Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme _F) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ozmotik su geçirgenlik katsayısını veya bitki protoplastlarının PF'sini belirleyerek aquaporinlerin işlevi hakkında bilgi edinmektir. Eksenel epidermisi olmayan bir yapraktan bir parça kesin ve izotonik bir çözelti üzerine koyun. Parçaları enzimatik bir çözeltiye aktarın ve 28 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin, ardından taze bir izotonik çözeltiye inkübe edin.

Daha sonra, kırpılmış bir ucu olan çözelti içeren protoplastları toplayın. İkinci adım olarak, bir deney odası hazırlayın. Silikon gres kullanarak sürgünün altına bir kapak fişi takın.

Daha sonra hazne tabanını pozitif yüklü bir yapıştırıcı ile kaplayın ve hazneyi izotonik bir çözelti ile doldurun. İzole edilmiş protoplastlar daha sonra odaya eklenir ve oda mikroskop tablasına hassas bir şekilde yerleştirilir. Daha sonra, protoplastlar hipotonik bir çözeltiye maruz bırakılırken, şişme sürelerini yakalamak için videolar kaydedilir.

Daha sonra, şişme zaman seyri, örneğin farklı aquaporin genlerinin ekspresyonu ile indüklenen PF'deki farklılıkları gösteren sayısal analiz sonuçlarına dayalı olarak her bir protoplastın PF'sini belirlemek için cur fitting prosedürleri de dahil olmak üzere yazılım tarafından sayısal olarak analiz edilir. Bu yöntem, aquaporin fonksiyonunun düzenlenmesi gibi hücresel zar fizyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem matik su hakkında bilgi sağlayabilse de, doğal veya genetiği değiştirilmiş bitki su bitkilerinin geçirgenliği.

Ayrıca, ide'ye maruz kalan ilgi kaynağı gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamadan önce, gerekli izotonik ve hipertonik çözeltileri hazırlayın ve ozmolaritelerini doğrulayın. Bir OSM çekirdeği kullanarak, her bir çözümün ozmolaritesi hedef değerin %3'ü içinde olmalıdır.

10 santimetrelik bir Petri kabını yaklaşık altı damla izotonik çözelti ile doldurun. ABBA contasını soyun veya bir tavşan opsys yaprağı epidermisini indirin ve soyulmuş yaprağı yaklaşık dört x dört milimetrelik kareler halinde kesin. Küçük parçaları, açıkta kalan eksenel bir tarafı aşağı bakacak ve çözeltiye dokunacak şekilde izotonik çözelti damlalarının üzerine yerleştirin.

Daha sonra, 5.7 miligram enzim karışımını 1.5 mililitrelik bir tüpte 165 mikrolitre izotonik çözelti içinde çözün ve çözünene kadar bir dakika kadar pipetleyerek hafifçe karıştırın. Aynı Petri kabına enzimatik çözeltinin birkaç benzer damlasını yerleştirin. Yaprak parçalarını enzimatik çözelti üzerine aktarın. Damla.

Çanağı kapatın ve kapağı bir tur perfil ile kapatın. Çanağı 20 dakika boyunca 28 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda yüzdürün. 20 dakika sonra, forseps kullanarak tabağa birkaç damla daha izotonik çözelti ekleyin.

Her bir yaprak parçasını yeni bir izotonik çözelti Damlasına aktarmak için kenarından kaldırın ve ardından sırayla ikinci bir damlaya aktarın. Kırpılmış 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak protoplastları serbest bırakmak için yaprak parçasını ikinci damlada sallayın. Protoplastlı damlaları 1.5 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Bir sütunu izotonik çözelti ve diğer sütunu hipotonik çözelti ile doldurarak füzyon sistemini hazırlayın. Boruyu giriş manifolduna kadar doldurmak için bir miktar hipotonik çözeltinin akmasına izin vermek için valfi açın. Sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olduktan sonra vanayı kapatın.

İzotonik çözelti için tekrarlayın. Hazne tabanını protoplastlar için yapışkan hale getirmek için pleksiglas slayt içindeki hazne için bir taban yapmak için silikon gres kullanarak bir kapak fişini kapatın, pozitif yük taşıyan protamin sülfat veya poli L lizin ile kaplayın. Bu yapıştırıcıyı kapak fişinin üzerine yaymak için bir pipet ucu kullanın.

