Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, metastaz asteroit mezotelyal hücre ko-kültür modelinde yumurtalık kanseri hücre istilasını gerçek zamanlı olarak hızlı bir şekilde ölçmektir. Bu, ilk olarak, hücrelerin metil selüloz içinde yapışmayan koşullar altında kültürlenmesi yoluyla hücre hatlarından yumurtalık kanseri oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, periton boşluğunun mezotelyumunun ve mezotelyal astarın kendisinin altında yatan bazal zarı taklit etmek için iki odacıklı kuyunun üst odasını matrigel ile kodlayarak gerçek zamanlı bir hücre analizörü olan CIM plakası hazırlamaktır.

Daha sonra, yumurtalık kanseri steroidleri hasat edilir ve gerçek zamanlı analizör plaka kuyucuklarının üst odalarına eklenir. Son adım, uzun bir tahlil süresi boyunca önceden tanımlanmış aralıklarla periyodik okumalar yapacak olan gerçek zamanlı hücre analizörünü programlamak ve başlatmaktır. Sonuç olarak, elde edilen sonuçlar, hücresel ve matris bariyerlerini istila ederken yumurtalık kanseri hücrelerini düzenleyen temel faktörleri belirlemek için kullanılan sürekli istila sürecini göstermektedir.

Bu tekniğin, kanser hücresi istilasının standart dünya ötesi tahlilleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yaklaşımın uzun süreler boyunca kanser hücresi istilasının sürekli ölçümlerine izin vermesidir. Yumurtalık kanseri metastazlarının dinamik doğasını tam olarak yakalayamayan tek bir son nokta testinin aksine, bu yöntem yumurtalık kanseri hakkında bilgi sağlamak için kullanılsa da, meme kanseri veya kanser hücrelerinin endotel tabakasından çekilmesi gibi farklı metastatik süreçleri incelemek için de uygulanabilir. Benzer şekilde, embriyo implantasyonu sırasında trofoblast istilası gibi normal hücre istilasını incelemek için kullanılabilir Yumurtalık kanseri hücrelerini floresan hücre etiketlemesi için hazırlamak için.

% 75 co akıcılığında ilk hasat hücreleri ve resus % 0.1 BSA başına bir mililitre ön ısıtma PBS'de mililitre başına 1 milyon hücre nihai konsantrasyonunda hücreleri askıya alın Kuyu başına en uygun miktarda steroid eklemek ve steroidi dikkatli bir şekilde kullanmak bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. Daha sonra, 10 mikromolar nihai konsantrasyonda hücrelere beş milimolar hücre izleme CSFE çözeltisinden iki mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 ila 15 dakika inkübe edin Bir su banyosunda, reaksiyonu %10 FBS içeren bir mililitre buz gibi soğuk ortamla söndürün ve santrifüjleme ile yeniden peletleyin. Reus. Floresan etiketleme seviyesi tespit için yeterli olana kadar, 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte 75 santimetre karelik filtre kapaklı bir şişe kültürüne uygun ön ısıtma büyüme ortamının 10 mililitresini ve tohum hücrelerini harcayın.

Bu prosedüre, her bir hücre hattı için uygun olan kültür ortamının hacmini ölçerek başlayın, bu da 15 mililitre eksi hücre oluşumu için gereken hücre hacmidir. % 20'lik bir nihai metil selüloz konsantrasyonu elde etmek için kültür ortamına üç mililitre metil selüloz stok çözeltisi ekleyin ve hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın. Metilselüloz içeren ortama 300.000 hücre ekleyin ve 150 mikrolitre hücre Metilselüloz ortamını 96 iyi içbükey bir alt kültür plakasının her bir oyuğuna hafifçe ters çevirerek pipetleyerek iyice karıştırın.

Bu, 37 santigrat derecede, bir ila dört gün boyunca% 5 karbondioksit veya tek tip PHE formu oluşana kadar kuyu kültürü başına toplam 3000 hücre ile sonuçlanacaktır. Tipik olarak, kuyu başına bir steroid gözlenir: gerçek zamanlı hücre analizörü veya RTCA hücre istilası testi, 16 kuyulu bir RTCA iki odacıklı CIM plakası kullanır. Bir seferde dört kuyucuktan oluşan gruplar halinde çalışarak, toplam yüzey alanının kaplandığından emin olmak için plakanın üst odasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre matris ekleyin.

Fazla sıvıdan kurtulmak için 30 mikrolitre matrisi hemen ama yavaşça çıkarın. Bir doku kültürü inkübatöründe kullanmadan önce plakayı dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Dört saat sonra, üst hazneye her bir kanser hücresi hattı için uygun olan 30 mikrolitre serumsuz, orta ve serumlu veya serumsuz 160 mikrolitre ortam ekleyin.

Alt hazneye yapılan deneysel tasarıma göre, alt hazneyi üst hazneye tıklayarak CIM plakasını monte edin ve 37 santigrat derece inkübatörde dengeleyin. Bir doku kültürü inkübatöründe bir saat boyunca RTCA programını açın ve düzen sekmesini seçin. Tüm deneysel kuyuları vurgulayın, kuyulara sağ tıklayın ve kuyuları aç'ı seçin.

Ardından deneysel koşulları doldurun ve isimleri istediğiniz gibi satın. Programa adımlar veya alt adımlar eklemek için program sekmesini seçin ve bir adım ekle'ye sağ tıklayın. İlk adım, programa otomatik olarak dahil edilen önceden programlanmış bir arka plan taramasıdır.

Bir adım ekle seçildikten sonra, LP dokuz insan mezotelyal hücre tek tabakasının kurulması sırasında okumaları kaydedecek olan RTCA programının ikinci adımı için istenen program ayrıntılarını girin. Aralık sekmesini seçip 15 dakika girerek empedans okumaları arasındaki zaman aralıklarını ekleyin. Süre sekmesini seçip 12 ile 24 saat arasında bir süre girerek deneme süresi ekleyin.

Sonraki adımlar aynı şekilde eklenir. RTCA programının üçüncü adımı, cihazı frid istilası sırasında okuma yapmaya yönlendirecektir. Aralık sekmesinin altına beş dakika ve süre sekmesinin altına 48 saat girin.

Menü çubuğunda plakayı seçin ve kaydedin. Bu prosedüre başlamak için, CIM plakasını RTCA cihazına yerleştirin ve daha önce kaydedilmiş olan programı açın. Menü çubuğunda yürüt'ü seçin ve ardından bir arka plan taraması başlat otomatik olarak gerçekleştirilecektir.

Arka plan taramasının ardından, CIM plakasını cihazdan çıkarın ve bir doku kültürü başlık plakasına yerleştirin. 50.000 LP dokuz hücre, 160 mikrolitre serum serbest ortamda her bir CIM plakasının üst odasına asılı kalır. Plakayı RTCA cihazına iyi bir şekilde yerleştirin ve LP dokuz tek tabakası ertesi gün gece boyunca kurulurken her 15 dakikada bir okuma yapın, bir mililitrelik pipet ucunun üstünden aseptik olarak bir milimetre kesin ve her hücre hattı için her bir kuyucuğun içeriğini nazikçe almak için kullanın.

Steril bir tüp santrifüjünde 10 steroid havuzu. Sekiz dakika boyunca 120 GS'de steroidler ve daha sonra hafif aspirasyon ile Metilselüloz içeren ortamı çıkarın. Her yıkamadan sonra steroidleri peletlemek için sekiz dakika boyunca 120 GS'de kullanmak için sphe'yi PBS santrifüjü ile iki kez daha yıkayın.

Her deneysel kuyu için Resus, PBS'siz 160 mikrolitre ortamda toplam 10 steroid harcar. Menü çubuğundan yürüt'ü seçip duraklat'ı işaretleyerek RTCA deneyini duraklatın. CIM plakasını cihazdan çıkarın ve bir doku kültürü başlığına yerleştirin.

Ortamı her kuyucuktan aspire edin ve steroid içeren ortamla değiştirin. Plakayı RTCA cihazına geri koyun. Menü çubuğundan yürüt'ü seçin ve iptal adımını işaretleyin.

Program otomatik olarak bir sonraki adıma geçecektir. Denemeye devam etmek için menü çubuğundan yürüt'ü seçin ve devam etmeye başla'yı işaretleyin. RTCA programındaki üçüncü adım, bu deneyde iki epitelyal yumurtalık kanseri hücre hattı OVCA 4 33 ve OVCA 4 29 ve bir yumurtalık granüloza hücreli tümör hattı başlatacaktır.

KGN, gece boyunca kültürü takiben steroid üretmek için kullanıldı ve metil selüloz içeren ortamda süspanse edilmiş U dipli sakinler kullanıldı. Her üç hücre hattı da yaklaşık 400 ila 500 mikrometre çapında kompakt steroid yapıları oluşturdu. Alt paneller, tek katmanlı bir ölçekte büyütülen eşleşen hücre çizgisini gösterir.

Çubuklar, bir kez oluştuğunda 100 mikrometreyi temsil eder. Steroidler hasat edildi ve bir R-T-C-A-C-I-M plakasında bir LP dokuz mezotelyal hücre tek tabakasının üzerine kaplandı. RTCA verilerinin yorumlanmasına yardımcı olmak için faz kontrast mikroskobu veya paralel kültürlerin floresan mikroskobu altındaki görüntüler periyodik olarak alındı.

Hem bir kanser hücre hattının bazal invazyon tabakasını hem de kemoterapi ile indüklenen invazyonu değerlendirmek bilgilendiricidir. Bu örnekte, bazal invazivlik, hem üst hem de alt odalara serum serbest ortam veya SFM eklenmesiyle ölçülür. Kemoterapi cezbedici invazyonu incelemek için birçok potansiyel kemoterapi cezbedici içeren %10 FBS'li komple besiyeri kullanılır.

Burada, kgn hücreleri ile LP dokuz mezotelyal hücreler arasındaki hücre istilasının karşılaştırılmasından elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. RTCA invazyon testi, A CIM plakasının alt odasında FBS ile ve FBS olmadan gerçekleştirildi. Sonuçlar, 24 saatlik zaman noktasında ve iki günlük bir tahlil periyodu boyunca üçlü kuyucuklardan ortalama pozitif eksi SD hücre indeksi olarak gösterilir.

Bu sonuçlar, LP dokuz hücrelerinin, bazal veya kemoatraktan kaynaklı koşullar altında iki gün boyunca minimal invaziv olduğunu ve bu nedenle yumurtalık kanseri hücreleri ile ko-kültür tahlillerinde kullanmak için iyi bir hücre tipi olduğunu doğrulamaktadır. Buna karşılık, KG ve yumurtalık kanseri steroidleri, bir kemoterapi cezbediciye doğru istila etme kapasitesi sergiledi. Bu grafik, iki günlük test boyunca 24 saatlik bir süre boyunca gösterilen K-G-N-O-V-C-A 4 29 ve OVCA 4 33 hücre hatlarının invaziv kapasitesinin karşılaştırılmasından elde edilen sonuçları sunar.

Her üç hücre dizisi de, artan hücre indeksleri tarafından gösterildiği gibi bir kemoterapi cezbediciye doğru istila etme kapasitesi sergiledi. Hücre çizgileri, eğrilerin paralel çizgi eğimleri ile gösterilene benzer istila oranları sergiledi. Bununla birlikte, OVCA 4 29 eğrisi, diğer hücre hatlarına kıyasla daha yüksek bir maksimum invazyon seviyesini gösteren daha yüksek bir üst asim kutusu sergiler.

Buna karşılık, tüm hücre hatlarının bazal invazyon seviyeleri düşüktü. Ayrıca, hücre hatları, 2,5 saatlik bir süre boyunca istila verilerinin daha ayrıntılı bir analiziyle gösterildiği gibi, istila başlangıcına kadar olan sürelerinde farklılıklar sergiledi. KGN hücreleri hücre ve matris bariyerlerini hızlı bir şekilde istila ederken, OVC 4 33 ve OVC 4 29 hücrelerinin istila etmesi sırasıyla üç ve beş kat daha uzun sürer.

Daha da önemlisi, istilanın başlangıcındaki davranışları, genel istila kapasitelerinin habercisi değildi. Bu, kanser hücre hatlarının farklı doğal yeteneklerini gösterir, ancak aynı zamanda farklı faktörlerin steroidlerin erken ve geç invaziv davranışlarını düzenlediğini de gösterebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, metastatik davranışı etkileyen peritoneal mikro çevre içindeki çeşitli sinyal moleküllerini ve hücresel yolları incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Bu, kuyunun alt veya üst odasına ekzojen büyüme faktörleri, sitokinler veya inhibitörlerin eklenmesiyle elde edilebilir. Alternatif olarak, kanser hücrelerinin kendilerini veya peritoneal hedef hücreleri genetik olarak manipüle edebilirsiniz.