Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, birinci rezonans enerji transferi veya fret sensörleri kullanılarak canlı hücrelerde heterolog eksprese edilen bir taşıyıcı aracılığıyla glutamin taşınmasını görüntülemektir. Bu, ilk önce bir glutamin sensörü ve bir taşıyıcı ile yedi hücrenin kesilmesiyle gerçekleştirilir. Sensör, bir bakteriyel glutamin bağlayıcı proteine yerleştirilmiş bir fret vericiden ve glutamin bağlayıcı proteinin C terminalinde bir fret alıcıdan oluşur.

İkinci adım, bir perfüzyon sistemi kurmak ve hücreleri ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak görüntülemektir. Son adım, görüntüleri analiz etmek ve glutamin dinamiklerini görselleştirmektir. Sonuç olarak, tek bir hücredeki taşıyıcı aktiviteler bu fret sensörleri kullanılarak tespit edilebilir.

Bu tekniğin kromatografi tabanlı ölçüm gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çok daha yüksek uzamsal zamansal çözünürlük elde etmenizdir. Bu teknik, hücrelerin sensör proteinleri ile transfeksiyonu, gerçek zamanlı görüntüleme ve deney sonrası analiz maliyeti olmak üzere üç bölümden oluşur. Düşük endojen glutamin taşıma aktivitesi nedeniyle bu deneyde yedi hücre kullanılmıştır.

Hücreleri DMEM'de yaklaşık% 70 ila 80 co akıcılığı ve% 10 kozmik buzağı serumu veya CCS ve mililitre başına 100 birim ile tohumlayın. Penisilin streptomisin sekiz kuyulu cam tabanlı bir tabakta. 24 saat boyunca 37 santigrat derece,% 5 CO2,% 100 nemde inkübe edin.

24 saat sonra. Büyüme ortamını DMEM artı antibiyotiksiz% 10 CCS ile değiştirin, transfeksiyon gününde 37 santigrat derece,% 5 CO2,% 100 nemde gece boyunca büyür. Glutamin sensörünü ve etiketli zorunlu amino asit değiştirici m kiraz A'yı kodlayan plazma DNA'sının her birine 0.4 mikrogram ekleyin, iki ila 50 mikrolitre serum içermeyen ortam.

50 mikrolitre serumsuz ortama bir mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin, hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, DNA'yı içeren çözeltiyi seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, transfeksiyon reaktif karışımını maliyet yedi hücrenin üzerine yavaşça ekleyin ve hazneyi sallayarak hafifçe karıştırın.

24 saat sonra 37 santigrat derece, %5 CO2 ve %100 nemde 24 saat inkübe edin. Ortamı DMEM artı% 10 CCS artı 100 ünite penisilin streptomisin ile değiştirin. Perfüzyona başlamadan önce hücreleri inkübatöre geri koyun.

Ekteki el yazmasındaki tarifleri izleyerek A'dan F'ye kadar perfüzyon tamponları hazırlayın. Stop Cox'u 50 mililitrelik şırıngalara takın. Durdurma musluklarını kapatın ve şırıngaları perfüzyon solüsyonlarıyla doldurun.

Durdurma musluğundaki üst boşluğu tamponla doldurmak için durdurma musluğunu kısa bir süre için açın. Daha sonra sekiz kanallı yerçekimini açın. Perfüzyon sistemini bir perfüzyon kalemi ile besleyin ve manuel modu seçin.

İşlev seç seçeneğinin altında. Perfüzyon kaleminin altına bir atık kabı yerleştirin. Bu deneyin başarısı için, perfüzyonun, sürüklenmeyi ve çözelti taşınmasını en aza indirecek şekilde ayarlanması önemlidir.

İlgili numaralara basarak portları manuel olarak etkinleştirin ve boruları suyla doldurun. 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, portları kapatın, A'dan F'ye kadar tamponlar içeren şırıngaları perfüzyon sisteminin bir ila altı portuna yerleştirin ve durdurma musluklarını açın. Ondan sonra.

Borudaki suyu tamponlarla değiştirmek için bağlantı noktalarını tekrar açın. Akış hızı dakikada yaklaşık 0,8 mililitre olmalıdır. Seçim işlevi menüsüne geri dönmek için perfüzyon kontrol cihazında bir kez iptal düğmesine basın.

Programı düzenle seçeneğine geçin, ardından bu tabloda belirtilen perfüzyon protokolünü yazın. Perfüzyon programını kaydedin. Hücreler, transfeksiyondan 48 ila 72 saat sonra görüntülenir.

Cam alt tabağın kuyularını, hücreleri yıkamamaya dikkat ederek perfüzyon tamponu A ile iki kez yıkayın. Cam alt çanağı floresan mikroskobun sahnesine yerleştirin. Perfüzyon sistemini hazneye bağlayın.

Açık bir hazne kullanılıyorsa, perfüzyon solüsyonunu hazneden çıkaran başka bir pompa kurun. Slayt defteri görüntüleme yazılımını açın. Odak fonksiyonunu kullanarak yeni bir slayt başlatın, sensörü ifade eden koex hücreleri bulun ve uygun filtre setlerini kullanarak A SCT iki M kiraz.

Kamera sekmesine tıklayarak ve kazanç altındaki kaydırma çubuğunu kaydırarak kazancı ayarlayın. Ayrıca, nötr yoğunluk filtresi açılır menüsünden nötr yoğunluk filtresi ayarını yapın. Görüntü yakalama'yı tıklatın ve ardından alma penceresinde kullanılacak filtreleri belirtin.

Görüntüler üç kanalda elde edilecektir. Donör uyarma, donör emisyon donör uyarması, kabul misyonu ve alıcı uyarma kabul misyonu. Filtre ayarlarının yanındaki kutuya istediğiniz pozlama süresini yazarak pozlama süresini ayarlamak için test düğmesine tıklayın, üç kanalın da aynı süre boyunca pozlanması gerekir.

Bölgeler aracını kullanarak ilgilendiğiniz bir bölge çizin. Yakalama türü kutusunda zaman atlamalı'yı seçin. Ardından, deneme için aralığı ve zaman noktalarını belirtin.

Ardından, arka plan çıkarma işlemi için kullanılacak herhangi bir floresan hücresi olmayan bir alanda bir bölge çizin. Çizilen bölgeye sağ tıklayın ve ardından arka plan olarak ayarlayın. İdeal olarak, sensörleri ifade etmeyen hücreler, kamera tarafından algılanan hem otofloresan hem de arka plan floresansını hesaba katmak için arka plan bölgesi olarak kullanılmalıdır.

İşlev çalıştırma programları seçeneği altında istediğiniz programı seçin, kaydedilen programa geçin ve ardından perfüzyon denetleyicisinde enter tuşuna basın. Program şimdi yüklenmiştir ve herhangi bir tuşa basıldığında hem perfüzyonun hem de görüntüleme deneyinin aynı anda başlamasını sağlamak için perfüzyon başlayacaktır. Perfüzyon denetleyicisindeki bir tuşa basarken aynı anda yakalama penceresindeki başlat düğmesine tıklayın.

Burada, sekiz milimolar ve 100 mikromolar afiniteye sahip a, s, CT, iki taşıyıcı ve fret glutamin sensörlerini eksprese eden hücrelerin koeks kullanıldığı tipik zaman seyri deneyleri gösterilmiştir. Glutamin akışı, donör mtfp ile alıcı Venüs arasındaki floresan yoğunluk oranlarındaki değişiklik olarak tespit edilir. Alanin varlığında glutamin akışı da substrat olarak gösterilmiştir.

Taşıyıcıların özellikleri de sensörler kullanılarak incelenebilir. Burada, hücreler glutamin ile önceden yüklendi ve daha sonra hücre dışı perfüze çeşitli amino asitler eklendi. Beklendiği gibi sekiz ct iki substrat glutamin flx'i indüklerken, substrat olmayan amino asitler indüklemedi.

Bir substratın eklenmesi üzerine fret verimliliği değişikliklerinin olmaması, sekiz milimolar sensörü veya 100 mikromolar sensörü ifade eden hücrelerde gösterildiği gibi test edilen substrat için düşük alım kapasitesi gibi çeşitli nedenlerden kaynaklanabilir. Ancak bu, fret verimliliği değişikliğinin diğer parametrelerdeki değişiklikten değil, alt tabakadaki gerçek değişiklikten kaynaklandığını doğrulamak için a s CT iki taşıyıcıyı ifade etmez. Aynı perfüzyon protokolü, deney koşulu altında doymuş olması beklenen bir sensörü ifade eden hücreler kullanılarak gerçekleştirilir.

Ve bu örnek, sensörün afinitesi 1.5 mikromolar'dır. Bu videoyu izledikten sonra, fret sensörlerini kullanarak metabolitlerin dinamiklerini nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Maruz kalma riskinin en aza indirilmesi için hücre kültürünün standart çalışma prosedürlerini takiben uygun şekilde tedavi edilmesi gerektiğini unutmayın.