Name: Deniz taşemen Karaciğer Metamorfoz sırasında Safra Hastalığı gözünüzde Yeni Bir Açıklama Yöntemi ( Petromyzon marinus) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Keşfedin, deniz taşemen Petromyzon marinus metamorfozu sırasında safra dejenerasyonunu görselleştirmek için modifiye edilmiş CLARITY yöntemini. Bu teknik, lazer tarama konfokal mikroskobu ile biliyer ağacın tamamını incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Hammond Bay Biyolojik İstasyonu, Great Lakes Science Center, US Geological Survey katkısını kabul. Biz de lazer tarama konfokal mikroskopi onun teknik destek için Michigan State Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi&#39;nde Dr Melinda Frame teşekkür ederim. Bu çalışma YWCD ve WML Büyük Göller Balıkçılık Komisyonu hibe tarafından desteklenmektedir.

1.. Çözüm Hazırlığı <ol><li> 1 L sağlayın 10x 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (PBS, pH 7.4): 26.2 gr sodyum fosfat (monobazik), 115 g sodyum fosfat (dibazik), 87.66 g NaCI ve tartılır. Yaklaşık 800 ml distile H 2 O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H 2 O. ile 1 L&#39;ye hacmi getirmek <ol><li> 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PBS alın ve 900 ml damıtık H2O eklemek </li><li> 100 ml 10x PBS al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık H2O ile 1 L&#39;ye getir hacim: 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4),% 0.1 Triton X-100 ile yapın </li></ol></li><li> 26.2 g sodyum fosfat (monobazik) ve 115 g sodyum fosfat (dibazik) tartılır: 1 L 10x 0.1 M fosfat tamponu (PB, pH 7.4) olun. Yaklaşık 800 ml distile H 2 O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H 2 O. ile 1 L&#39;ye hacmi getirmek <ol><li> 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: Al 100 ml 10x PB,ve H 2 O. damıtılmış 900 ml ekle </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PB al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık H2O ile 1 L&#39;ye kadar ses getirmek </li></ol></li><li> 400 ml hidrojel monomer çözeltisi (% 4 akrilamit,% 0.25 bis-akrilamid,% 4 paraformaldehit,% 0.0075 amonyum persülfat, 0.1 M PBS içinde% 0.0005 saponin) Marka: 0.3 g amonyum persülfat ve 0.2 g saponin tartılır. 210 ml damıtılmış 2 H ekleme O, 40 ml% 40 akrilamit,% 2 10 mi bis-akrilamid, 40 ml 10x PBS (pH 7.4), 100 ml% 16 paraformaldehit ve iyice karıştırın. </li><li> (0.2 M borik asit,% 4 SDS) 4 L temizleme çözeltisi oluşturunuz: SDS g 49,464 g borik asit ve 160 tartılır. , Yaklaşık 3,5 L distile H 2 O eritin NaOH ile 8.5 pH ayarlamak ve 4 L. hacmi getirmek </li><li> 1 L% 80 gliserol çözeltisi Marka:, 800 ml gliserol ölçmek 200 ml damıtık H2O ekleyin ve iyice karıştırın. </li></ol> 2.. Doku Hazırlanması <ol><li> Her bir 15 ml santrifüj tüpüne hidrojel monomer çözeltisi ve kısım 10 mi hazırlayın. </li><li> Bütün doku inceleyin ve 4 ° C&#39;de 2 gün için hidrojel saptamak Hidrojel çözelti en az 10x doku hacmi olduğundan emin olun. </li><li> Bir çeker ocak için (15 ml santrifüj tüpüne) hidrojel sabit doku getirin. </li><li> , TEMED 5 ul ekleyerek hidrojel sabit doku polimerize iyice karıştırın ve 2-3 saat boyunca oda sıcaklığında, çeker ocak içinde bekletin. </li><li> İyice fazla jelin çıkarılması. Not: Ekstra jel boyama esnasında temizleme sürecini ve antikor sokulmasına engel olacaktır. </li><li> Doku saydam hale gelinceye kadar, birkaç gün boyunca 70 rpm&#39;de ve 50 ° C&#39;de ayarlanmış bir kuluçka çalkalayıcı içinde çözelti temizleme 10 ml sabit doku inkübe edin. , En az günde bir kez temizleme çözeltisi değiştirmek ve temizleme solüsyonu değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> 70 r% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml 0.1 M PB içerisinde dokuyu durulayınpm ve 37 ° C gecede. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> 2 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C &#39;de% 0.1 Triton X-100 ile PB primer antikor çözeltisi içindeki açıklık dokuyu inkübe edin. Not: Bütün daldırın doku için yeterli birincil antikor çözüm olun. </li><li> Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C &#39;de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> Karanlık bir odada ya da loş ışık altında, aşağıdaki adımları uygulayın. Fotoğraf beyazlatma önlemek için folyo ile örtün örnekleri. </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile PB floresan ikincil antikor çözeltisi ve 1 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C de bloke serumu ile berraklaştırılmış dokuyu inkübe edin. </li><li> Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C &#39;de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın ve aşırı jel f kaldırmakTampon çözeltisi değiştirirken doku rom. </li><li> Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C de 10 ml PBS içinde doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> 70 rpm ve 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca% 80 gliserol içinde berraklaştırılmış doku inkübe edin. </li><li> Önce konfokal mikroskopi için 4 ° C&#39;de floresan lekeli doku saklayın. </li></ol>

