Fare Manyetik Rezonans Görüntüleme Mikroskopi tarafından Deneysel Otoimmün Miyokardit Kardiyak anormallikler noninvaziv değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, inflamatuar kalp hastalığından etkilenen canlı hayvanların kalplerini görüntüleyerek kardiyak fonksiyonel anomalileri belirlemektir. Bu işlem, öncelikle örneğin miyokardit gibi bir hastalığın indüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hayvanın manyetik rezonans mikroskopi görüntülemesine hazırlanması ve hayvan tutucuya yerleştirilmesidir.

Ardından, kardiyak görüntüleri elde etmek için fare mıknatısın içine yerleştirilir. Son adım, segment yazılımını kullanarak kardiyak fonksiyonel parametrelerin analiz edilmesidir. Nihayetinde bu teknik, otoimmün miyokardit etkilenmiş farelerde son diyastolik hacmin ve ejeksiyon fraksiyonunun hesaplanması için kullanılır.

Bu tekniğin histopatoloji gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, non-invaziv olması ve kalbin üç boyutlu, yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü sağlamasıdır. Bu yöntem, kardiyoloji alanında inflamatuar kalp hastalıklarının teşhisini içeren temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, manyetik rezonans mikro görüntüleme alımı için hayvanların hazırlanması konusundaki deneyim eksikliği nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Bu nedenle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu protokole, önce otoimmün miyokardit indüklemek için bir peptit çözeltisi hazırlayarak başlayın; kardiyak miyozin ağır zincir alfa peptit 3 34'ten 3 52'ye kadar olan kısmı, son konsantrasyonu 1,5 ml'de 2 mg olacak şekilde fosfat tamponlu salin içerisinde çözün. Ardından, 50 µg liyofilize boğmaca toksini içeren bir flakona 1 ml steril 1x fosfat tamponlu salin ekleyerek boğmaca toksinini hazırlayın.

50 ng/µL stok konsantrasyonu elde edin. Ardından, stoktan 20 µL alarak steril bir 1,5 mL tüpe aktarın ve 1 ng/µL çalışma konsantrasyonu elde etmek için üzerine 980 µL steril 1x fosfat tamponlu salin ekleyin. Ayrıca, 5 mg/mL nihai konsantrasyon elde etmek için 10 mL CFA'ya 40 mg mycobacterium tuberculosis H37Rv veya MTB ekstraktı ekleyerek komple Freund adjuvanı veya CFA hazırlayın.

Şimdi peptid CFA emülsiyonunu hazırlayın; 1,5 mililitre emülsiyon alikotu hazırlamak için, bir adet 1,5 mililitrelik tüpe 750 mikrolitre kardiyak miyozin ağır zincir alfa peptid 3 34 ila 3 52 peptid çözeltisi ve başka bir 1,5 mililitrelik tüpe MTB ekstraktı ile takviye edilmiş eşit hacimde CFA ekleyin. Ardından, üç mililitrelik bir luer lock şırınga kullanarak önce peptid çözeltisini, ardından CFA-MTB ekstraktını çekin. Şırıngayı üç yollu bir stopcock'a takın ve stopcock'un diğer çıkışını boş bir üç mililitrelik şırıngaya bağlayın.

Musluğun açıklığını ayarlayın. Böylece peptit CFA karışımı, makul bir dirençle bir şırıngadan diğerine akacaktır. İçeriği yaklaşık bir dakika boyunca tekrar tekrar bir şırıngadan diğerine iterek karıştırın ve ardından tüm düzeneği yaklaşık üç dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Bu prosedürü en az 10 kez tekrarlayın. 100 mililitrelik cam bir beherdeki durgun suya küçük bir damlacık dikkatlice yerleştirerek emülsiyonun kıvamını belirleyin. Damlacık su içinde dağılmamalıdır; eğer dağılıyorsa, istenen kıvam elde edilene kadar karıştırmaya devam edin.

Emülsiyon içeriğini üç mililitrelik şırıngalardan bir mililitrelik Luer lock şırıngaya aktarın; bunun için stop kokuna bağlı iki üç mililitrelik şırıngadan birini bir mililitrelik şırınga ile değiştirin. Ardından 27,5 gauge bir iğne takın.

