Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerde heterolog olarak eksprese edilen bir taşıyıcı aracılığıyla glutamin transportunu, floresan rezonans enerji transferi veya FRET sensörleri kullanarak görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle COS-7 hücrelerinin bir glutamin sensörü ve bir taşıyıcı ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Sensör, bakteriyel bir glutamin bağlama proteinine yerleştirilmiş bir FRET donörü ve glutamin bağlama proteininin C terminusünde bulunan bir FRET akseptöründen oluşur.

İkinci adım, bir perfüzyon sistemi kurmak ve hücreleri ters floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak görüntülemektir. Son adım ise görüntüleri analiz etmek ve glutamin dinamiklerini görselleştirmektir. Nihayetinde, tek bir hücredeki taşıyıcı aktiviteleri bu FRET sensörleri kullanılarak tespit edilebilir.

Bu tekniğin kromatografi tabanlı ölçüm gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha yüksek uzamsal temporal çözünürlük sağlamasıdır. Bu teknik; hücrelerin sensör proteinleri ile transfeksiyonu, gerçek zamanlı görüntüleme ve deney sonrası analiz maliyeti olmak üzere üç bölümden oluşur. Düşük endojen glutamin taşıma aktiviteleri nedeniyle bu deneyde yedi hücre kullanılmıştır.

Hücreleri, %10 kozmik buzağı serumu (CCS) ve mililitre başına 100 ünite penisilin streptomisin içeren DMEM içerisinde, sekiz kuyucuklu cam tabanlı bir kaba yaklaşık %70 ila %80 yoğunlukta ekleyin. 37 °C, %5 CO2 ve %100 nem koşullarında 24 saat boyunca inkübe edin.

24 saat sonra. Büyütme besiyerini, antibiyotik içermeyen %10 CCS katkılı DMEM ile değiştirin ve transfeksiyon gününe kadar 37 °C, %5 CO2 ve %100 nem koşullarında gece boyunca büyütün. Glutamin sensörünü kodlayan plazmid DNA'sından ve işaretli zorunlu amino asit değiştiricisi m cherry A SCT'den 0,4 µg'luk miktarları 50 µL serumsuz besiyerine ekleyin.

50 µL serumsuz besiyerine bir µL transfeksiyon reaktifi ekleyin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, DNA içeren çözeltiyi seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, transfeksiyon reaktifi karışımını cost seven hücrelerinin üzerine nazikçe ekleyin ve hazneyi sallayarak yavaşça karıştırın.

37 °C, %5 CO2 ve %100 nem koşullarında 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra besiyerini %10 CCS ve 100 ünite penisilin streptomisin eklenmiş DMEM ile değiştirin. Perfüzyona başlamadan önce hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.

Eşlik eden makaledeki tarifleri takip ederek A'dan F'ye kadar perfüzyon tamponlarını hazırlayın. Muslukları 50 mililitrelik şırıngalara takın. Muslukları kapatın ve şırıngaları perfüzyon çözeltileriyle doldurun.

Musluktaki boşluk hacmini tamponla doldurmak için musluğu kısa bir süreliğine açın. Ardından, sekiz kanallı yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemini bir perfüzyon kalemi ile çalıştırın ve manuel modu seçin.

Seçim fonksiyonu seçeneği altında. Perfüzyon kaleminin altına bir atık kabı yerleştirin. Bu deneyin başarısı için, perfüzyonun sürüklenmeyi ve çözelti taşınmasını en aza indirecek şekilde kurulması önemlidir.

İlgili numaralara basarak portları manuel olarak aktif hale getirin ve tüpleri suyla doldurun. 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak portları kapatın, A'dan F'ye kadar olan tampon çözeltileri içeren şırıngaları perfüzyon sisteminin bir ile altı arasındaki portlarına yerleştirin ve muslukları açın. Bundan sonra.

Tüplerdeki suyu tampon çözeltilerle değiştirmek için portları tekrar açın. Akış hızı dakika başına yaklaşık 0,8 mililitre olmalıdır. Fonksiyon seçme menüsüne geri dönmek için perfüzyon kontrol cihazındaki iptal düğmesine bir kez basın.

Düzenleme programı seçeneğine geçin, ardından bu tabloda belirtilen perfüzyon protokolünü yazın. Perfüzyon programını kaydedin. Hücrelerin görüntülemesi, transfeksiyon sonrası 48 ila 72 saat arasında yapılır.