<ol><li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+in+Michigan%5BTitle%5D)+AND+%22US+Fish+and+Wildlife+Service+Special+Science+Report+on+Fishery+Service%22%5BJournal%5D)">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li>
<li>Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardisty%2C+MW+%22The+biology+of+lampreys%22">The biology of lampreys</a>. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).</li>
<li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li>
<li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li>
<li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li>
<li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+patients%E2%80%99+outcome+post-Kasai+operation%3A+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li>
<li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li>
<li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li>
<li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li>
<li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L.%2C+during+metamorphosis%3A+I.+Atresia+of+the+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li>
<li>Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+before+and+after+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li>
<li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li>
<li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey%2C+Lethenteron+reissneri%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, nano gözenekli bir hidrojel oluşturmak üzere, poliakrilamid ile bozulmamış doku çapraz bağlar ve daha sonra optik saydamlık ve makromoleküler geçirgenliği elde etmek için doku plazma zarı uzak şeritler &quot;açıklık&quot; 12 olarak adlandırılan yeni bir yöntem, modifiye edilir. &quot;BERRAKLIK&quot; uzun menzilli projeksiyon ve sinir sisteminde yerel devre kablolama sağlam doku görüntüleme sağlar. Bu yeni yöntem, başkalaşım sırasında deniz lamprey karaciğerde tüm safra kanallarının görselleştirme...

Deniz taşemen üç ayrı yaşam boyunca gelişir 1,2 aşamaları. Larva deniz taşemen (L) bentik filtre besleyiciler olarak yuvalarda çoğu zaman harcamak. Dış morfoloji ve iç organlarda 3 yeniden dramatik değişiklikler yedi metamorfik aşamaları geçtikten sonra, elde edilen yavrular (JV) kütle 100 defadan fazla vücut artırarak, konak balık kan ve doku sıvıları ile beslenirler sırasında bir parazit sahne girin . Okyanus veya büyük göllerde konak balık besleme, 1.0 ila 1.5 yıl sonra, yetişkin erken bahar aylarında beslenme durdurma ve yumurtlamak için akarsulara göç ve ardından 1,2 ölür. Metamorfoz sırasında, deniz taşemen karaciğer safra kesesi ve safra yolları, tüm, insan bebekte hastalık safra yolları atrezisi taklit eden evrimsel bir mutant fenotip kaybeder. Bebek biliyer atrezi 4,5,6,7 ciddi tıbbi komplikasyonlar nadir bir pediatrik karaciğer hastalığıdır, 8,9,10, ancak safra atrezi patogenezi ve etyolojisi 4 büyük ölçüde bilinmemektedir. Cerrahi müdahale (Kasai prosedürü) 5 gerçekleştirilir sürece biliyer atrezi ile hastalar doğumdan sonra iki yıl içinde ölmektedir. Daha sonra, bu hastalar geniş klinik yönetimi ve genellikle karaciğer nakli 6. gerektirir. Biliyer atrezi etiyopatogenezinin Birçok teori gibi viral enfeksiyon, konjenital malformasyon, otoimmün hastalık, toksik ve hakaret olarak önerilmiştir. Ancak, safra atrezi gelişimine her katkısı 7,8,9,10 sonuçsuz kalır. Patolojik safra yolları atrezisi acı bebeklerin aksine, deniz taşemen gelişimsel kapsamlı stres nekroinflamasyon, fibrozis veya siroz 10 olmadan safra yolları atrezisi programlanmış geçireceği. Hayvanlar, bu süreçte 10 sırasında geçici kolestazınız acı, ama bu gelişimsel duruma adapte olabilirile de novo sentezi ve bu 11 karaciğer safra tuzunun sentezi azaltma olarak bilinen mekanizmaları ek olarak gelişim safra atrezi, sonra bağırsak safra tuzlarının salgılanması. Deniz lamprey Bu gelişim süreci biliyer atrezi ilerlemesini incelemek için bilinen tek fırsat sağlar. &quot;AÇIKLIK&quot; adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem, bir optik şeffaf Nanogeçirgen hidrojel 12 içine bozulmamış dokusu dönüştürerek karmaşık memeli sinir sistemlerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Deniz taşemen karaciğer ve modifiye BERRAKLIK protokolünü kullanarak, safra dejenerasyon sağlam doku görüntüleme karaciğer metamorfoz boyunca belgelenmiştir olabilir.

<table><tbody><tr><td>% 40 akrilamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>%2 bis-akrilamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>amonyum persülfat;</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>borik asit</td><td>Sigma</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>saponin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>sodyum dodesil sülfat ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>sodyum fosfat (monobazik)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>sodyum fosfat (dibazik)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>gliserol ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>%16 paraformaldehit&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>NaOH peletleri&nbsp;</td><td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpleri</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>diseksiyon aletleri&nbsp;</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

deniz taşemen karaciğer metamorfoz sırasında safra hastalığı gözünüzde yeni bir açıklama yöntemi ( petromyzon marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

Biliyer atrezi Tayvan 5,000 içinde 1 bildirilen frekans ile tahmini 1 15,000 güneydoğu ABD&#39;de frekans, ancak Doğu Asya ülkelerinde daha yaygın olan, bebeklik nadir bir hastalıktır. Çok biliyer atrezi yönetimi hakkında bilinmesine rağmen, patogenezi hala zor olduğunu. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) safra dejenerasyonun mekanizması ve ilerlemesini incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Larva, parazit ve yetişkin: Deniz taşemen üç farklı yaşam evrelerinde yoluyla gelişir. Larva parazitik koleje geçiş sırasında, deniz taşemen dış morfolojisi ve iç organlarda dramatik yeniden yapılanma ve yeniden birlikte metamorfoz tabi. Karaciğerde, tüm bilier sistem safra kesesi ve safra dahil, kaybolur. &quot;AÇIKLIK&quot; adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem metamorfik deniz lamprey de bağırsak ile tüm karaciğer ve kavşak netleştirmek için güncellenmiştir.safra dejenerasyon süreci lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi ve deniz taşemen metamorfoz sırasında ayırt edildi. Bu yöntem, eşsiz bir hayvan modelinde safra yolları atrezisi incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Birçok önemli gelişme olayları deniz taşemen Başkalaşım sırasında Hepatobilier sistemde meydana. Safra kanalı ve safra kesesi apoptozu ve dejenere (Şekil 1) tabi. Ve konfokal mikroskopi kullanılarak anti-apoptotik işaretleyici BCL2 (cholangiocytes ve hepatositler önce ve başkalaşım 13 sonrasında mevcut CK19) karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19, modifiye arıtma yöntemi ve boyama birleştiren, tüm safra sistemi Z-ekseni (boyunca yakalandı Şekil 2) ve 3-boyutlu yapısı <st...

Deniz taşemen Başkalaşım sırasında safra kesesi ve safra yolları, insan safra atrezi ile benzer bir süreç kaybedersiniz. Yeni bir tespit ve açıklama yöntemi (AÇIKLIK) lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak tüm safra yolları görselleştirmek için güncellenmiştir. Bu yöntem safra dejenerasyonu incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Deniz taşemen Karaciğer Metamorfoz sırasında Safra Hastalığı gözünüzde Yeni Bir Açıklama Yöntemi ( Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

Bu prosedürün genel amacı, biliyer dejenerasyonun küresel, yapısal ve hücresel analizleri için metamorfik C lampreyinde tüm karaciğeri ve bağırsakla birleşme noktasını berraklaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle dokuların hidrojel monomer çözeltisinde fikse edilmesiyle gerçekleştirilir.Ardından, hidrojel sabitlenmiş dokularla birlikte polimerize edilir. Daha sonra sabitlenmiş dokunun plazma membranı uzaklaştırılır ve doku şeffaf hale gelir. Son olarak, immunofloresan boyama gerçekleştirilir ve metamorfik c Lampry'deki biliyer dejenerasyon sırasındaki genel yapısal ve hücresel değişiklikleri göstermek için nihai olarak lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılır.Bu yöntem; merkezi sinir sistemindeki konnektomlar ve bizim durumumuzda, serum noktası metamorfozu sırasındaki safra yolu dejenerasyonu gibi biyomedikal alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, insan safra yolu veya atrezisinin tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır; çünkü bu nadir konjenital bebek hastalığı, serum noktası metamorfozu sırasındaki safra yolu dejenerasyonu ile benzer özellikler paylaşmaktadır. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez Nature'da bir haber makalesi bulduğumuzda ve laboratuvar toplantımız sırasında prosedürü gösteren çevrim içi videoyu sunduğumuzda edindik; prosedür laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Ann Scott tarafından gerçekleştirilecektir. İlk olarak, metin protokolüne uygun olarak fosfat tamponlu salin ve fosfat tamponu veya pb hazırlandı.Çeker ocak içerisinde; distile su, %40 akrilamid %2 bis akrilamid 10X PBS, %16 paraformaldehit, saponin ve amonyum persülfatı birleştirerek 400 mililitre hidrojel hazırlayın. %4 SDS ve 0,2 molar borik asit içeren bir litre berraklaştırma solüsyonu hazırlayın ve dokuyu çeker ocakta hazırlamak için 500 mililitre %80 gliserol hazırlayın. 15 mililitrelik santrifüj tüplerine 10 mililitre hidrojel monomer solüsyonu ekleyin.Doku örneğini diseke edin ve dokuyu, dört °C'de iki gün boyunca her bir hidrojel sabitleme tüpüne yerleştirin. Çeker ocak altında inkübasyonun ardından, beş µL temid ekleyerek sabitlenmiş dokuyu polimerize edin. Ardından iyice karıştırın ve örneklerin oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe olmasını sağlayın.İnkübasyonun ardından, doku örneklerini berraklaştırmak için fazla jeli tamamen temizleyin. Her bir örneği 15 milliliters berraklaştırma çözeltisine yerleştirin ve şeffaflaşana kadar birkaç gün boyunca 50 degrees Celsius ve 70 RPMs'de inkübe edin. Berraklaştırma çözeltisini günde en az bir kez değiştirin ve varsa fazla jeli uzaklaştırın.Numuneleri, 37 °C'de ve 70 RPM'de gece boyunca 15 mL 0.1 M, %0.1 Triton X 100 içeren PB içine aktarın. İnkübasyonu taze tampon ile iki kez daha tekrarlayın. Doku şeffaflaştığında ve fazla jelden arındığında, numuneleri PB Triton X 100 içindeki primer antikora daldırın ve 37 °C'de, 70 RPM'de iki gün boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından, doku numunelerini 37 °C'de ve 70 RPM'de gece boyunca yıkamak için 15 mL %0.1 Triton X 100 içeren PB kullanın.Son yıkama tamponunu çıkardıktan sonra yıkama işlemini üç kez tekrarlayın, %0,1 Trix 100 ve bloklama serumu içeren PB içindeki floresan ikincil antikor çözeltisini ekleyin ve 37 °C'de, 70 RPM'de bir gün boyunca karanlıkta inkübe edin. Numuneleri 37 °C'de ve 70 RPM'de 10 mL PB tritton X 100 ile gece boyunca üç kez yıkadıktan sonra, PBS ile üç kez gece boyunca yıkama işlemi gerçekleştirin. Son olarak, berraklaştırılmış dokuyu folyo ile kapatarak %80 gliserol içinde gece boyunca inkübe edin.Konfokal mikroskopi görüntüleme, karanlık veya loş ışıkta gerçekleştirilir; ancak bu videoda görselleştirme amacıyla ışıklar açıktır. Lamprey metamorfozu sırasında HEPA safra sisteminde birçok önemli gelişimsel olay meydana gelir; örneğin burada gösterildiği gibi, safra kanalı ve safra kesesi apoptoza uğrar ve dejenere olur. Modifiye edilmiş berraklaştırma yöntemi kullanıldıktan ve karaciğer hücresi belirteci cytokeratin 19 ile anti-apoptotik belirteç BCL two ile boyama yapıldıktan sonra, sağlam karaciğer boyunca optik kesit alma işlemi için lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanılmıştır.Boyama işlemi, dejeneratif sürecin iki ile dört arasındaki metamorfoz evrelerinde gerçekleştiğini ortaya koymuştur. Üst paneller ön uçtan, alt paneller ise arka uçtan alınmıştır. Burada safra ağacı ve burada karaciğerdeki koyu renkli, dendritik görünümlü apoptotik hücreler ile çevreleyen kanaliküller ve kanal araçları gösterilmektedir.Bu şekil, sitokeratin 19 ve BCL two antikorları ile işaretlenmiş, iki ve üç arasındaki metamorfoz evrelarında bulunan üç karaciğerin konfokal Z serisinden yeniden oluşturulmuş üç boyutlu görüntülerini temsil etmektedir; safra ağacı ile dendritik görünümlü koyu apoptotik hücreler ve çevreleyen kanaliküller ile kanal araçları sırasıyla beyaz ve siyah oklarla işaretlenmiştir. Burada, lümeninde safra damlacıkları bulunan, iki ve üç arasındaki metamorfoz evrelarındaki bir örneğin safra kanallarının konfokal optik kesiti gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, daha ileri görüntüleme analizleri için tüm dokunun nasıl berraklaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Paraformaldehit ve poliakrilamid çözeltileriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven takmak ve çeker ocak kullanmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

a-new-clarification-method-to-visualize-biliary-degeneration-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Zebra balığı safra güdümlü karaciğer rejenerasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları değerlendirmeye yardımcı olmak için, nitroredüktaz eksprese eden hepatositlerin metronidazol tedavisi üzerine genetik olarak ablasyon edildiği bir karaciğer hasarı modeli oluşturduk.  Bu protokolde, hepatosit ablasyonunun ve biliyer güdümlü karaciğer rejenerasyonunun nasıl ustaca manipüle edileceğini, izleneceğini ve analiz edileceğini açıklıyoruz.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

Solungaç tırmıkları, faringeal dişler ve branş kemikleri dahil olmak üzere branş iskeleti, çoğu balıkta birincil gıda işleme bölgesi olarak hizmet eder. Burada, bu iç iskeleti üç omurgalı dikme sırtlarında incelemek ve düz bir şekilde monte etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda çeşitli diğer balık türleri için de geçerlidir.

Diseksiyon ve Threespine Stickleback Brankial İskelet Düz montaj

Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların değerli bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Lipid açısından zengin larva yemlerinin protokolleri, diyet floresan lipid analoglarının canlı görüntülenmesi ve gıda alımının miktarının belirlenmesi açıklanmıştır. Bu teknikler çeşitli tarama, görüntüleme ve hipoteze dayalı sorgulama tekniklerine uygulanabilir.

Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

Burada, ayırmak ve yapısını, koku kudret ve deniz lampreys, sözde feromon bileşiklerin davranışsal yanıt karakterize bir iletişim kuralı mevcut.

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Burada, standart bir dizi protokol üstün oküler sulkus gözlemlemek için mevcut bir son zamanlarda tespit, evrimsel korunmuş yapısı omurgalı gözü önünde. Zebra balığı larva kullanarak, oluşumu ve üstün oküler sulkus kapatılması için katkıda faktörleri belirlemek için gerekli teknikleri göstermektedir.

Çift oküler sulkus görselleştirme Danio rerio embriyogenez sırasında

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğunun doğru ölçülmesini yapmak için oldukça basit ve hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genetik ve çevresel değiştiricilerin etkilerini ve biliyer hastalıklarının fare modellerinde potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemede yardımcı olabilir.

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi

Burada larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yöntem göstermek, karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonetkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.

Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi

Bu protokol, in vivo rejenerasyon sırasında zebra balığının elasmoid pullarının toplanmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Ayrıca hasattan sonra 7 güne kadar bu ölçeklerin ex vivo kültürü sunulmaktadır.

Zebra Balığı Pul Rejenerasyonu Toto ve Ex Vivo Pul Kültürü

Keşfedin, deniz taşemen Petromyzon marinus metamorfozu sırasında safra dejenerasyonunu görselleştirmek için modifiye edilmiş CLARITY yöntemini. Bu teknik, lazer tarama konfokal mikroskobu ile biliyer ağacın tamamını incelemeye olanak tanır.

Deniz taşemen Karaciğer Metamorfoz sırasında Safra Hastalığı gözünüzde Yeni Bir Açıklama Yöntemi ( Petromyzon marinus)

Daha fazla video keşfet