Altı ila sekiz haftalık dişi aj. farelerin her iki kasık bölgesine, peptid CFA emülsiyonunun 150 microliters'ını bölünmüş dozlar halinde deri altına enjekte edin. Ardından, immünizasyonu takip eden sıfırıncı ve ikinci günlerde her hayvana intraperitonal olarak 100 microliters pertussis toksin süspansiyonu uygulayın. Yedinci günde, sternumun her iki yanına deri altına bölünmüş dozlar halinde 150 microliters peptid CFA emülsiyonu uygulayarak immünizasyon prosedürünü tekrarlayın.

Bu emülsiyonu tarif edildiği şekilde taze olarak hazırlayın. Ardından 21. günde, hayvanları MRM görüntülemesine tabi tutun. Görüntüleme hazırlığı için öncelikle her fareyi, sıcaklığı korumak amacıyla bir ısıtma pedi bulunan ve %2 izofluran hava karışımı içeren bir anestezi indüksiyon kamarasına yerleştirin.

Ardından hayvanı özel tasarlanmış bir hayvan tutucuya aktarın. Hayvanı yüzüstü pozisyonda sabitlemek için başı bir ısırma çubuğu ile sabitleyin. Anesteziyi sürdürmek için burun, burun konisine yerleştirilmelidir.

Deney sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için, çıkış hortumu tarayıcının dikey yuvasına yerleştirilmiş olan hava üflemeli ısıtıcıyı açın. Tüm görüntüleme oturumu boyunca, dakikada two milliliters akış hızıyla %1 ila 2 isof fluorine ile anesteziyi sürdürün. Ayak parmağı sıkıştırma testi yaparak anestezinin etkili olduğunu doğrulayın.

Ardından, görüntüleme oturumu boyunca solunumu ve vücut sıcaklığını izlemek için bir pnömatik yastık sensörü ve bir rektal sıcaklık probu kurun. Sol ayak bileğine bir fiber optik nabız oksimetresi sensörü takılmalı ve konumun korunması için ayak bir ip halkasıyla sabitlenip bantlanmalıdır. Görüntüleme, herhangi bir kontrast madde kullanmadan, solunum ve kardiyak sinyallerin kapılanması (gating) yoluyla gerçekleştirilecektir.

Yüksek çözünürlüklü üç boyutlu manyetik rezonans mikroskopi görüntüleri elde etmek için geniş açıklıklı 9.4 Tesla dikey açıklıklı bir mıknatıs kullanılmalıdır. Hayvanı hazırladıktan sonra, fareyi kalbi görüş alanının merkezine gelecek şekilde tarayıcıya yerleştirin. Ardından görüntüleme arayüzünü çalıştırın, komut çubuğundaki yeni çalışma tipi menüsünü seçerek ayar sayfasını açın ve ardından probu başlat, ayarla ve otomatik ölçeklendir seçeneklerini seçin.

RF bobini 400 megahertz proton rezonans frekansına ayarlamak için bobinin ucundaki uzaktan ayar ve eşleme (tune/match) düğmelerini kullanın. Ardından, ön tarama (pre-scan) sayfasına gidin. Frekans ve güç kalibrasyonunu çalıştırmak için şimleme (shimming) sayfasını açmak üzere x, Y, Z hızlı düğmesine basın.

Ardından tüm iterasyonları seçin ve otomatik şimleme (auto shimming) işlemini gerçekleştirin. Bir scout sekansı seçin. Görüş alanını (field of view) 35 milimetre olarak değiştirin.

Diğer varsayılan ayarları koruyun ve diziyi çalıştırın. Eğer kalp görüş alanının merkezinde değilse, hayvan tutucunun konumunu ayarlayın, RF bobini yeniden ayarlayın ve scout görüntüyü yeniden alın. Ardından gem dizisini seçin.

Kalbin kısa ve uzun ekseni boyunca iki ortogonal düzlem elde etmek için buradaki edinim sekmesinde görülen edinim parametrelerini girin. Ardından, nabız oksimetresi göstergesi kısa eksen sine görüntülerini toplamak için sine sekansını seçin ve sol ventrikülün anatomik ve fonksiyonel parametrelerini ölçün. Gradyan eko sine sekansını elde etmek için burada görülen parametreleri girin.

