Name: Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Keşfedin, gerçek zamanlı hücre analizörü kullanarak yumurtalık kanserinin mezotelyal tabaka istilasını sürekli ölçme yöntemini. Bu teknik, metastatik davranışı dinamik olarak değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma CASS Vakfı Bilim ve Tıp Grant tarafından desteklenmiştir; (MB); Avustralya Projesi Hibe Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (KLS, 338516); ve Victoria Hükümeti&#39;nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Avustralya) tarafından.

1.. Hazırlanması Hücreler, Medya ve Reaktifler <ol><li> Metilselüloz-içeren ortam hazırlanması <ol><li> 250 ml&#39;lik bir şişe içerisinde steril Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (hiçbir katkı maddesi), 100 ml metilselüloz 1.5 g çözülür. </li><li> 5 dakika boyunca bir mikrodalga düşük üzerinde çözüm ısıtın; Üzerine kaynar önlemek için dikkat çekmek. </li><li> Metilselüloz toz yarı çözünmüş sonra, 125 ml hacim almak için temiz bir manyetik karıştırıcı ve medya ekleyebilirsiniz. </li><li> , Ters karıştırılır ve bir gece boyunca 4 ° C&#39;de karıştırıldı ve ardından 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın. </li><li> Dört adet 50 ml tüpler ve 2300 x g &#39;de 1.5 saat boyunca santrifüje eşit solüsyonu bölün. </li><li> 3 aya kadar 4 ° C&#39;de berrak, yüksek ölçüde zor akışlı, steril bir 50 ml tüpler içine süpernatant (stokunun yaklaşık% 90-95), kısım ve mağaza toplayın. </li></ol></li><li> Kültür ve Hücrelerinin Etiketleme <ol><li> Bir ti içinde tekkat yumurtalık kanseri hücre hatları korumak% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L ile desteklenmiş: 37 ° C, (OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri için 18 M199 KGN hücreleri 17 ve MCBD110 için DMEM) uygun bir büyüme ortamı içinde,% 5 CO2 de ssue kültürü kuluçka -glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin. </li><li> M199 olarak LP9 insan mezotel hücreleri korumak: Hams F12 ortamı 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile bir kuluçka makinesi içinde% 15 FBS, 10 ng / ml Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve 400 ng / ml hidrokortizon, ihtiva etmektedir. </li><li> Tohum istenen şişe büyüklüğü hücreleri yaklaşık% 75 konfluansa kadar büyür. % 0.05 tripsin / EDTA, 5 dakika boyunca 186 x g sıkma ve iki kez PBS ile yıkayın hücre pelletini kullanılarak hücreler tripsinizasyon ile harmanlayın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı Floresan Hücre Etiketleme Yöntemi <ol><li> Önceden ısıtılmış PBS/0.1% BSA, 1 ml 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda yeniden süspanse kanser hücreleri. </li><li> 5 mM stok Cep Tr 2 ul ekleyinace CSFE çözeltisi (veya uzun süreli muhafaza edilir, diğer tercih edilen hücre etiket) 10 uM bir nihai konsantrasyonda hücrelere ve bir su banyosu içinde 10-15 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj ile,% 10 FBS ve yeniden topak içeren buz gibi soğuk 1 ml ortam maddesi ile reaksiyonu söndürün. Uygun büyüme ortamı, önceden ısıtılmış 10 ml içinde süspanse (adım 1.2.1 bakınız). </li><li> 37 ° C&#39;de, 75 cm 2 filtre-kapaklı bir şişeye ve Tohum kültürü hücreleri,% 5 CO2. </li><li> Floresan etiketleme seviyesinin tespiti için yeterli olduğunu doğrulamak için bir floresan mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 75 konfluensisinin, hasat ulaşmak ve adımlar 1.2.3 ve üzeri 1.2.4 olarak saymak bir kez. </li></ol></li></ol> Metilselülozda küremsi 2.. Üretimi <ol><li> (300000 hücre toplam her biri tam 96 oyuklu bir plaka deney için gereklidir) küremsi oluşturulması için gerekli Bölüm 1 yumurtalık kanseri hücre hacmini hesaplar. Hayırte: Burada sunulan farklı hücre hatları kullanılarak eğer, üniforma sfero üretimi için hücre yoğunlukları her hat için optimize edilmesi gerekebilir. </li><li> Metilselüloz ortam içinde hücrelerin seyreltme hesaplanması için, ilk olarak 15 ml (adım 2.1) gerekli olan hücre hacmini çıkarın. </li><li> , Her bir hücre hattı için kültür ortamı, uygun bir hacme kadar 15 ml eksi hücre hacmine eşit (son% 20 metilselüloz olmak için) ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırın metilselüloz stok çözeltisinden 3 ml ilave edilir. </li><li> Metilselüloz içeren ortama 300,000 hücreleri ekleyin ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırılmıştır. </li><li> 37 ° C&#39;de 96 oyuklu bir içbükey alt kültür plakasının ve kültür her oyuğuna (3,000 hücre / kuyu olmak üzere toplam), hücre / metilselüloz / media karışımı pipetle 150 ul,% 5 CO2 1-4 gün boyunca veya üniforma spheroids (1 sfero / iyi tipik olarak izlenmektedir) oluşturmak kadar. </li></ol> 3.. Rtca Hücre Invasion Tahliller HAYIRTE: Empedans okuma hücre içeriği (CI), hücre durumunu temsil eden ölçülmüş hücre empedans göreceli değişimdir boyutsuz bir parametre olarak ifade edilmiştir. Microsoft Excel gibi bir elektronik tablo içine bir analiz için, ithalat verileri,. <ol><li> Tabaka preparasyonu <ol><li> Her seferinde 4 kuyu gruplar halinde, toplam yüzey alanı kapalı olduğundan emin olmak için bir 16-çukurlu RTCA CIM plakanın üst bölmesinin her oyuğuna (serum içermeyen kültür ortamı içinde 1:10 seyreltilmiş) 50 ul matris ekleme . Herhangi bir aşırı sıvı kurtulmak için, yavaş yavaş hemen matris 30 ul çıkarın ama. </li><li> Bir doku kültürü inkübatörü içinde, kullanılmadan önce, 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir kanser hücresi, üst bölmeye hattı ve alt bölmeye (deneme tasarım göre) veya serumsuz ortam için uygun 160 ul serum içermeyen ortam (SFM) 30 ul ekle. </li><li> Üst bölme ve equilibr içine alt bölmeyi tıklayarak CIM plaka montebir doku kültürü inkübatörü içinde, 1 saat için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde yedi. </li></ol></li><li> Rtca Enstrüman Programlama <ol><li> Rtca programını açın ve &#39;Düzen&#39; sekmesini seçin. Tüm deneysel kuyu vurgulayın. </li><li> Sağ kuyular tıklayın ve &#39;kuyu üzerinde açın&#39; seçeneğini; istediğiniz gibi sonra deneysel koşullar ve hücre adlarında doldurun. </li><li> , Programa adımları veya alt basamakları eklemek &#39;bir adım Ekle&#39; &#39;Zamanlama&#39; sekmesini ve sağ tıklayın seçin. İlk adım seçilir &#39;bir adım eklemek&#39; bir kez otomatik olarak programa dahil olan önceden programlanmış bir arka plan süpürme vardır. </li><li> LP9 tek tabaka kurulması sırasında okumaları kaydeder Rtca programı, Adım 2 için istenen program ayrıntılarını girin. &#39;&#39; Interval&#39;ın &#39;sekmesini seçip &#39;15 dk girerek empedans okumaları arasındaki zaman aralıklarını ekleyin. &#39;Süre&#39; sekmesine gelin seçerek deneysel süre ekled 12-24 saat arasında bir zaman giriyor. </li><li> Sonraki adımları eklemek için, &#39;bir adım Ekle&#39; &#39;Zamanlama&#39; sekmesini ve sağ tıklayın seçin ve yukarıdaki gibi, ilave adımların ayrıntılarını girin. Rtca programın Adım 3 sfero işgali sırasında okuma almak için aracı yönlendirecektir; &#39;Süre&#39; sekmesi altında Interval&#39;ın &#39;sekmesi ve &#39;48 saat&#39; altında &#39;&#39;5 dakika girin. </li><li> Menü çubuğundaki &#39;Plaka&#39; seçeneğini seçin ve kaydedin. </li></ol></li><li> Sferoid Invasion LP9 Monolayer ve Ölçüm Üretimi <ol><li> Yukarıdaki Adım 3.2 &#39;den Rtca enstrüman ve açık olan programda CIM plaka koyun. Önce hücreler ekleyerek seçin menü çubuğunda &#39;Yürütme&#39; ve ardından &#39;Start&#39;. Bir arka plan süpürme otomatik (Rtca yazılım talimatları Adım 1) yapılacaktır. </li><li> Bir doku kültürü kaputu arka süpürme ve yerine aşağıdaki cihazdan CIM plakasını sökün. </li><li> Plaka 50,000 LP9 hücreler her CIM plakanın üst bölmesine 160 ul SFM içinde süspansiyon haline getirildi. </li><li> Rtca enstrüman plaka koyun ve LP9 tek tabaka (Rtca programın Adım 2) bir gecede kurulması ise bilgi okunması her 15 dakika sürer. </li><li> Hasat kanser sferoidler, yukarıda, Aşama 2 &#39;Generation metilselülozda küremsi&#39; altında elde. <ol><li> Aseptik, 1 ml pipet üst kapalı 1 mm kesilmiş ve hafifçe de her içeriğini almak için kullanın. Steril bir tüpe aktarın. </li><li> Santrifüj 8 dakika boyunca 120 x g küremsi ve hafif aspirasyonla metilselüloz içeren ortam çıkarın. </li><li> Her yıkamadan sonra sferoidler peletleştirmek için 8 dakika boyunca 120 x g&#39;de santrifüje tabi tutarak, PBS ile iki kez daha küremsilerin yıkayın. </li><li> Her deney için, kuyu, FBS&#39;siz ortamda 160 ul içinde 10 sferoitlerin bir toplam tekrar süspansiyon. </li><li> Menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; seçme ve kontrol tarafından Rtca deneyi Pause# 8216; &#39;Pause. Aletten CIM plakasını çıkarın ve bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Her bir kaynağı havalandır gelen ortam dışı ve LP9-sadece kontrol yuvaları için küremsi içeren bir ortama (160 ul içinde 10 küreler gibi) ya da taze ortam ile değiştirin. </li></ol></li><li> Rtca cihaza plaka dönüş. Menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; ve &#39;adım durdurun&#39; işaretleyin. Program otomatik olarak bir sonraki adıma hareket edecek. Denemeyi sürdürmek için, menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; ve &#39;Start / Devam&#39; işaretleyin. Rtca programda Adım 3. başlatacaktır. </li></ol></li><li> Veri Analizi <ol><li> Küremsi hücre invaziv seviyesini belirlemek için, her bir zaman noktasında sadece yumurtalık kanseri hücre çizgileri için tek tek elde edilen okumalardan LP9 tek tabaka için elde edilen değerleri çıkarılır. </li><li> &#39;Işgaline küremsi&#39; çizmek için, S, sferoidler plakaya ilave edildi hangi bir zaman noktasında tüm değerleri normalize&#39;0 &#39;o zaman noktasını etting. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008%3A+GLOBOCAN%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li>
<li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites%3A+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li>
<li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+pathogenesis%3A+a+model+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li>
<li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li>
<li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium%3A+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li>
<li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurleson%2C+KM+%22J+Transl+Med%22">J Transl Med</a>. 4, 6(2006).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li>
<li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li>
<li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack%3A+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li>
<li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+confrontation+assay%3A+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li>
<li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients%3A+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li>
<li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line%2C+KGN%2C+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li>
</ol>