Hücrelerin yıkanıp gitmemesine dikkat ederek, cam tabanlı kabın kuyucuklarını perfüzyon tamponu A ile iki kez yıkayın. Cam tabanlı kabı floresan mikroskobun tablasına yerleştirin. Perfüzyon sistemini hazneye bağlayın.

Açık bir hazne kullanılıyorsa, perforasyon solüsyonunu hazneden uzaklaştıran başka bir pompa kurun. Slayt kitapçığı görüntüleme yazılımını açın. Odaklama işlevini kullanarak yeni bir slayt başlatın; uygun filtre setleri kullanarak sensörü ve A SCT two M cherry'yi ko-eksprese eden hücreleri bulun.

Kamera sekmesine tıklayıp kazanç (gain) altındaki kaydırma çubuğunu hareket ettirerek kazancı ayarlayın. Ayrıca, nötr yoğunluk filtresi açılır menüsünden nötr yoğunluk filtresi ayarını düzenleyin. Görüntü yakalama (image capture) seçeneğine tıklayın ve ardından edinim penceresinde kullanılacak filtreleri belirleyin.

Görüntüler üç kanaldan elde edilecektir. Donör uyarımı, donör emisyonu; akseptör uyarımı, akseptör emisyonu. Filtre ayarlarının yanındaki kutucuğa istenen pozlama süresini yazıp test düğmesine tıklayarak pozlama süresini ayarlayın; her üç kanalın da aynı süre boyunca pozlanması gerekir.

Bölgeler aracını kullanarak bir ilgi alanı çizin. Yakalama türü kutusundan time-lapse seçeneğini belirleyin. Ardından deney için aralığı ve zaman noktalarını tanımlayın.

Ardından, arka plan çıkarma işlemi için kullanılmak üzere, floresan hücrelerin bulunmadığı bir alanda bir bölge çizin. Çizilen bölgeye sağ tıklayın ve ardından burayı arka plan olarak ayarlayın. Kamera tarafından algılanan hem otofloresansı hem de arka plan floresansını hesaba katmak için, ideal olarak sensörleri eksprese etmeyen hücreler arka plan bölgesi olarak kullanılmalıdır.

Select function run programs seçeneği altından istenen programı seçin, kayıtlı programa geçiş yapın ve ardından perfüzyon kontrol cihazında enter tuşuna basın. Program artık yüklenmiştir; perfüzyonun ve görüntüleme deneyinin aynı anda başlamasını sağlamak için herhangi bir tuşa basmak perfüzyonu başlatacaktır. Perfüzyon kontrol cihazında bir tuşa bastığınız anda yakalama penceresindeki başlat düğmesine tıklayın.

Burada, 8 mM ve 100 µM afinitelere sahip asCT2 taşıyıcısı ve FRET glutamin sensörlerini ko-eksprese eden hücreler kullanılarak gerçekleştirilen tipik zaman seyri deneyleri gösterilmektedir. Glutamin girişi, donör mTFP1 ile akseptör Venus arasındaki floresans yoğunluk oranlarındaki değişim olarak tespit edilir. Alanin varlığında glutamin girişi, substrat etkisiyle birlikte gösterilmiştir.

Taşıyıcıların özgünlükleri de sensörler kullanılarak incelenebilir. Burada, hücreler önceden glutamin ile yüklenmiş ve ardından hücre dışı perfüzôna çeşitli amino asitler eklenmiştir. Beklendiği üzere, sekiz adet substrat glutamin akışını tetiklerken, substrat olmayan amino asitler tetiklememiştir.

Bir substrat eklendiğinde FRET verimliliğinde herhangi bir değişiklik olmaması, sekiz milimolar sensörü veya 100 mikromolar sensörü eksprese eden hücrelerde görüldüğü gibi, test edilen substrat için düşük alınım kapasitesi gibi birkaç nedene bağlı olabilir. Ancak, FRET verimliliğindeki değişimin diğer parametrelerdeki değişimlerden değil, substrattaki gerçek değişimden kaynaklandığını doğrulamak için sCT2 taşıyıcısını eksprese etmeyen hücreler de kullanılır. Aynı perfüzyon protokolü, deneysel koşullar altında doygunluğa ulaşması beklenen bir sensörü eksprese eden hücreler kullanılarak gerçekleştirilir.

Bu örnekte, sensörün afinitesi 1.5 micromolar'dır. Bu videoyu izledikten sonra, fret sensörleri kullanarak metabolitlerin dinamiklerinin nasıl görüntülendiği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Maruz kalma riskini en aza indirmek için hücre kültürünün standart çalışma prosedürlerine uygun olarak işlenmesi gerektiğini unutmayın.