Görüntüleme kesitlerinin konumunu ve açısını kalbin uzun aks görünümüne göre ayarlayın. Ardından sekansı çalıştırın. Görüntüleme tamamlandığında.

Elde edilen görüntüleri IO sekmesini kullanarak DICOM formatına dönüştürün ve ilgili dosyaları işlenmek üzere veri merkezine aktarın. Görüntüleme prosedürünün sonunda, hayvanın anestezi etkisinden kurtulması için filtre üstlü bir kafeste beklemesini sağlayın. Fare, sternal recumbent pozisyonunu koruyabilecek kadar bilinci yerine gelene kadar gözetimsiz bırakmayın.

Burada, sol ventrikülün anatomik ve fonksiyonel parametrelerini analiz etmek için segment yazılımı kullanılır. Öncelikle DICOM formatındaki cine görüntüleri yazılıma yükleyerek başlayın. Ardından görüntüleme tekniği olarak MRGE'yi, görüntü tipi olarak cine'yi ve kesit olarak short axis mid ventricular seçeneğini belirleyin.

Görüntüleme düzlemi olarak, düzenle menüsünün sırasıyla "mevcut zaman dilimini end diyastole ayarla" ve "mevcut zaman dilimini end sistole ayarla" alt menülerini kullanarak end diyastol ve end sistol için kullanılacak zaman dilimlerini belirleyin. Ardından, sağ alt paneldeki önce LV, sonra endo ve EPI komut düğmelerini kullanın. Sol ventrikülü, endokardiyumu ve epikardiyumu sırasıyla manuel olarak çizmek için, ilgili komut düğmesine basarak papiller kasları kaldırın.

Hesaplamaların doğruluğunu artırmak için sağ üst paneldeki diyastolik hacim, sistolik hacim, atım hacmi ve ejeksiyon fraksiyonu gibi kantifiye edilmiş sol ventrikül parametrelerini okuyun. Ardından, duvar kalınlığı ve ventrikül çapı gibi sol ventrikül parametrelerini ölçmek için mis komut düğmesini ve ardından ölçüm kumpası komut düğmesini kullanın. Son olarak, görüntüleri gerektiğinde yeniden işlemek için segmentasyonlar dahil görüntüleri dot mat formatında kaydetmek amacıyla her iki görüntü yığınını ve segmentasyonu kaydet seçeneğini kullandığınızdan emin olun.

İki odacıklı görünüm görüntüleme için kalbin kesilme açısı burada görülebilir. Burada, deneysel otoimmün miyokardit etkilenmiş farelerin kalplerinde, sağlıklı farelere kıyasla yapısal kusurlara işaret eden yaklaşık 1,5 katlık bir sol ventrikül kalınlığı artışı görülebilmektedir. Sol ventrikül diyastolik hacmi ve ejeksiyon fraksiyonu üzerinden ölçülen kalp debisi, otoimmün miyokardit etkilenmiş farelerde sağlıklı farelere kıyasla azalmıştır.

Son olarak, yukarıdaki tedavi gruplarından alınan kalpler hematoksilin, eosin ve toin boyaması ile inflamasyon açısından değerlendirilmiştir; miyokarditli farelerden alınan kalplerin histolojik değerlendirmesi multifokal lenfosit infiltrasyonları göstermiş, ancak sağlıklı farelerde bu durum gözlenmemiştir. Bu prosedür uygulanırken, deneyler sırasında kalp hızının ve solunum hızının önemli ölçüde değişmemesi için hayvanın vücut sıcaklığının sabit kaldığından emin olmak önemlidir. Bu durum, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritiktir.

Bu videoyu izledikten sonra, miyokardit gibi inflamatuar kalp hastalıklarının farelerdeki fonksiyonel anomalilerini değerlendirmek için kullanılan manyetik rezonans mikroskobik tekniği hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ancak yüksek manyetik alanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle hayvan tutucusu ve diğer bileşenler manyetik olmayan malzemelerden yapılmış olmalıdır.