ACEA Biosciences, Inc. ve MIMR-PHI Tıbbi Araştırma Enstitüsü tarafından ödenen açık erişim ücreti.

Istila yumurtalık kanseri hücreleri, fibroblastlar, adipositler ve mezotel hücreleri de dahil olmak üzere, periton yüzeyindeki hücre tiplerinin çeşitli etkileşim ve kanser hücreleri ve peritoneal hücrelerinin arasında iki yönlü iletişim metastatik süreci 2 sürüş kilit rol oynadığı düşünülür. Bir kez hakim, burada tarif edilen protokol mikro-peritoneal olan bu etkileşimlerin çalışmaya kolayca adapte edilebilir, örneğin, eksojen sitokinler, büyüme faktörleri ya da CIM plaka ya da genetik manipülasyon üst veya alt hazneye özgü inhibitörlerin eklenmesi ile kanser ya da peritoneal hücre çizgilerinin. Ayrıca, bu yöntem, düzenleyici sinyaller ve periton boşluğu içinde bir metastatik lezyonun yöneten kuruluş hücresel etkileşimler direkt bilgiler edinmek için malign asit ve / veya birincil peritoneal hücrelerden taze hasat edilmiş primer yumurtalık tümör hücreleri ile birlikte kullanılabilir <skadar&gt; 2. Tek hücre ya da küresel cisimler invaziv kapasitesini ölçmek için RTCA aletin kullanımı, geleneksel tek bir uç nokta tahlilleri ve zaman atlamalı resim analizleri fazla birkaç avantaj sunar. Rtca enstrüman saat veya gün olabilir, bir deneyinde boyunca sürekli belirli aralıklarla hücresel işgali ölçer. Bu tek nokta deneylerinin kısıtlamaların üstesinden zamanla invazyon oranı, değişikliklerin tespitine olanak sağlar. Örneğin, bir tek son nokta (Şekil 2), örneğin, 3 saat sonra farklı kanser hücre hatları işgali verileri inceleyerek, KGN ve OVCA433 hücreler çok daha invaziv OVCA429 hücrelerden daha vardı hatalı sonuca neden olabilir. Bu teknolojinin bir diğer avantajı da RTCA alet elektrik empedans değişiklikleri ölçen olmasıdır. Bu işlemler hücre phen üzerinde istenmeyen etkileri olabilir ki, dışsal bir ajan ile hücrelerin etiketlenmesi olmadan çalıştırılabilir anlamına gelirotype veya fonksiyon. Bu in vivo doğaya 2 yansıtıcı olmayan moleküler ve fenotipik değişiklikler meydana getirilmesini önlemek amacıyla en az manipülasyon tutmak için zorunludur hangi habis asit, türetilen birincil yumurtalık kanser hücrelerinin okuyan bu özellikle önemli hale gelir. Ayrıca, Rtca alet kullanımı zaman zaman atlamalı mikroskopi ile ilgili analizler tüketen önler ama aynı zamanda tahlil optimizasyonu için anahtar deneysel pencere hızla belirlenmesini sağlar sadece gerçek zamanlı, nicel verilerin toplanmasını sağlar. Küremsi istilası üzerinde bir dizi faktöre etkilerini karşılaştırarak, bu özellikle yararlıdır, gibi çeşitli faktörler, farklı zaman noktalarında ya da zaman içinde büyük ölçüde farklı profillere sahip maksimal etkiler de sarf edebilirler. Bu protokol değişiklikler (örneğin, için uygun olmasına rağmen, farklı bir ECM matris, değişik kanser hücresi çizgileri veya farklı hedef cel kullanımıBunu yaparken eğer ls), çeşitli deneysel koşullar ilk optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, önceki küremsi invazyon çalışmaları başlamadan, kanser hücre / CIM plakanın uygun sayısı de ilk olarak tek tabakalı kültürü hücre sayısı titrasyon deneyi ile tespit edilmelidir. Oyuk başına kullanımı küremsiler uygun sayısı bu analizlere dayanmaktadır. Ilk oluşturulan Örneğin, mevcut yöntemde, sferoidler, her biri yaklaşık 3000 hücreleri içermektedir. İlk hücre sayısı titrasyon tek tabaka içinde 30,000 hücre analizleri istilasında tespiti için en uygun olan olduğunu göstermektedir, daha sonra 10 sferoidler de CIM tabak başına eklenir. Ko-kültür deneylerini yaparken Dahası, ayrı ayrı bu hücrelerin sonuçları yıkmak olabilir gibi, doğal olarak invaziv olup olmadığını belirlemek için &#39;hedef&#39; hücre tek tabaka davranışlarını incelemek için önemlidir. Gösterilen örnekte, kanser sferoidler bir LP9 hücre Monola üzerine plakalanırFBS ve olmayan Yer, kemo-çekici olarak da altına ilave edildi. Buna paralel olarak, LP9 hücreler her bir ıslah koşulları altında, tek başına kültürlenir. Hücre ve küremsi istilacı kapasitesini incelemek Benzer şekilde, bu iki davranışları (geçiş yok iken, yani istila bir ECM bariyerin proteolitik sindirimi gerektirir) ayırmak için de kendi kapasitelerini göç incelemek için de önemlidir. Bunu yapmak için, ECM bariyer ihmal (3.1.1 adımlar - 3.1.3) ve yerine ECM bariyer paralel olarak, deneyi yürütmek. Istenirse ikincisi &#39;işgali&#39; ölçüsü, eski &#39;göç&#39; tedbire düzeltilebilir. Hücrelerin alt odaya işgal kez, bunların bağlanma, yayma ve zarın alt çoğalmasında bir değişiklik değişikliklere katkıda bulunabilir: Son olarak, bu elektrik empedans ölçümleri elde edilen bilgi kapsamı sınırlıdır dikkat etmek önemlidir empedans readings. Kapsamlı küremsi hücre davranışlarını değerlendirmek amacıyla küremsi hücre canlılığı, yapışması, göç ve morfolojisinin diğer deneyleri ile birlikte kullanıldığında, bu nedenle, bu yöntem en çok bilgilendirici. Küremsi morfolojisi ve sağlık niteliksel değerlendirmeleri istila kantitatif RTCA deneyleri paralel olarak yapılabilir, böylece örneğin, ideal olarak, tam olarak küremsi-mezotel etkileşimleri anlamak amacıyla, ayrı eş-kültür, aynı zamanda standart faz mikroskobu altında periyodik görüntülü olmalıdır. İsteğe bağlı etiketleme aşaması gerçekleştirilir, bunlar sfero gelen, parçalamak ve işaretlenmemiş mezotel hücreleri ile etkileşime, daha sonra bir kanser hücrelerinin davranışları floresan mikroskobu altında belirlenebilir. Ikinci bir hücre tipi ile birlikte kültür sırasında flüoresan kanser hücrelerinin etiketlenmesi bir yararı, sadece kanser hücreleri, hücre ve ECM engelleri işgal onaylamak için zaman mümkün olmasıdır. <p class="jove_content"&gt; Özet olarak, bu yöntem ve mezotel ECM engellerin yumurtalık kanseri küremsi işgalinin bir yüksek verimli nicel analizini temsil etmektedir. Ekzojen sitokinler, büyüme faktörleri, ya da iyi CIM plakanın üst ya da alt bölmelerine özel inhibitörlerinin eklenmesi yoluyla, bu yöntem üzerinde mezoteliyalı ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörler, hızlı, belirlenmesini sağlar zamanı.

Yumurtalık kanseri tüm jinekolojik kanserlerin 1 en yüksek ölüm oranına sahiptir. Dünya çapında, ~ 230.000 olgu nedeniyle her yıl 1 hastalığa 100.000 ölüm vardır. Hastaların çoğu (&gt;% 75) kanser zaten metastaz sonra tedavi daha kemoterapi artan direnci ile komplike olduğunda, tanı ve prognoz 2 kötüdür. Evre III-IV metastatik hastalığı olan hastalar sadece% 30-40 3 5 yıllık sağkalım oranları var. Bu nedenle, etkin bir şekilde ileri hastalığı tedavi etmek amacıyla, yumurtalık kanseri metastazı altında yatan hücresel davranışların daha iyi anlaşılması için acil bir ihtiyaç vardır. Yumurtalık kanseri metastazı mevcut model, tümör davranışı üzerindeki etkileri farklı bir mikro oluşur, her biri metastaz, çeşitli adımlar önermektedir. Metastaz yumurtalık kanseri hücreleri, başlangıçta primer tümör sitesinden döken ve nonadher hayatta edilirtek hücre ya da üç boyutlu bir çok-hücreli yapılar da peritoneal sıvı içinde ent durum, agregatları ya da çok-hücreli küremsilerin 2,4,5 adlandırılır. Süspansiyon içinde küremsilerin oluşturmazlar hücreler anoikis 2,4,5 karşı daha hassastır. Ayrıca, küremsi kalıntı hastalığı ve kanser 2,4,5 daha sonra yeniden oluşumuna katkıda kemoterapi direnci artış görülmez. Yumurtalık kanseri metastazı ikinci bir kritik adım periton duvarı ve omentum 5,6 bünyesinde kurulan ikincil tümörlerde serbest-yüzen kümelerden agrega geçiştir. Hücre-hücre ve hücre-substrat etkileşimleri agrega oluşumu, hayatta kalma ve periton 4-11 mezotel astar tarafından üretilen hücre dışı matrisin (ECM) uyulması implike edilmiştir. Henüz olarak, bu süreçlerin tam olarak anlaşılamamıştır. Yumurtalık kanserlerinin yayılmasında rol mekanizmaları tanımlamak için, küremsiler homo olabilirated kültür ortamı 12,13 için metilselüloz ekleyerek ya da düşük tespit kalıpları 2,14 üzerinde hücrelerin kültürlenmesi ile, ya süspansiyon içinde hücrelerin bakımı, yapışmayan kültürü yöntemleri kullanılarak kurulmuştur kanseri hücre hatları. Bu şekilde kültürlendi olduğunda, yumurtalık kanser hücrelerinin in vivo 2,14 bulunan tümör agrega benzer hücresel, moleküler ve biyokimyasal özellikleri gösteren çok-agregatlar ya da küresel cisimler içine monte edin. Oluşmasından sonra, sferoidler, daha sonra yapışmayan ortamından hasat edilebilir ve daha fazla fonksiyonel çalışmalar için katı çeşitli yüzeyler üzerine kaplandı. Bu doğru örneğin intraperitoneal sıvısı olarak bir yapışkan olmayan bir ortam içinde metastaz yumurtalık kanseri hücrelerinin davranışları modeli olmayan tek tabakalı kültürü deneyleri üzerinde bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Kanser küremsi girici kapasitesi Boyden odalarına 2, geleneksel nokta deneylerinde değerlendirilebilir </suyumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreç olarak p&gt;, ancak bu yaklaşım, yanıltıcı olabilir. Yeni bir gerçek-zamanlı yöntem yumurtalık kanseri küremsilerden 15,16 işgal ederek mezotel hücre açıklık time-lapse video mikroskopi kullanılarak icat edilmiştir; Ancak, zaman atlamalı verilerin analizi zaman alıcı ve öznel olabilir. Burada, gerçek zamanlı olarak yumurtalık kanseri küremsiler istilacı davranışlarını değerlendirmek için hızlı bir nicel bir yöntem tarif edilmektedir. İlk olarak, bir küremsi-mezotel hücre modeli çok-hücreli küreler, takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar işgal zaman yumurtalık kanseri metastazı aşamasını temsil eden kurulmuştur. Daha sonra gerçek zamanlı hücre Analyzer (RTCA, şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız) için yöntem sferoitlerin olarak büyüdü ve bu modelde test edilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin nicel gerçek zaman ölçümlerini yapmak için uyarlanmıştır. RTCA Instrument, hücresel tepkileri elektrik empedans değişiklikleri ölçerek eksojen etiketler için gerek kalmadan, bir tahlilin boyunca sürekli olarak izlenir. Özel olarak tasarlanmış kültür levhaları, 2 de odalı (&#39;CIM&#39; plakalar) üst ve alt odalar arasındaki arayüzde bir mikro-gözenekli zarın altında bulunan altın kaplama Mikroelektronlar sahiptir. Hücreler, bir ECM ya da ECM / hücresel bariyeri ile işgal olarak alt bölme içinde elektrotların yer elektrik empedans değişimlerin ölçümü sağlar. Her bir CIM levha kuyunun 2 odaları arasında Zar arayüz ilk çıkar ECM bileşeni ile kaplanır. Küremsi-mezotel hücre modeli sisteminde, arayüz insan mezoteliyalı bir konfluent tek tabaka ardından periton mezotel astar yatan karmaşık ECM taklit etmek Matrigel tabakası (şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız), &#39;ile kaplanır Hedef &#39;hücreler. Son olarak, önceden şekillendirilmiş, yumurtalık kanseri olan bir reklam sferoidlerded. Yumurtalık kanseri küremsi hücrelerinin aktif alt bölmeyi ulaşmak ve elektrik empedansı okumaları değiştirmek için hedef hücreler katmanı ve matris işgal gerekir. Kendi Hedef hücreler aynı zamanda matris tabaka boyunca işgal ve bu tahlilde kullanım için uygun olan emin olmak için değerlendirilir.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analizörü</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM plakaları&nbsp;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&nbsp;</td><td>Moleküler Problar</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Metilselüloz (4.000 santipoz)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td></td><td></td>11150067</tr><tr><td>Ham'ın F-12 Besin Karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td></td><td></td>11765062</tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu içbükey kültür plakası ve nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 İnsan mezotelyal hücre hattı</td><td>Coriell Tıbbi Araştırma Enstitüsü&nbsp;</td><td></td><td></td>AG07086</tr><tr><td>Büyüme Faktörü azaltılmış Matrigel matrisi</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr></tbody></table>

real time mezotelyal hücrelerinin yumurtalık kanseri sferoid ek ve invasion değerlendirilmesi

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Yumurtalık kanserleri periton sıvısı içine dökülme ve periton içinde uzak sitelere dağıtılmasıyla metastaz. Kanser hücreleri, doğal olarak takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar istila metastatik sürecine katkıda çok hücreli yapılar halinde toplamak gibi tek tabakalı kültürler doğru, yapışkan olmayan bir ortam içinde, kanser hücrelerinin davranışları modeli yoktur. Yumurtalık kanseri metastazı, çok hücreli agrega, ya da küresel cisimler bu önemli aşama modellemek için, yapışkan olmayan koşullar altında tutulur kurulmuş yumurtalık kanseri hücre hatları oluşturulabilir. In vivo olarak tümör hücreleri tarafından karşılaşılan periton mikro taklit etmek için, küremsi-mezotel ko-kültür modeli küreler, hücre dışı bir matris bariyer üzerinde oluşturulan bir insan mezotel hücre mono tabakasının üzerine plakalanır önceden edildiği kurulmuştur. Yöntem daha sonra kantitatif gerçek yapmak için gerçek zamanlı bir hücre analiz cihazı kullanılarak geliştirilmiştirküremsi olarak yetiştirilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin zaman ölçümleri. Bu yaklaşım, geleneksel uç nokta tahlilleri ve daha zahmetli gerçek zamanlı mikroskobu resim analizleri üzerinde birçok avantajı vardır zaman, uzun süreler boyunca işgalinin sürekli ölçülmesi için izin verir. Kısaca, bu yöntem, zaman içinde mezotel ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörlerin bir hızlı ve tespitine olanak sağlar.

Yumurtalık kanseri sferoidler süspansiyon içinde kültürlenmesi ile veya habis ascites 2,14 birincil tümör hücrelerinin hasat hücre hatlarının çok türde üretilebilir. Burada iki epitelyal yumurtalık kanseri hücre kuşakları, OVCA433 ve OVCA429 ve bir yumurtalık tümörü granüloza hücre hattı, KGN, sferoidler (Şekil 1A) oluşturmak için kullanılmıştır. Metilselüloz ilavesiyle viskoz yapılmıştır ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş ise, bu yöntemde, hücre U-tabanlı bir kuyu kültürlenmiştir. Bu koşullar altında, bir çok yumurtalık kanser hücreleri sferoidler 13 oluşturmak üzere bir araya getirmek için bir doğal yeteneğini sergilerler. Metilselülöz / ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş, gece boyunca kültürün ardından, üç hücre çizgileri çap olarak yaklaşık 400-500 mikron (Şekil 1A) küçültülerek küremsi yapılar oluşturulur. Bu arada, RTCA CIM plakası ilk olarak matris ve insan mes sonra konfluent tek tabaka ile geçirgen membran arabirimi kaplanmasıyla hazırlanır,othelial hücreleri (Şekil 1B). Bir kez oluştuktan sonra, sferoidler sonra hazırlanan CIM plakasına aktarılır. Hasat kanser sferoidler LP9 tek tabaka üstüne kaplama ve aşağıda açıklandığı gibi değerlendirilir. Paralel kültürlerin (isteğe bağlı hücre etiketleme adım takip edildi ise veya floresan mikroskobu altında) standart faz mikroskobunda Görüntüler Rtca verilerin yorumlanması (Şekil 1C) yardım etmek için periyodik olarak alınır. Bu, bir kanser hücre hattının işgal bazal seviyesi, hem de kimyasal çekici kaynaklı işgali hem de değerlendirmek için bilgilendirici. Tipik olarak, invaziv bazal hem üst hem de alt bölmelere SFM eklenmesi ile ölçülür. Birçok potansiyel kemo-çekiciler içeren komple ortam (% 10 FBS), &#39;kemoatraktan kaynaklı&#39; işgaline (Şekil 2) incelemek için, mevcut örnekte kullanılmıştır. Tek başına LP9 mezotel hücreleri paralel çalışmalar, bu hücrelerin minimal olduğunu doğruladıvasive böylece bazal ya da &#39;kemoatraktan&#39; neden olduğu koşullar altında ve ya da 2 gün boyunca yumurtalık kanseri hücreleri ile ortak kültür analizleri içinde kullanmak için iyi bir hücre tipi olan (Şekil 2A ve 2B). Bunun aksine, üç hücre çizgilerinin herhangi biri kullanılarak elde yumurtalık kanseri sferoidler kemoatraktan (FBS) (Şekil 2A-2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Geleneksel uç nokta deneyleri üzerinde Rtca gerçek zamanlı araçları kullanmanın büyük avantajı hücre / sfero davranış değişiklikleri zamanla ölçülebilir olmasıdır. 2 gün deneyi boyunca, KGN, OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri her bir (hücre endeksleri artırarak gösterilir) kemoatraktan ancak istilasının düşük bazal seviyeleri (Şekil 2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Eğrileri (Şekil 2C) paralel pistleri ile gösterildiği gibi hücre çizgileri, invazyon benzer oranları sergiledi; Bununla birlikte, daha yüksek bir OVCA429 eğri üst asimptotuna sergiledibu da diğer hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir istila maksimal düzeyini göstermektedir. Bundan başka, hücre çizgilerinin KGN hücreleri hızlı bir şekilde (Şekil 2B) sırasıyla daha uzun işgal 3-5x alma hücre ve matris bariyerleri ve OVCA433 ve OVCA429 hücreleri istila ile, invazyon başlangıcı için kendi zamanlarda farklılık sergiledi. Önemlisi, işgali başlangıcında onların davranışları işgali için kendi genel kapasite (Şekil 2C ve 2D) prediktif değildi. Bu, kanser hücre çizgilerinin Farklı doğal özelliklerini göstermektedir değil, aynı zamanda farklı faktörler küremsi erken ve geç invazif davranışları düzenleyebilir olduğunu gösteriyor olabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1 experimental Sferoid nesil ve model A yukarı ayarlayın:.. I. Oda metilselüloz / media (üst) oluşturan küremsi faz kontrast mikroskopisi altında bir tek tabaka (alt) olarak yetiştirilen uygun hücre çizgisinin büyücü: şematik RTCA 2 CIM plaka de, yumurtalık kanseri, önceden oluşturulmuş olan kurmak odacıklı gösteriyor sferoidler bir kimyasal çekici olarak da FBS ± üst bölmesi ve ortam içinde LP9 mezotel tabaka / matris bariyerin bir tek tabaka üzerine plakalanmıştır alt bölmeye eklenir. . Faz kontrast mikroskobu (sol) veya floresan mikroskobu (sağ) altında LP9 tek tabaka üstüne KGN küremsiler Görüntüleri: daha fazla hücre alt kamara C engelleri işgal olarak elektrik empedansı artırarak 2 odacıklı önlemin arayüzü altında Elektrotlar. Ölçek bar = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> .. Şekil 2. Gerçek zamanlı yumurtalık kanseri küremsi istila veri A - B: iyi bir CIM levhanın alt odasına FBS ile ve olmadan yapılan bir RTCA istila tahlilinden Örnek oluşur. KGN hücre istilası LP9 mezotel hücreleri ile karşılaştırılır. Sonuçlar 24 saatlik zaman (A) ve bütün bir iki günlük test süresinde (B) üzerinde üçlü kuyulardan ortalama ± SD Cep Endeksi olarak gösterilen C - D:. KGN OVCA429 invaziv kapasitesinin karşılaştırılması ve OVCA433 hücre 24 saatlik bir periyodun (C) üzerinde ve 2.5 saatlik bir süre (D) üzerinde daha ayrıntılı bir şekilde tasvir hatları.

Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Bu prosedürün genel amacı, metastazın asteroid mezotelyal hücre ko-kültür modelinde over kanseri hücresinin invazyonunu gerçek zamanlı olarak hızlıca nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin metil selüloz içerisinde yapışmayan koşullarda kültüre edilmesiyle hücre hatlarından over kanseri oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, peritoneal boşluğun mezotelini ve mezotelyal astarın kendisini destekleyen bazal membranı taklit etmek amacıyla, iki bölmeli kuyucuğun üst odasını matrigel ile kaplayarak gerçek zamanlı bir hücre analizörü, CIM plakası hazırlamaktır.Ardından, over kanseri steroidleri toplanır ve gerçek zamanlı analizör plaka kuyucuklarının üst bölmelerine eklenir. Son adım, analiz süresince önceden belirlenmiş aralıklarla periyodik okumalar yapacak olan gerçek zamanlı hücre analizörünü programlamak ve başlatmaktır. Nihayetinde elde edilen sonuçlar, over kanseri hücrelerinin hücresel ve matriks bariyerlerini istila ederken bunları düzenleyen temel faktörlerin belirlenmesinde kullanılan sürekli invazyon sürecini betimler.Bu tekniğin, kanser hücresi invazyonunun standart transwell analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu yaklaşımın kanser hücresi invazyonunun uzun süreler boyunca sürekli olarak ölçülmesine olanak tanımasıdır. Over kanseri metastazlarının dinamik doğasını tam olarak yakalayamayan tek bir uç nokta analizinin aksine, over kanserine dair içgörü sağlamak için kullanılan bu yöntem, meme kanseri gibi farklı metastatik süreçleri veya kanser hücrelerinin endotel bir tabaka boyunca hareketini incelemek için de uygulanabilir. Benzer şekilde, embriyo implantasyonu sırasındaki trofoblast invazyonu gibi normal hücre invazyonlarını incelemek için de kullanılabilir. Over kanseri hücrelerini floresan hücre işaretlemesine hazırlamak için.Öncelikle hücreleri %75 konfluenlikte hasat edin ve her 0,1% BSA içeren 1 mL önceden ısıtılmış PBS başına 1 milyon hücre/mL final konsantrasyonunda hücreleri yeniden süspanse edin. Kuyucuk başına optimal steroid miktarının eklenmesi ve steroidin dikkatle taşınması, bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. Ardından, 5 mM stok CellTrace CFSE çözeltisinden, hücrelere 10 µM final konsantrasyonda olacak şekilde 2 µL ekleyin ve 37 °C'de 10 ila 15 dakika inkübe edin. Bir su banyosunda, reaksiyonu %10 FBS içeren 1 mL buz gibi soğuk besiyeri ile durdurun ve santrifüj ile yeniden peletleyin. Uygun, önceden ısıtılmış 10 mL büyüme besiyerinde yeniden süspanse edin ve hücreleri 75 cm²'lik filtre kapaklı bir flaska ekerek, floresan işaretleme seviyesi tespit için yeterli olana kadar 37 °C'de, %5 CO2 altında kültüre edin.Bu prosedüre, her bir hücre hattı için uygun kültür ortamı hacmini ölçerek başlayın; bu hacim, sferoid üretimi için gereken hücrelerin hacmi çıkarıldıktan sonra kalan 15 mililitredir. Nihai metil selüloz konsantrasyonunun %20 olması için kültür ortamına üç mililitre metil selüloz stok çözeltisi ekleyin ve nazikçe ters çevirerek iyice karıştırın. Metil selüloz içeren ortama 300.000 hücre ekleyin ve nazikçe ters çevirerek iyice karıştırın; ardından, hücreli metil selüloz ortam karışımından 150 mikrolitreyle 96 kuyucuklu konkav tabanlı bir kültür plağının her bir kuyucuğuna pipetleyin.Bu işlem, kuyuk başına toplam 3000 hücre ile 37 °C'de, %5 karbondioksit altında bir ila dört gün boyunca veya homojen bir PHE oluşana kadar kültür yapılmasıyla sonuçlanacaktır. Genellikle kuyu başına bir steroid gözlemlenir; gerçek zamanlı hücre analizörü veya RTCA hücre invazyon deneyi, 16 kuyucuklu RTCA iki odacıklı CIM plakası kullanır. Her seferinde dört kuyucukluk gruplar halinde çalışarak, toplam yüzey alanının kaplandığından emin olmak için plakanın üst odasındaki her bir kuyucuğa 50 µL matriks ekleyin.Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için hemen ancak yavaşça 30 µL matris çıkarın. Kullanmadan önce plakayı bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de dört saat inkübe edin. Dört saat sonra, üst bölmeye her kanser hücre hattı için uygun 30 µL serumsuz ortam ve alt bölmeye serumlu veya serumsuz 160 µL ortam ekleyin.Deneysel tasarıma uygun olarak, alt bölmeyi üst bölmeye tıklatarak CIM plakasını birleştirin ve 37 °C'lik bir inkübatörde dengeleyin. Bir saat boyunca doku kültürü inkübatöründe bekletin, RTCA programını açın ve düzen (layout) sekmesini seçin. Tüm deneysel kuyucukları vurgulayın, kuyucukların üzerine sağ tıklayın ve kuyucukları aç (turn on wells) seçeneğini belirleyin.Ardından, deneysel koşulları ve hücre isimlerini isteğinize göre doldurun. Programa adımlar veya alt adımlar eklemek için program sekmesini seçin ve "adım ekle" üzerine sağ tıklayın. İlk adım, programa otomatik olarak dahil edilen önceden programlanmış bir arka plan taramasıdır.Adım ekle seçeneği belirlendikten sonra, LP dokuz insan mezotelyal hücre monokatmanının oluşumu sırasında okumaları kaydedecek olan RTCA programının ikinci adımı için istenen program detaylarını girin. Aralık sekmesini seçip 15 dakika girerek empedans okumaları arasındaki zaman aralıklarını ekleyin. Süre sekmesini seçip 12 ila 24 saat arasında bir zaman girerek deney süresini ekleyin.Sonraki adımlar aynı şekilde eklenir. RTCA programının üçüncü adımı, cihazı sıvı istilası sırasında okumalar yapmaya yönlendirecektir. Aralık sekmesi altına beş dakika ve süre sekmesi altına 48 saat giriniz.Menü çubuğundan plakayı seçin ve kaydedin. Bu prosedüre başlamak için CIM plakasını RTCA cihazına yerleştirin ve daha önce kaydedilen programı açın. Menü çubuğundan yürüt'ü (execute) seçin; ardından bir arka plan taraması otomatik olarak gerçekleştirilecektir.Arka plan taramasının ardından, CIM plakasını cihazdan çıkarın ve bir doku kültürü davlumbazı plakasına yerleştirin. 160 µL serumsuz medyuma süspande edilmiş 50.000 LP nine hücresini her bir CIM plakasının üst bölmesine yerleştirin. Plakayı RTCA cihazına yerleştirin ve LP nine monotabakası gece boyunca oluşurken her 15 dakikada bir okuma yapın; ertesi gün, 1 mL'lik bir pipet ucunun üst kısmından 1 mm'lik bir parçayı aseptik olarak kesin ve bunu her bir hücre hattı için her kuyucuğun içeriğini nazikçe geri almak için kullanın.10 adet steroidi steril bir santrifüj tüpünde birleştirin. Steroidleri 120 GS'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından Metilselüloz içeren ortamı nazik bir aspirasyonla uzaklaştırın. Steroidleri her yıkamanın ardından çöktürmek için 120 GS'de sekiz dakika santrifüjleyerek, küreleri PBS ile iki kez daha yıkayın.Her bir deney kuyuğu için, PBS içermeyen 160 µL medyumda toplam 10 steroid süspande edin. Menü çubuğundan execute seçeneğini seçip pause kutucuğunu işaretleyerek RTCA deneyini duraklatın. CIM plakasını cihazdan çıkarın ve bir doku kültürü kabinine yerleştirin.Her bir kuyucuktaki medyumu aspire ederek alın ve steroid içeren medyum ile değiştirin. Plakayı RTCA cihazına geri yerleştirin. Menü çubuğundan execute seçeneğini belirleyin ve abort step kutucuğunu işaretleyin.Program bir sonraki adıma otomatik olarak geçecektir. Deneye devam etmek için menü çubuğundan execute seçeneğini belirleyin ve start continue kutucuğunu işaretleyin. RTCA programındaki üçüncü adımda, bu deneyde iki epiteliyal over kanseri hücre hattı olan OVCA 4 33 ve OVCA 4 29 ile bir over granüloza hücre tümör hattı başlatılacaktır.Gece boyu kültürleme ve metil selüloz içeren medyumda süspanse edilmiş U tabanlı kuyucukların ardından steroidler üretmek için KGN kullanılmıştır. Her üç hücre hattı da yaklaşık 400 ila 500 mikrometre çapında kompakt steroid yapıları oluşturmuştur. Alt paneller, tek tabaka ölçeğinde büyütülen eşleşen hücre hattını göstermektedir.Çizgiler, oluşturulduğunda 100 micrometers değerini temsil eder. Steroidler toplandı ve bir R-T-C-A-C-I-M plakası içindeki bir LP nine mezotelyal hücre monotabakasının üzerine ekildi. RTCA verilerinin yorumlanmasına yardımcı olmak amacıyla, paralel kültürlerin faz kontrast mikroskobu veya floresan mikroskobu altındaki görüntüleri periyodik olarak alındı.Hem bir kanser hücre hattının bazal invazyon düzeyini hem de kemoatraktan kaynaklı invazyonu değerlendirmek bilgilendiricidir. Bu örnekte, bazal invazivite, hem üst hem de alt odacıklara serumsuz ortam veya SFM eklenerek ölçülür. Birçok potansiyel kemoatraktan içeren %10 FBS'li tam besiyeri ise kemoatraktan kaynaklı invazyonu incelemek için kullanılır.Burada, kgn hücreleri ile LP dokuz mezotelyal hücreleri arasındaki hücre invazyonunun karşılaştırılmasından elde edilen temsili sonuçlar gösterilmektedir. RTCA invazyon analizi, A CIM plakasının alt bölmesinde FBS varlığında ve yokluğunda gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, 24. saat zaman noktasındaki ve iki günlük toplam analiz süresi boyunca üç tekrarlı kuyucuklardan elde edilen ortalama pozitif eksi SD hücre indeksi olarak sunulmuştur.Bu sonuçlar, LP nine hücrelerinin hem bazal hem de kemoatraktan ile indüklenmiş koşullar altında iki gün boyunca minimal invaziv özellik gösterdiğini ve bu nedenle over kanseri hücreleri ile yapılan ko-kültür deneylerinde kullanmak için uygun bir hücre tipi olduğunu doğrulamaktadır. Buna karşılık, KG ve over kanseri steroidleri, bir kemoatraktana doğru invaze olma kapasitesi sergilemiştir. Bu grafik, iki günlük deney süresince 24 saatlik bir periyotta gösterilen K-G-N-O-V-C-A 4 29 ve OVCA 4 33 hücre hatlarının invaziv kapasitelerinin karşılaştırılmasından elde edilen sonuçları sunmaktadır.Artan hücre indekslerinin gösterdiği üzere, her üç hücre hattı da bir kemoatraktana doğru invaze olma kapasitesi sergilemiştir. Eğrilerin paralel çizgi eğimlerinden anlaşıldığı üzere, hücre hatları benzer invazyon hızları göstermiştir. Bununla birlikte, OVCA 4 29 eğrisi daha yüksek bir üst asimptot sergilemiş olup, bu durum diğer hücre hatlarına kıyasla daha yüksek bir maksimal invazyon seviyesine işaret etmiştir.Buna karşılık, tüm hücre hatlarının bazal invazyon düzeyleri düşük bulunmuştur. Ayrıca, 2,5 saatlik bir zaman dilimi boyunca invazyon verilerinin daha ayrıntılı bir analiziyle gösterildiği üzere, hücre hatları invazyonun başlama süreleri açısından farklılıklar sergilemiştir. KGN hücreleri hücre ve matriks bariyerlerini hızla aşarken, OVC 4 33 ve OVC 4 29 hücrelerinin invazyonu sırasıyla üç ve beş kat daha uzun sürmüştür.Önemli bir nokta olarak, istilanın başlangıcındaki davranışları, genel istila kapasitelerini öngörmemiştir. Bu durum, kanser hücre hatlarının farklı doğal yeteneklerine işaret ettiği gibi, steroidlerin erken ve geç evre istilacı davranışlarının farklı faktörler tarafından düzenlendiğini de gösterebilir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, peritoneal mikroçevre içinde metastatik davranışı etkileyen çeşitli sinyal molekülleri ve hücresel yolakları incelemek için kolayca uyarlanabilir.Bu, kuyucuğun alt veya üst bölmesine eksojen büyüme faktörleri, sitokinler veya inhibitörler eklenerek gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, kanser hücrelerini veya peritoneal hedef hücreleri genetik olarak manipüle edebilirsiniz.