Bir ila iki dakika bekleyin. İzotonik solüsyonla üç ila dört kez durulayın ve kalan solüsyonu çalkalayın. Odayı izotonik çözelti ile doldurun.

Ardından, hazneye çözelti içeren bir damla protoplast eklemek için kırpılmış bir pipet ucu kullanın. Ve protoplastların çökmesi için üç ila dört dakika bekleyin. Hazneyi, çözelti yüzeyine temas eden şeffaf bir kapakla örtün.

Altında hava kabarcıkları tutmaktan kaçının. Ters çevrilmiş bir mikroskop masasına nazikçe bir slayt yerleştirin ve perfüzyon sistemine ve tüpteki hava kabarcıklarına karşı koruma sağlayan pompaya bağlı olarak bağlayın. Dakikada bir mililitrede sabit perfüzyon için izotonik çözelti akışını açın.

Hacim değişikliklerini kaydetmek için, mümkün olduğunca çok sayıda hücrenin küresel olduğu ve en geniş çevresinde iyi odaklanmış bir hücre konturu bulunan bir görünüm alanı seçin. Seçilen hareketsiz protoplastların saniyede bir görüntü veya bir hertz hızında 62. videosunu kaydedin. İzotonik solüsyonun 15 saniyelik bir yıkaması ile kaydı başlatın ve 45 saniye boyunca hipertonik solüsyona geçin.

Filmi Tiff formatında şurada kaydedin: Şişen bir hücrenin bir dizi görüntüsünü analiz etmek için, görüntü J yazılımındaki Görüntü Gezgini ve protoplast analizörü eklentilerini kullanın. Görüntüyü başlatın J.To filmi açın, Görüntü J panelinde dosya'ya tıklayın, ardından içe aktarmayı açtıkça açılır menülerde art arda tıklayın. Sonra görüntü gezgini.

Seçilen filmi vurgulayın. Üzerine sağ tıklayın ve sonra sola tıklayın. Protoplast analizörüne tıklayın.

İlk görüntüde, seçilen protoplastların etrafına daireler çizmek için fareyi kullanın. Ardından Tamam'ı tıklayın. Protoplast algılama algoritmasını başlatmak için görünen algılama parametreleri tablosunda, protoplast görüntüsünün üst panelindeki yerel'e tıklayın.

Sonra işlem. Açılır menüde, film boyunca seçilen protoplastların etrafındaki yeşil daireleri inceleyin. Alt kaydırıcıyı kullanarak sonuçları bir Excel dosyasına kaydedin.

Analiz kare kare yapılır. Bu nedenle, birden fazla hücre olması durumunda, burada her hücreye ait satırları ayırmak için sıralama yapılması gerekir. Üç zaman kursu, piksellerden kare mikrometreye dönüştürülen alan değerleriyle sıralamadan önce ve sonra bir Excel sayfasında gösterilir.

Her seferinde kurs daha sonra ayrı bir metin dosyasına aktarılır. Bu prosedüre başlamak için, odayı perfüzyon sistemine ve pompaya bağlayın ve dakikada bir mililitrelik sabit bir perfüzyon hızı için gösterge kalıp akışını açın, bir hertz hızında 62. bir video kaydedin. Kaydı 15 saniyelik gösterge kalıbı ile başlatın ve ardından hipertonik çözeltiye geçin 45 saniye boyunca kaydı durdurun.

Gösterge ile yıkayın. En az 30 saniye boyunca tekrar ölün. Yeni bir film kaydetmeye başlamadan önce, filmleri analiz etmek için beş ila altı film kaydedin ve kaydedin.

Değişen gösterge kalıbı geçirgenliğinin ortalama bir zaman seyrini elde etmek için, görüntüyü başlatın J tıklama dosyası. Ardından filmi açın ve filme göz atın. Her film için, filmin ilk görüntüsünün herhangi bir yerine 10 piksel genişliğinde dikey bir dikdörtgen çizin, Görüntü J ana panelindeki görüntüyü tıklatın.

Ardından açılır menüden kırp'ı tıklayın. 60 kareyi tek bir satırda hizalamak için görüntüye tıklayın ve ardından yığınları açarken ve montaj yaparken açılır menülerde art arda tıklayın. Tüm görüntü satırı boyunca herhangi bir yere bir piksel yüksekliğinde yatay bir dikdörtgen çizin ve Image J ana panelinde analiz et'e tıklayın.

Ardından, profili çiz'i tıklayın. Açılır menüde, geçirgenlik verilerinin listelerini bir Excel dosyasına kopyalayın. İndikatör kalıp yıkamalarının Sero filmlerinden elde edilen ortalama geçirgenlik süresi kursları.

Görüntü sıralı numarasını 0.1 ile çarparak gerçek zamanlı bir temel oluşturun. Ozmolarite zaman seyrinin çeşitli parametrelerini hesaplamak için ortalama zaman seyrini bir metin dosyasına kaydedin. Kullanım için mevcut olan MATLAB uygulama programı PF fit'i kullanın.

Ücretsiz. Bu programın indirilmesi ve kullanılması ile ilgili detaylar protokol metninde mevcuttur. Gösterge uyum panelinde.

Gösterge boya geçirgenliğinin ortalama zaman seyrinin verilerini içe aktarın. Mevcut deney parametrelerini manuel olarak girin, karınca H ile parametrelerin ilk tahminleri de indikatör boya konsantrasyonunun zaman seyrini tanımlayan değiştirilebilir. Göstergenin, DAI konsantrasyonunun ve modellenen banyo ozmolaritesinin zaman kurslarının grafiğini görüntülemek için çalıştır'a tıklayın.

Su geçirgenlik katsayısını belirlemek için verilere iyi bir uyum şarttır. Ses sığdırma paneline geçin. Alanın veri dosyasını içe aktarmak için seçin.

Parametre kaynağı olarak son gösterge uydurmasını seçin. Model sınıfını seçin. İki ile başlayın.

Yavaş PF ve gecikme PF parametrelerinin, örneğin gösterildiği gibi başlatılması gerekir, ancak başka değerler de mümkündür. İşaret, takılacak üç parametrenin de olup olmadığını kontrol eder. Çalıştır'a tıklayın.

Ardından ara şekle göz atın ve gerekirse gecikme parametresini ve kaydın uzunluğunu ayarlayın. Uyumu, kaliteyi değerlendirmek ve uyum hatasını kaydetmek için sonuç grafiğini inceleyin. Başlatma parametrelerini değiştirin, her birini birkaç katına çıkarın ve yeniden çalıştırın.

Su geçirgenlik katsayısını veya pf'yi belirlemek için uyum hatasının en düşük değerini hedefleyen, farklı başlatma parametreleri kombinasyonlarından başlayarak bu prosedürü birkaç kez tekrarlayın ve farklı aquaporinlerin aktivitesini karşılaştırın Bir tavşan opsys yaprağından elde edilen Mesil Protoplastları izole edildi ve bir tavşandan alınan aquaporin genleri ile üç gen yapısı ile ayrı ayrı dönüştürüldü, Opsys ve Labirent. Protoplastlar, gelişmiş yeşil floresan proteini kodlayan bir vektör ile birlikte çalıştırılarak etiketlendi. Her hücre için hipotonik zorluğa maruz kaldığında hücre hacmi değişikliklerinin zaman seyri ve hipotonik meydan okuma sırasında banyo ozmolarite değişiminin zaman seyri elde edildi, PF değerleri her hücre için türetildi.

PF FIT programı kullanılarak, üç aquaporinin her biri ile dönüştürülen PROTOPLASTLARIN PF değerlerinin, tek başına GFP ile dönüştürülen kontrol hücresinin PF'sinden önemli ölçüde daha yüksek olduğu gözlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, birkaç deneysel gün içinde birkaç on hücrenin analizini sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, izole edilmiş protoplastlarda veya hipotonik bir teste tabi tutulan diğer odak hücrelerinde SMO su geçirgenliğinin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Kalan sorularınız için lütfen bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin.