için 500 mililitre% 80 gliserol yapın. Eloqua 10 mililitre hidrojel monomer çözeltisini 15 mililitrelik santrifüj tüplerine yerleştirin.

Doku örneğini inceleyin ve dokuyu iki gün boyunca dört santigrat derecede her bir hidrojel tüpüne yerleştirin. Çeker ocak altında inkübasyonun ardından, beş mikrolitre temid ekleyerek sabit dokuyu polimerize edin. Daha sonra iyice karıştırın ve numunelerin oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe etmesine izin verin.

İnkübasyondan sonra, doku örneklerini temizlemek için fazla jeli iyice çıkarın. Her birini 15 mililitre temizleme solüsyonuna yerleştirin ve şeffaf hale gelene kadar birkaç gün boyunca 50 santigrat derece ve 70 RPM'de inkübe edin. Temizleme solüsyonunu günde en az bir kez değiştirin ve fazla jeli çıkarın.

Numuneleri gece boyunca 37 santigrat derece ve 70 RPM'de% 0.1 Triton X 100 ile 15 mililitre 0.1 molar PB'ye aktarın. Kuluçka işlemini taze tampon ile iki kez daha tekrarlayın. Artık doku temizlendiğine ve fazla jelden arındırıldığına göre, numuneleri PB tritton X 100'de birincil antikora batırın ve inkübasyondan sonra iki gün boyunca 37 santigrat derece ve 70 RPM'de inkübe edin, doku örneklerini gece boyunca 37 santigrat derece ve 70 RPM'de yıkamak için% 0.1 tritton X 100 ile 15 mililitre PB kullanın.

Son yıkama tamponunu çıkardıktan sonra yıkamayı üç kez tekrarlayın, PB'de% 0.1 Trix 100 ve bloke edici serum ile floresan ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve karanlıkta 37 santigrat derece ve 70 RPM'de bir gün inkübe edin. Numuneleri 10 mililitre PB tritton X 100'de 37 santigrat derecede ve gece boyunca 70 RPM'de üç kez yıkadıktan sonra, PBS'de gece boyunca üç yıkama gerçekleştirin. Son olarak, arıtılmış dokuyu gece boyunca folyo ile kaplı% 80 gliserol içinde inkübe edin.

Konfokal mikroskopi görüntüleme daha sonra karanlık veya loş ışıkta gerçekleştirilir, ancak bu videoda görselleştirme amacıyla ışıklar açıktır. C lampre metamorfozu sırasında HEPA safra sisteminde birkaç önemli gelişimsel olay meydana gelir, örneğin, burada gösterildiği gibi, safra kanalı ve safra kesesi apoptoz geçirir ve dejenere olur. Modifiye durultma yöntemi kullanıldıktan ve karaciğer hücre markörü sitokeratin 19 anti anti apoptotik belirteç ile boyandıktan sonra, sağlam karaciğerden optik kesit yapmak için BCL iki lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanıldı.

Boyama, dejeneratif sürecin iki ila dört metamorfik aşamada meydana geldiğini ortaya koydu. Üst paneller önden, alt paneller ise arka uçtandır. Burada safra ağacı ve burada koyu dendritik görünümlü apoptotik hücreler ve karaciğerdeki çevresindeki kanal ve kanal aletleri gösterilmektedir.

Bu şekil, sitokeratin 19 ve BCL iki'ye karşı antikorlarla işaretlenmiş metamorfik evreler iki ve üç arasındaki üç karaciğerden oluşan konfokal Z serisini, safra ağacını ve koyu dendritik görünümlü apoptotik hücreleri ve çevreleyen kanalikülleri ve kanal araçlarını yeniden yapılandıran üç boyutlu görüntüleri temsil etmektedir. Burada gösterilen, lümende safra damlacıkları bulunan metamorfik aşamalar iki ve üç arasındaki bir numunenin safra kanallarının konfokal optik bir bölümüdür. Bu videoyu izledikten sonra, daha ileri görüntüleme analizleri için tüm dokuyu nasıl netleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Paraform, aldehit ve poli akrilamid çözeltileri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven giymek ve çeker ocak kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.