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Burada anlatılan mezotel klirensi tayini floresan ile işaretlenmiş hücreler ve zaman atlamalı video mikroskopi görselleştirmek ve kantitatif yumurtalık kanseri çok hücreli sferoidler ve mezotel hücre tek katmanlarının etkileşimleri ölçmek için yararlanır. Bu test yumurtalık kanseri metastaz erken adımları modeller.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Bu videoda, periton boşluğunun astarının in vitro üç boyutlu bir modelinin geliştirilmesini gösteriyoruz. Bu organotipik kültür, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmaya yardımcı olabilir.

Periton Boşluğu Astarında Yumurtalık Kanseri Metastazının Modellenmesi: Periton Astarının İn Vitro 3D Modelini Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, floresan etiketli hücreler ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanarak yumurtalık kanseri sferoidlerinin mezotelyal hücrelerle etkileşimini kantitatif olarak ölçmek için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Bu in vitro test, metastaz yapan yumurtalık kanseri hücre sferoidleri ile in vivo periton boşluğunu kaplayan mezotelyal hücreler arasındaki etkileşimi modeller.

Mezotelyal Klirens Testi: Over Kanseri Sferoidlerinin Mezotelyal Hücre Tek Tabakalarına İnvazyon Yeteneğini Ölçmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Peritoneal yağ dokularının, özellikle omentumun yumurtalık kanseri kolonizasyonunu incelemek için hem in vivo hem de ex vivo yaklaşımları uygulayan bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. Ayrıca, peritoneal yağ metastazlarını teşvik eden ve sütlü lekeler olarak bilinen omentumdaki bağışıklık hücresi yapılarını ölçmek ve analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

Over kanseri metastazı, tümör yükünün doğru görsel kantitasyonunun zor olduğu çok sayıda yaygın intraperitoneal lezyon ile karakterizedir.  Burada, kırmızı floresan protein (RFP) etiketli tümör hücreleri ve optik görüntüleme kullanarak metastatik tümör yükünün in situ ve ex vivo kantitasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır.

İçi periton Yumurtalık Kanseri Metastaz kantitasyonu

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Burada, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmak için bir araç olarak, birincil insan mezotelyal hücreleri ve hücre dışı matris ile katmanlanmış fibroblastlardan oluşan periton boşluğunun astarının üç boyutlu bir in vitro modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

fizyolojik olarak ilgili model yumurtalık tümör progresyonunu incelemek için, çok hücreli küreler simüle sıvı akışı altında microdevice kültürlenmiştir. Bu dinamik 3D modeli yumurtalık kanseri metastazı meydana hücresel ve mekanik bileşenleri ile intraperitoneal ortamı benzetilmiştir.

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Keşfedin, gerçek zamanlı hücre analizörü kullanarak yumurtalık kanserinin mezotelyal tabaka istilasını sürekli ölçme yöntemini. Bu teknik, metastatik davranışı dinamik olarak değerlendirir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet